張 琳，劉 妍,2，劉玉蘭，張 晶*（.武漢輕工大學(xué)，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023；2.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430074）

不同濃度EPA和DHA對C2C12成肌細(xì)胞增殖及凋亡的影響

張 琳1，劉 妍1,2，劉玉蘭1，張 晶1*（1.武漢輕工大學(xué)，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023；2.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430074）

本試驗旨在研究二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）對體外培養(yǎng)的C2C12成肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。用不同終濃度DHA和EPA（0、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L）分別作用C2C12細(xì)胞12、24、48 h后，用CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖情況；用不同終濃度DHA和EPA（0、50、100 μmol/L）分別作用C2C12細(xì)胞48 h后，用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明：終濃度為50、100 μmol/L的EPA處理細(xì)胞48 h，C2C12細(xì)胞增殖能力受到顯著抑制，但不同濃度DHA處理組細(xì)胞的增殖能力無明顯變化。此外，EPA處理C2C12細(xì)胞后，TUNEL法顯示凋亡細(xì)胞數(shù)增加，且100 μmol/L的EPA處理組細(xì)胞凋亡最明顯。然而，與對照相比，DHA處理組細(xì)胞無明顯凋亡。上述結(jié)果表明，EPA能抑制C2C12成肌細(xì)胞增殖并促進其凋亡，而DHA對細(xì)胞增殖和凋亡無明顯影響。

二十碳五烯酸；二十二碳六烯酸；成肌細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

ω-3多不飽和脂肪酸（PUFA）主要包括二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），它們屬于人體必需脂肪酸，常被作為特殊的營養(yǎng)素，因具有獨特的生理活性而受到廣泛關(guān)注[1]。研究表明，EPA、DHA具有預(yù)防心腦血管疾病、促進視覺系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、調(diào)節(jié)免疫、抗癌、抗炎等多種作用[2]。

成肌細(xì)胞是骨骼肌的前體細(xì)胞。骨骼肌發(fā)育的過程主要包括成肌細(xì)胞增殖、退出細(xì)胞周期、遷移并融合為多核肌管，最后形成肌纖維[3]。此外，成肌細(xì)胞也具有成脂分化的能力[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，ω-3 PUFA影響成肌細(xì)胞的脂質(zhì)代謝、抗氧化、蛋白合成以及成脂分化等一系列過程。Pinel等[5]研究發(fā)現(xiàn)，EPA、DHA均明顯改善C2C12成肌細(xì)胞膜的流動性，并影響棕櫚酸酯在成肌細(xì)胞中的代謝，從而減緩其脂質(zhì)毒性作用。Silva等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在C2C12成肌細(xì)胞中添加EPA后過氧化氫酶活性增強，而DHA抑制超氧化物歧化酶活性。此外，DHA、EPA均能促進成肌細(xì)胞脂肪分化相關(guān)基因的表達(dá)[7-8]。然而，ω-3 PUFA對成肌細(xì)胞增殖、凋亡、分化影響的研究較少。因此，本研究將C2C12成肌細(xì)胞作為研究模型，采用CCK-8和TUNEL法檢測EPA、DHA添加對細(xì)胞增殖和凋亡的影響，從而探討ω-3 PUFA對骨骼肌發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 C2C12細(xì)胞（小鼠成肌細(xì)胞）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)趙書紅教授惠贈；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、谷氨酰胺、雙抗、磷酸鹽緩沖液均購自Invitrogen公司；DHA和EPA均購自Sigma公司，用無水乙醇溶解配制成儲存液。

1.2 主要儀器設(shè)備 SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺；CO2培養(yǎng)箱（上海啟前電子科技有限公司）；DK-S12型電熱恒溫水浴鍋（上海森信試驗儀器有限公司）；BIO-RAD酶標(biāo)儀；倒置式熒光顯微鏡（OlYMPUS）。

1.3 C2C12成肌細(xì)胞培養(yǎng) C2C12成肌細(xì)胞株常規(guī)復(fù)蘇后，用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清，1%谷氨酰胺，1%雙抗），在體積分?jǐn)?shù)5% CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖 在96孔板中加入細(xì)胞濃度為2×104個/mL的細(xì)胞懸液100 μL，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h后，處理組分別添加終濃度為6.25、12.5、25、50、100 μmol/L的DHA和EPA，同時設(shè)置對照組，每組4個重復(fù)，在培養(yǎng)箱中分別孵育12、24、48 h。孵育完成后，將孔板中的培養(yǎng)液棄掉，換成新鮮培養(yǎng)液100 μL/孔，然后每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。

1.5 一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測 處理組分別添加終濃度為50 μmol/L和100 μmol/L的DHA和EPA培養(yǎng)細(xì)胞48 h，同時設(shè)置對照組，PBS洗滌3次后，用免疫染色固定液固定細(xì)胞40 min。固定后再用PBS洗滌1次，加入免疫染色洗滌液，冰浴孵育2 min。根據(jù)一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒配制適當(dāng)量的TUNEL檢測液，充分混勻。冰浴孵育完成后，用PBS洗滌2次，在樣品上加50 μL TUNEL檢測液，37℃避光孵育1 h。沖洗，加入少量DAPI染色液，覆蓋住樣品，室溫放置3～5 min。吸除DAPI染色液，用PBS洗滌3次，每次5 min，洗滌完成后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6 C2C12成肌細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察 選用添加終濃度為100 μmol/L的DHA和EPA的培養(yǎng)液培養(yǎng)C2C12成肌細(xì)胞48 h后，用顯微鏡在20×倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并白光拍照。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度DHA和EPA對C2C12細(xì)胞增殖的影響 由圖1可見，在本試驗中培養(yǎng)時間分別為12、24、48 h，隨著培養(yǎng)時間的延長，不同濃度DHA和EPA處理組中細(xì)胞的OD值均呈上升趨勢，在48 h時達(dá)到最大。圖1A顯示，與對照組相比，不同濃度DHA處理組細(xì)胞的OD值在同一時間點的差異不明顯；圖1B顯示，在48 h時，50 μmol/L和100 μmol/L EPA處理組細(xì)胞的OD值明顯低于其他各濃度處理組及對照組，表明濃度為50 μmol/ L和100 μmol/L的EPA對C2C12細(xì)胞增殖有一定抑制作用。為了分析50 μmol/L和100 μmol/L的EPA處理組細(xì)胞的OD值降低是否與細(xì)胞凋亡相關(guān)，分別選取終濃度為50 μmol/L和100 μmol/L的DHA和EPA處理C2C12細(xì)胞48 h后，用一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡情況。

