王雅光+閻麗菁+田鶴

[摘要]目的探討水通道蛋白-7（aquaporin-7，AQP-7）在小鼠腎集合管發(fā)生發(fā)育過程中的表達(dá)和作用。方法采用免疫組化結(jié)合體視學(xué)測量和免疫印跡技術(shù)，測定胚齡（E）16、18d胎鼠及生后（P）1、3、5、7、14、21、42、70d仔鼠腎集合管中AQP-7的表達(dá)及含量變化。結(jié)果通過體視學(xué)測量和免疫印跡技術(shù)結(jié)果顯示：AQP-7在胚齡16d的小鼠腎集合管開始弱表達(dá)，到生后21d達(dá)到高峰，之后隨著日齡的增加，表達(dá)無明顯變化。結(jié)論AQP-7主要表達(dá)在發(fā)育中小鼠腎集合管中，可能和腎集合管的發(fā)育和成熟相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]水通道蛋白-7；腎；集合管；小鼠；發(fā)育

水通道蛋白-7（aquaporin-7，AQP-7，也叫AQPap），AQP-7是從脂肪組織中分離鑒定出的一種水孔蛋白基因，其蛋白質(zhì)是水通道蛋白家族中的一個(gè)成員。水通道蛋白普遍存在于微生物、植物、及動(dòng)物界。AQP-7在腎臟中的表達(dá)水平較高，屬于甘油水通道蛋白，同時(shí)對(duì)腎臟中水份的重吸收和尿液的濃縮都起著重要作用。有大量的研究表明，甘油水通道蛋白在允許水分子通過的同時(shí)也可以允許一些其它的中性溶質(zhì)通過。甘油水通道蛋白在多種組織中都有重要的生理功能；例如在脂肪組織，上皮組織中，特別是在細(xì)胞受損的快速增殖期能為其提供能量，而器官的發(fā)生發(fā)育也是細(xì)胞快速增值的過程。關(guān)于水通道蛋白在腎臟中發(fā)生發(fā)育的文獻(xiàn)報(bào)道有很多，其中與AQP-7屬于同一亞家族的AQP-3在腎臟集合管表達(dá)的文獻(xiàn)也很常見。基于這些，我們?cè)囅階QP-7也可能在腎臟集合管的發(fā)生發(fā)育中起到一定的作用。本研究采用免疫組織化學(xué)和免疫印跡的技術(shù)探討AQP-7在腎臟集合管的發(fā)育中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料

2015年3月～10月期間由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康2月齡昆明小鼠（雌雄比例1：1），體重25g，隨機(jī)合籠。觀察到陰道栓脫落的最早時(shí)間計(jì)為胚齡（embryonic days，E）0d。觀察到仔鼠出生的最早時(shí)間計(jì)為生后（postnatal，P）Od。孕鼠分為10組，每組3只，每只孕鼠取2只胎鼠或仔鼠。分別取胚齡16、18d胎鼠和生后1、3、5、7、14、21、42、70d仔鼠各6只，共60只。兔抗小鼠AQP-7多克隆抗體購自Santa公司；SABC免疫組化試劑盒購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司；膜蛋白提取試劑盒、Polyvinylidene Fluoride膜、SodiumDodecyl Sulfate等免疫印跡試劑均購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1腎臟標(biāo)本制備用100g/L水合氯醛將麻醉后，立即剖開孕鼠腹腔將胎鼠取出，E16、18d胎鼠取左腎全腎固定。仔鼠斷頭處死后，從腹后壁取左腎，沿橫軸將腎切成約3mm薄片，放人40g/L多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，香柏油透明，石蠟定向包埋，做連續(xù)切片，厚度5μm。右腎均入冰丙酮迅速冷凍，-80℃保存，供免疫印跡使用。

1.2.2體視學(xué)測量

以免疫組化染色切片進(jìn)行體視學(xué)測量，每組選5張切片，每張切片按“s”形在油鏡下選取5個(gè)視野，應(yīng)用方格測試系統(tǒng)，交點(diǎn)計(jì)數(shù)法測算集合管陽性反應(yīng)表達(dá)的面密度值，其公式為：Sv=21x/Lc（Lc=∑Pc·a），式中Ix是陽性表達(dá)的胞膜與測試方格系統(tǒng)的交點(diǎn)數(shù)，Pc是測試系統(tǒng)落在參照系（集合管）的點(diǎn)數(shù)，a代表方格兩點(diǎn)間距離，實(shí)際長度相當(dāng)于0.1mm。

