吳 茜,敬永升,王藝霖,劉肖肖,王洪濤

1.河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開(kāi)封 475004； 2.河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開(kāi)封475004; 3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南京 210095

兼并引物是根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列與其對(duì)應(yīng)基因的堿基序列之間的共線性關(guān)系設(shè)計(jì)出的引物[1]?？寺⌒碌鞍谆驎r(shí)，可通過(guò)蛋白質(zhì)序列的測(cè)定獲取末端氨基酸序列信息，并依據(jù)其氨基酸序列，設(shè)計(jì)兼并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用兼并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增是獲得新基因和基因家族新成員的常見(jiàn)方法[2]，廣泛應(yīng)用于病毒檢測(cè)、醫(yī)學(xué)診斷等研究領(lǐng)域[3]。在基因家族的研究中，也可根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)兼并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，尋找基因家族的新成員[4]。

由于遺傳密碼子的兼并性，特定氨基酸對(duì)應(yīng)的遺傳密碼子的第三個(gè)堿基并不是唯一的，兼并引物特異性比較低，與模板配對(duì)概率一般在0.1%～1%之間。研究發(fā)現(xiàn)，退火溫度和引物的添加量對(duì)兼并引物PCR結(jié)果有很大的影響[5]。該研究以碭山酥梨(PyrusbretschneideriRehd.)過(guò)氧化物酶同工酶基因克隆為例，依據(jù)蛋白質(zhì)測(cè)序獲得的N端氨基酸序列信息，設(shè)計(jì)兼并引物，研究探索兼并引物PCR最佳條件，最終得到了目的基因。

1 材料與方法

1.1 材料

碭山酥梨(采自開(kāi)封市西郊梨園)，EasyPurePlantRNAKitEasy、TaqDNApolymerase(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，ReverAidFirstStrandcDNASynthersiskit(Thermo)，dNTPs、DNAMarker-DM2000(康為世紀(jì)生物科技有限公司)。引物序列合成(大連寶生物工程有限公司合成)：

5’-ATGGCNTGKATHGCNAT

3’-TCATTTTTTTTTTTTTTTT

1.2 方法

1.2.1 核酸的提取 取碭山酥梨果肉，在液氮環(huán)境中迅速研磨，用CTAB法提取碭山梨果肉中的基因組DNA。總RNA提取按照RNA提取試劑盒的說(shuō)明操作。

1.2.2cDNA的合成 將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照ThermoReverAidFirstStrandcDNASynthersiskit的說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.2.3DNA為模板PCR體系和程序的優(yōu)化 以DNA為模板進(jìn)行兼并引物PCR，其體系及程序如表1、表2所示。

表1 以DNA為模板的PCR體系優(yōu)化

表2 以DNA為模板的PCR程序優(yōu)化

1.2.4cDNA為模板PCR體系和程序的優(yōu)化 以cDNA為模板進(jìn)行兼并引物PCR，其體系及程序如表3、表4所示。

表3 以cDNA為模板的PCR體系優(yōu)化

表4 以cDNA為模板的PCR程序優(yōu)化

1.2.5cDNAPCR產(chǎn)物為模板PCR體系和程序的優(yōu)化 以cDNAPCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行兼并引物PCR，體系及程序如表5、表6所示。

表5 以cDNA PCR產(chǎn)物為模板的PCR體系優(yōu)化

表6 以cDNA PCR產(chǎn)物為模板的PCR程序優(yōu)化

1.2.6PCR結(jié)果分析 配制0.1%的瓊脂糖EB凝膠，使用凝膠電泳技術(shù)分析PCR的產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取結(jié)果分析

碭山酥梨果肉中總RNA電泳圖譜如圖1所示。由圖1可知，提取到了總RNA。

M為2 000 bp的Marker，1～3分別為平行實(shí)驗(yàn)的RNA圖1 碭山酥梨果肉中總RNA電泳圖譜

2.2 以DNA為模板獲取目的基因

以DNA為模板，通過(guò)退火溫度和引物量的優(yōu)化，獲取目的基因。

2.2.1 退火溫度的優(yōu)化 以DNA為模板，引物添加量為0.2μmol/L，退火溫度分別為30.0、30.8、32.9、35.1、39.6、43.1、46.9、50.4、54.0、57.1、59.7、60.0 ℃，進(jìn)行PCR, 并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。結(jié)果如圖2所示。引物添加量為0.2μmol/L，退火溫度在50.4～54.0 ℃時(shí)，PCR結(jié)果較好。

