郭潤民+劉暢+吳子君+姜佳美+吳斌+莫海亮+黃瑞娜+何松堅(jiān)+李騰+閆海+李上海+游瓊+吳鏗

[摘要]目的篩選糖尿病心肌病患者血清差異表達(dá)的microRNA（miRNA），明確miR-186-5p和miR-516a-5p在DCM發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制。方法選擇30例DCM患者為實(shí)驗(yàn)組，60例年齡相當(dāng)?shù)纳眢w健康者為正常對照組，分別從兩組隨機(jī)選取3例作為研究對象行microRNA芯片初篩差異表達(dá)miRNA，然后熒光定量qPCR驗(yàn)證這些miRNA的差異表達(dá)；在高糖誘導(dǎo)人AC16心肌細(xì)胞損傷模型中，miR-186-5p和miR-516-5p的mimics和inhibitors分別干預(yù)，觀察對高糖引起的心肌細(xì)胞毒性的影響。結(jié)果microRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌病患者血清有51個差異表達(dá)的miRNA，經(jīng)熒光定量qPCR驗(yàn)證為miR-186-5p、miR-516a-5p等8個差異表達(dá)miRNA；顯著高表達(dá)的miR-516-5p和明顯低表達(dá)的miR-186-5p介導(dǎo)了高糖所致心肌細(xì)胞毒性損傷。結(jié)論糖尿病心肌病患者血清miRNA表達(dá)譜發(fā)生改變，有8個差異表達(dá)miRNA，miR-516a-5p和miR-186-5p可能參與糖尿病心肌病的心肌損傷發(fā)病過程。

[關(guān)鍵詞]microRNA；糖尿病；糖尿病心肌??；心肌損傷

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是獨(dú)立于高血壓、冠心病及心臟瓣膜病變的一種糖尿病心臟并發(fā)癥，與糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)生率及高病死率密切相關(guān)，越來越受到重視。糖毒性、脂毒性、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、心肌細(xì)胞凋亡、炎癥等眾多因素與DCM心肌損傷密切相關(guān)，其中心肌細(xì)胞凋亡與炎癥是DCM的主要發(fā)病機(jī)制之一，然而具體分子機(jī)制尚不清楚。

MicroRNA（miRNA）是22-24nt的一種非編碼RNA，能通過堿基配對的方式特異性結(jié)合目的mRNA 3非編碼區(qū)域負(fù)性調(diào)控其表達(dá)，在細(xì)胞分化、增殖、代謝、細(xì)胞凋亡和遷移等生物學(xué)活動中發(fā)揮一定作用。新近研究表明：MicroRNA在心臟纖維化、心律失常、心肌缺血、心衰等心臟疾病中具有重要作用；體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究提示，MicroRNA表達(dá)異?？赡茉谔悄虿⌒募〔“l(fā)病機(jī)制中起到重要作用。

因此，為了深入闡明DCM心肌損傷的發(fā)病機(jī)理，為了明確MicroRNA在DCM心肌損傷中的具體作用與機(jī)制，本研究擬采用microRNA芯片篩選DCM患者血清差異表達(dá)miRNA，并且熒光定量qPCR驗(yàn)證之；在高糖誘導(dǎo)人ACl6心肌細(xì)胞損傷模型中，使用miRNA的mimics和inhibitors分別干預(yù)，觀察對高糖引起的心肌細(xì)胞毒性的影響。

1材料與方法

1.1材料

D-葡萄糖購自美國Sigma-Aldrich公司。胎牛血清（GIBICO），DMEM培養(yǎng)基（Hyclone），青鏈霉素（Hyclone），胰酶（Hyclone），PBS磷酸鉀緩沖液（Hyclone）。miR-186-5p inhibitor、miR-186-5pmimics、miR-516a-5p inhibitor、miR-516a-5p mimics（廣州銳博生物科技有限公司），miRcnte miRNA提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcnte miRNA熒光定量檢測試劑盒（TIANGEN），Lipofectamine

3000 Transfection Reagent（Invitrogen公司），Opti-MEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司），CCK-8（碧云天），30%丙烯酰胺混合溶液（碧云天）。人microRNA芯片版本為agilent V19。