1.2.3免疫印跡檢測取各組冷凍待用的右腎稱重，剪碎后，冰浴中加入膜蛋白抽提試劑，抽提膜蛋白，考馬斯亮藍(lán)法蛋白質(zhì)定量。每種樣品取20μg濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用100g/L脫脂奶粉封閉，加AQP-7抗體（濃度1：200）4℃孵育過夜后，堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗（濃度1：600）搖床室溫孵育1h，ECL顯色，用Fluorchem V2.0系統(tǒng)測定光密度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0軟件對(duì)研究所得數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1體視學(xué)測量結(jié)果

通過對(duì)AQP-7免疫組織化學(xué)染色陽性切片（免疫組織化學(xué)染色圖片本篇論文未顯示）進(jìn)行體視學(xué)分析得到如下結(jié)果：隨著胚日齡的增加，AQP-7在集合管表達(dá)的面密度值逐漸增加，P7天后增加明顯，P21天達(dá)到頂峰后趨于穩(wěn)定。見表1。

2.2免疫印跡檢測結(jié)果

AQP-7蛋白表達(dá)的電泳條帶用Gene Tools軟件分析，測定光密度值，以測得的光密度最大值記為1，計(jì)算各組小鼠腎組織中AQP-7的相對(duì)表達(dá)量（百分?jǐn)?shù)）。結(jié)果顯示隨著小鼠腎的發(fā)育AQP-7表達(dá)量逐漸增加，P7d后增加明顯，P21d達(dá)到峰值后趨于穩(wěn)定。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間數(shù)值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

3討論

水通道蛋白是允許水和甘油等小分子通透的膜蛋白通道，以四聚體形式位于質(zhì)膜上，每個(gè)單體含有一通道。水通道蛋白功能異常與很多疾病相關(guān)，例如先天性白內(nèi)障、腎源性尿崩癥。迄今為止，在人體已發(fā)現(xiàn)13種水通道蛋白fAQP0-12）。1997年首次從脂肪組織克隆了人類AQP7基因，它既能通透水也能易化甘油從細(xì)胞內(nèi)流出。AQP7在腎臟、睪丸、卵巢、心臟、胃腸道、骨骼肌等組織中均有不同程度的表達(dá)，調(diào)控腦的發(fā)育和精子的形成。腎組織中富含水通道蛋白，共有8種，即，AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP6、AQP7、AQP8和AQP11。對(duì)于AQP-7在腎臟中的作用，學(xué)者們進(jìn)行了一些研究，AQP-7基因敲除的小鼠尿量增加。集合管的主要功能是濃縮尿液，進(jìn)一步重吸收原尿中的水分。為了探討AQP-7與腎臟集合管發(fā)生發(fā)育的關(guān)系，本研究通過免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)合體視學(xué)方法及免疫印跡法檢測AQP-7在小鼠腎集合管發(fā)生發(fā)育過程中的表達(dá)及其含量變化。

AQP-7表達(dá)于集合管上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜，本實(shí)驗(yàn)的體視學(xué)測量結(jié)果顯示AQP-7的面密度值隨著腎臟的發(fā)育逐漸增加，在生后21d達(dá)到最大值，之后維持不變。免疫印跡檢測結(jié)果顯示AQP-7在E16天開始有少量表達(dá)，蛋白含量隨腎臟發(fā)育逐漸增加，至P21d達(dá)最高峰，之后維持這一含量。小鼠發(fā)育過程中，集合管在胚胎16d開始出現(xiàn)，此時(shí)AQP-7開始出現(xiàn)弱表達(dá)，說明腎集合管的早期發(fā)育過程中有AQP-7的參與，此時(shí)的腎臟已具備通透水和（或）甘油等小分子物質(zhì)的功能。小鼠出生后，腎組織中AQP-7的含量逐漸增加，至P21d，AQP-7的表達(dá)達(dá)到最高值，此段時(shí)期，是腎髓質(zhì)體積迅猛增加的時(shí)期，是尿液濃縮能力變化較大的時(shí)期，集合管細(xì)胞水通道蛋白的表達(dá)量是影響尿液濃縮能力的關(guān)鍵因素，AQP-7蛋白含量在腎臟發(fā)育過程中的變化表明它是影響集合管重吸收水分的膜蛋白，對(duì)尿液濃縮發(fā)揮一定的作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人相一致。

至今，關(guān)于AQP7在人體表達(dá)的研究還很少，簡單的以嚙齒類動(dòng)物的研究數(shù)據(jù)來推測人體顯然是應(yīng)該盡量避免的。為了更好的明確AQP7的表達(dá)和作用，蛋白和基因表達(dá)方面的研究還有待進(jìn)一步開展。