M為2 000 bp的Marker，1～12為不同退火溫度的PCR產(chǎn)物圖2 以DNA為模板的PCR產(chǎn)物電泳圖譜

2.2.2 引物添加量配比的優(yōu)化 以DNA為模板，退火溫度為50.0 ℃，引物添加量分別為0.2、0.6、1.0、2.0μmol/L時(shí)進(jìn)行PCR，并對(duì)其PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。結(jié)果如圖3所示。退火溫度為50.0 ℃，引物添加量為0.6～1.0μmol/L時(shí)，PCR結(jié)果較好。

2.2.3 最適引物配比條件下對(duì)退火溫度的優(yōu)化 以DNA為模板，引物添加量為1.0μmol/L，退火溫度分別為40.0、40.6、41.9、44.0、46.4、48.7、51.3、53.6、56.0、57.1、59.2、60.0 ℃，進(jìn)行PCR, 并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。結(jié)果如圖4所示。引物添加量為1.0μmol/L，退火溫度在51.3～53.6 ℃時(shí)PCR結(jié)果較好。

由圖4結(jié)果所示，縮短退火溫度梯度范圍，退火溫度分別為50.0、50.2、50.9、51.8、52.9、53.7、54.8、49.6、55.0 ℃時(shí)，再次進(jìn)行PCR， 并對(duì)其PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。結(jié)果如圖5所示。當(dāng)引物添加量為1.0μmol/L，退火溫度在53.7～54.8 ℃時(shí)PCR結(jié)果較好。

M為2 000 bp的Marker，1～4分別為引物添加量不同的PCR產(chǎn)物圖3 以DNA為模板的PCR產(chǎn)物電泳圖譜

M為2 000 bp的Marker，1～12為不同退火溫度的PCR產(chǎn)物圖4 以DNA為模板的PCR產(chǎn)物電泳圖譜

M為2 000 bp的Marker，1～9為不同退火溫度的PCR產(chǎn)物圖5 以DNA為模板的PCR產(chǎn)物電泳圖譜

2.3 cDNA為模板獲取目的基因

以cDNA為模板, 通過(guò)退火溫度和引物添加量的優(yōu)化，獲取目的基因。

2.3.1 退火溫度的優(yōu)化 以cDNA為模板，引物添加量0.2μmol/L，退火溫度分別為30.0、30.8、32.9、35.1、39.6、43.1、46.9、50.4、54.0、57.1、59.7、60.0 ℃，進(jìn)行PCR，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳。結(jié)果如圖6所示。當(dāng)引物添加量為0.2μM，退火溫度在54.0～59.7 ℃時(shí)PCR結(jié)果較好。

2.3.2 引物添加量配比的優(yōu)化 以cDNA為模板，退火溫度為50.0 ℃，引物添加量分別為0.2、0.6、1.0、2.0、3.0μmol/L，進(jìn)行PCR，并對(duì)其PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。結(jié)果如圖7所示。退火溫度為50.0 ℃，引物添加量為1.0μmol/L時(shí)PCR結(jié)果較好。

M為2 000 bp的Marker，1～12為不同退火溫度的PCR產(chǎn)物圖6 以cDNA為模板的PCR產(chǎn)物電泳圖譜

M為2 000 bp的Marker，1～5分別為引物添加量不同的PCR產(chǎn)物圖7 以cDNA為模板的PCR產(chǎn)物電泳圖譜

2.3.3 最適引物配比條件下對(duì)退火溫度的優(yōu)化 以cDNA為模板，引物添加量1.0μM，退火溫度分別為40.0、40.6、41.9、44.0、46.4、48.7、51.3、53.6、56.0、57.1、59.2、60.0 ℃，進(jìn)行PCR，并對(duì)其PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。結(jié)果如圖8所示。引物添加量為1.0μM，退火溫度為40.0～50.0 ℃時(shí)，PCR效果較好。

由圖8結(jié)果所示，縮短退火溫度梯度范圍，退火溫度分別為40.0、40.8、41.9、43.2、45.4、47.7、49.2、50.0 ℃，進(jìn)行PCR，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。結(jié)果如圖9所示。引物添加量為1.0μmol/L，退火溫度為45.4 ℃時(shí)，PCR效果較好。