1.2方法

1.2.1納入研究的DCM患者一般資料與血液樣本采集選擇2012年6月～2015年7月期間在廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科住院的糖尿病心肌病患者30例，健康組60例。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照以往文獻(xiàn)報道，具體如下：（1）確診糖尿病病程5年以上；（2）心臟擴(kuò)大、心力衰竭、心絞痛或心律失常存在；（3）無冠狀動脈大小血管和微血管病變；（4）無其他原因的心肌病和心臟病。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）急性腦梗死患者；（2）自身免疫性疾病；（3）使用激素或免疫抑制劑者；（4）發(fā)病前2周有炎癥、感染性疾?。唬?）依從性差不能完成相關(guān)指標(biāo)測定的患者。本研究經(jīng)廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會審核通過，參與本研究的所有患者均簽署了知情同意書。采集DCM患者外周靜脈血10mL，將其置于不含抗凝劑的收集管中，室溫靜置30min后，4000r/min離心20min，離心留取上清低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2人MicroRNA芯片篩查與qPCR驗(yàn)證采用人microRNA芯片（agilent V19）篩查DCM患者和健康對照各3例血清microRNA表達(dá)差異；采用TIANGEN公司miRNA的分離提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒和熒光定量檢測試劑盒行qPCR驗(yàn)證DCM患者血清與高糖處理心肌細(xì)胞差異表達(dá)microRNA。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)干預(yù)人ACl6心肌細(xì)胞購自ATCC，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于5%C02、37℃的溫箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為兩組：對照組，高糖組（35mmol/L葡萄糖作用24h或48h）。細(xì)胞株傳代96孔板上，待其融合度約為50%～70%時，采用Lipofectamine 3000 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染miRNA mimics或inhibitor，于培養(yǎng)箱中孵育4h后更換培養(yǎng)基，24h后進(jìn)行microRNA的檢測。

1.2.4人AC16心肌細(xì)胞存活率的測定人AC16心肌細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔的約80%面積時，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行不同的處理，每個處理因素設(shè)3個復(fù)孔。終止培養(yǎng)后，每孔加入100μL CCK-8工作液，輕搖，37℃孵育2h，用Muhiskan MK3酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific Inc，USA）（入=450mm）記錄各孔的吸光度（OD）。取3孔OD值的平均數(shù)，按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=處理組OD/對照組ODx100%，重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析用SPSS15.0軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），用LSD-t進(jìn)行均數(shù)之間的比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MicroRNA芯片篩查DCM患者血清差異表達(dá)miRNA

為了探明糖尿病心肌病患者血清差異表達(dá)microRNA，首先使用microRNA芯片（agilent V19）篩選出了DCM患者血清51種差異表達(dá)microRNA（n=3），發(fā)現(xiàn)miR-516a-5p、hsa-miR-575和hsa-miR-630等明顯升高，hsa-miR-144-3p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-22-3p和hsa-miR-30d-5p等顯著降低。與健康對照組比較，P<0.05，fold change為差異倍數(shù)。見圖1。

2.2熒光定量qRT-PCR驗(yàn)證DCM患者血清差異表達(dá)miRNA

為了驗(yàn)證microRNA芯片篩選結(jié)果，采用熒光定量qRT-PCR測定30例DCM患者和60例健康對照血清與高糖處理的ACl6心肌細(xì)胞microRNA表達(dá)，結(jié)果均顯示：8種microRNA表達(dá)水平變化顯著，hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-1 86-5p、hsa-miR-22-3p和hsa-miR-30d-5p下降明顯（P<0.05），hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-575和hsa-miR-630增加顯著（P<0.05），其中hsa-miR-186-5p下調(diào)和hsa-miR-516a-5p增加最為顯著。見圖2。（A和B）通過qRT-PCR檢測DCM患者（n=30）和正常人（n=60）血清中miR-516a-5p的表達(dá)水平。（C和D）通過qRT-PCR檢測分析不同處理的AC16細(xì)胞中miR-516a-5p的表達(dá)水平。與對照組相比（"P<0.05）。

2.3 miR-516a-5p和miR.m186-5p在高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中的作用

為了探究差異表達(dá)曲microRNA尤其是miR-516a-5p和miR-186-5p在DCM心肌損傷中的作用，分別采用miR-516a-5p和miR-186-5p的mimics和inhibitors干預(yù)，觀察對高糖處理的AC16心肌細(xì)胞損傷的影響。使用CCK-8測定AC16心肌細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示：miR-516a-5p的inhibitors和miR-186-5p的mimics能抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，另一方面，miR-516a-5p的mimics和miR-186-5p的inhibitors卻能促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。提示了表達(dá)失調(diào)的microRNA尤其是表達(dá)上調(diào)的miR-516a-5p和表達(dá)下調(diào)的miR-186-5p介導(dǎo)了DCM心肌損傷的發(fā)病過程。見圖3。