2.4 cDNA PCR產(chǎn)物為模板獲取目的基因

2.4.1 退火溫度的優(yōu)化 將以cDNA為模板45.0℃退火得到的PCR產(chǎn)物再為模板，1∶40的體系添加模板，引物添加量為1.0μmol/L，退火溫度分別為40.0、40.8、42.4、44.1、45.4、46.9、48.4、49.8、51.2、52.8、54.2、55.0 ℃，進(jìn)行PCR，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。結(jié)果如圖10所示。

PCR過(guò)程中，以1∶40的體系添加cDNAPCR產(chǎn)物為模板，退火溫度為52.8 ℃時(shí)，PCR效果較好。

2.4.2 引物添加量配比的優(yōu)化 退火溫度為52.0 ℃，引物添加量1.0μmol/L，以cDNAPCR產(chǎn)物為模板，設(shè)置模板添加量。模板添加量與反應(yīng)體系比分別為1∶40、1∶20、1∶10、1∶5，進(jìn)行PCR，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。結(jié)果如圖11所示。反應(yīng)體系比例為1∶10～20較好。

M為2 000 bp的Marker，1～12為不同退火溫度的PCR產(chǎn)物圖8 以cDNA為模板的PCR產(chǎn)物電泳圖譜

M為2 000 bp的Marker，1～8為不同退火溫度的PCR產(chǎn)物圖9 以cDNA為模板的PCR產(chǎn)物電泳圖譜

M為2 000 bp的Marker，1～12為不同退火溫度的PCR產(chǎn)物圖10 以PCR產(chǎn)物為模板再次PCR電泳圖譜

M為2 000 bp的Marker，1～4為不同模板添加量圖11 以cDNA PCR產(chǎn)物為模板PCR產(chǎn)物電泳圖譜

3 討論

依據(jù)蛋白質(zhì)N端氨基酸序列信息,設(shè)計(jì)兼并引物能夠較好地用于目的基因的克隆。該方法為新基因的克隆提供重要的數(shù)據(jù)支持。兼并引物的兼并性降低了其自身與模板配對(duì)的概率。與特異引物PCR相比，兼并引物PCR克隆目的基因較為困難。目前，通過(guò)增加引物濃度和降低退火溫度來(lái)提高PCR的擴(kuò)增效率的方法在較多研究中均有應(yīng)用[6]。杜占文等人在應(yīng)用兼并引物RT-PCR擴(kuò)增鋅指結(jié)構(gòu)域篩選新基因的實(shí)驗(yàn)中，退火溫度為30.0℃，體系中引物的濃度為常規(guī)PCR引物濃度的100倍[7]。退火溫度較高和引物添加量過(guò)低時(shí)，引物與模板結(jié)合困難導(dǎo)致PCR結(jié)果不理想；退火溫度過(guò)低和引物添加量較高時(shí)，兼并引物錯(cuò)配概率增大，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物中錯(cuò)配基因較多，目的基因不易回收。

該研究以碭山酥梨過(guò)氧化物酶基因的克隆為例，依據(jù)其氨基酸序列設(shè)計(jì)兼并引物，分別以DNA、cDNA和cDNAPCR產(chǎn)物為模板，通過(guò)設(shè)置一系列的退火溫度和引物添加量的配比，進(jìn)行PCR的優(yōu)化。在盡可能低引物濃度和高退火溫度的情況下，獲得目的基因。研究發(fā)現(xiàn)以DNA為模板進(jìn)行PCR時(shí)，引物添加量為1.0μmol/L(僅為常規(guī)PCR引物物添加量的5倍)，退火溫度在53.7～54.8 ℃時(shí)PCR結(jié)果較好；以cDNA為模板進(jìn)行PCR時(shí)，退火溫度為45.4 ℃，引物添加量為1.0μmol/L時(shí)PCR結(jié)果較好；以cDNAPCR產(chǎn)物為模板退火溫度為52.0 ℃，引物添加量1.0μmol/L，模板添加量與反應(yīng)體系比分別為1∶10～20時(shí)PCR結(jié)果較好。該研究為兼并引物PCR設(shè)計(jì)提供了可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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