3討論

糖尿病心肌病是由糖尿病引起的心臟微血管病變以及心肌代謝紊亂所致的心肌細(xì)胞死亡，通常表現(xiàn)為心肌收縮和舒張功能下降甚至心力衰竭，獨(dú)立于高血壓、冠心病及心臟瓣膜病變等的主要心臟并發(fā)癥之一。近年來，糖尿病的發(fā)病率逐年升高，DCM發(fā)病率和危害性極高，是糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)生率及高病死率的主要病因，引起全世界的廣泛關(guān)注。許多研究表明：糖毒性、脂毒性、氧化應(yīng)激、線粒體受損、心肌細(xì)胞凋亡、炎癥等是DCM的發(fā)病因素，但是確切的分子機(jī)制不詳。

MicroRNA（miRNA）是一種長度大約22-24nt的非編碼RNA，已發(fā)現(xiàn)大約2500多種人類miRNA，這些miRNA至少調(diào)控30%以上的基因，在細(xì)胞分化、增殖、代謝、細(xì)胞凋亡、遷移和壞死等生物過程中發(fā)揮重要作用。最近的研究表明，microRNA在各種心臟疾病，包括心臟纖維化、心肌肥厚、心律失常、心肌缺血、心衰中發(fā)揮重要的作用。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，microRNA表達(dá)異常在糖尿病心肌病心肌損傷中可能起重要作用。因此，明確DCM患者差異表達(dá)microRNA及其作用機(jī)制，對于DCM的發(fā)病機(jī)制、早期診斷和防治有重要意義。

本研究microRNA芯片的結(jié)果顯示：在DCM患者血清中有多種miRNA不同程度的上調(diào)或下調(diào)，8種microRNA表達(dá)水平變化顯著，hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-22-3p和hsa-miR-30d-5p下降明顯，hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-575和hsa-miR-630增加顯著，其中hsa-miR-186-5p上調(diào)和hsa-miR-516a-5p下降最為顯著。本研究及其他學(xué)者的研究均證實(shí)，表達(dá)失調(diào)的miRNA在糖尿病患者心血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。此外，表達(dá)異常的miRNA在高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中同樣有重要作用。

為了明確這些表達(dá)顯著異常的miRNA（尤其是hsa-miR-186-5p和hsa-miR-516a-5p）在DCM心肌損傷中的具體作用與機(jī)制，本研究采用33raMD-glucose處理人ACl6心肌細(xì)胞48 h模擬機(jī)體心臟糖毒性，進(jìn)而分別使用miR-186-5p和miR-516a-5p inhibitor和mimics預(yù)處理，觀察對高糖環(huán)境對心肌細(xì)胞存活率的影響。研究結(jié)果顯示：與體內(nèi)miRNA芯片和qPCR驗(yàn)證結(jié)果類似的是，33mMD-glucose處理48h后，人AC16心肌細(xì)胞miR-186-5p水平也顯著下降、miR-516a-5p表達(dá)水平明顯增加；應(yīng)用各自的inhibitor和mimics預(yù)處理后，miR-5 16a-5p的mimics、miR-186-5p的inhibitor的能促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，miR-186-5p的mimics、miR-516a-5p的inhibitor的能抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。這些研究結(jié)果提示：上調(diào)的miR-186-5p和下調(diào)的miR-516a-5p介導(dǎo)了DCM心肌損傷，進(jìn)一步驗(yàn)證了表達(dá)異常的miRNA在DCM心肌細(xì)胞損傷中有重要作用。

綜上所述，DCM患者血清中至少有8種microRNA表達(dá)水平變化顯著，其中hsa-miR-186-5p上調(diào)和hsa-miR-516a-5p下降最為明顯，差異表達(dá)的miRNA（尤其是hsa-miR-186-5p和hsa-miR-516a-5p）在DCM心肌損傷中有重要作用。單獨(dú)或者聯(lián)合篩查這些差異表達(dá)的miRNA在早期診斷和防治DCM中的作用有待深入研究。