圖1 CCK-8檢測不同添加濃度DHA和EPA對C2C12細(xì)胞增殖的影響

2.2 不同濃度DHA和EPA對C2C12細(xì)胞凋亡的影響 圖2顯示，50 μmol/L的DHA處理組C2C12細(xì)胞未見明顯紅色熒光陽性信號，100 μmol/L的DHA處理組C2C12細(xì)胞僅見部分紅色熒光，表明DHA對C2C12細(xì)胞凋亡無明顯影響；圖3顯示，濃度為50 μmol/L EPA處理C2C12細(xì)胞48 h，可檢測到部分凋亡細(xì)胞，而100 μmol/L的EPA處理組可見明顯的凋亡細(xì)胞，表明50 μmol/L和100 μmol/L的EPA均可誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖2 一步法TUNEL檢測不同添加濃度DHA對C2C12成肌細(xì)胞凋亡的影響

2.3 DHA和EPA對C2C12細(xì)胞形態(tài)的影響 培養(yǎng)液中分別添加終濃度為100 μmol/L的DHA和EPA，培養(yǎng)C2C12細(xì)胞48 h后，用顯微鏡在20×倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。由圖4可見，對照組細(xì)胞形態(tài)完整、排列有序，未見明顯凋亡現(xiàn)象；相對于對照組，100 μmol/L的DHA和EPA處理組C2C12細(xì)胞發(fā)生皺縮、碎裂，雜亂不清，凋亡細(xì)胞增多，尤以EPA處理組的細(xì)胞凋亡更為明顯。

3 討 論

骨骼肌的生長發(fā)育是一個極其復(fù)雜的過程，主要包括胚胎期肌纖維的形成以及出生后肌纖維體積的增大。胚胎期骨骼肌發(fā)育是成肌細(xì)胞增殖、分化、融合成肌管并形成肌纖維的過程。出生后肌纖維的數(shù)量不再增加，只是肌纖維增粗、增長，而這一過程主要依靠肌肉蛋白質(zhì)的合成[9]。目前研究表明，多種營養(yǎng)因素對調(diào)控動物的肌肉生長發(fā)育及改善肉的品質(zhì)具有重要作用[10-11]。

圖3 一步法TUNEL檢測不同添加濃度EPA對C2C12成肌細(xì)胞凋亡的影響

魚油富含ω-3多不飽和脂肪酸（DHA和EPA），在抗炎、調(diào)節(jié)血脂、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等方面具有重要功能。一些研究表明，在母豬妊娠期和泌乳期日糧中添加魚油，可影響仔豬初生重、平均斷奶重、育成率和后期生長[12-14]。然而，Rooke等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在母豬妊娠期第91天添加3%魚油，仔豬組織中脂肪酸含量發(fā)生改變，但對仔豬增重?zé)o影響。lauridsen等[16]研究也發(fā)現(xiàn)，在母豬產(chǎn)前一周和泌乳期添加8%不同來源脂肪酸，魚油組和對照組的仔豬窩增重顯著低于其他幾組。ω-3多不飽和脂肪酸是幼齡動物生長發(fā)育所必需的脂肪酸，對大腦發(fā)育及視覺系統(tǒng)的發(fā)育尤為重要，但對骨骼肌生長發(fā)育的作用尚無明確的結(jié)論。目前，大量研究主要利用C2C12肌管細(xì)胞為模型，證實EPA和DHA具有促進骨骼肌蛋白合成、抑制炎性因子表達(dá)、調(diào)節(jié)脂類代謝和改善胰島素耐受等作用[17-19]。肌管細(xì)胞由成肌細(xì)胞分化而來，但EPA和DHA對成肌細(xì)胞增殖和分化過程有何影響，相關(guān)的研究較少。

圖4 添加終濃度100 μmol/L的DHA和EPA對C2C12細(xì)胞形態(tài)的影響

母體在妊娠期間補充EPA和DHA，胎兒組織EPA和DHA的含量會不斷增加[20]。因此，認(rèn)為在妊娠期間補充EPA和DHA，會對胚胎骨骼肌的發(fā)育產(chǎn)生長效的影響。Peng等[21]選取不同終濃度 EPA和 DHA（10、20、50、100 μmol/L） 處理C2C12細(xì)胞24 h后，用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)50、100 μmol/L的EPA和DHA均能抑制細(xì)胞增殖。然而，本研究結(jié)果表明，不同濃度EPA和DHA處理C2C12細(xì)胞24 h，對細(xì)胞增殖均無明顯影響。隨后，將處理時間延長至48 h，結(jié)果表明低濃度的EPA（6.25、12.5、25 μmol/L）對C2C12細(xì)胞增殖仍無明顯影響，但高濃度的EPA（50、100 μmol/L）隨著處理時間的延長，其對細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強，提示EPA抑制C2C12細(xì)胞增殖依賴于濃度和作用時間。但在相同的作用時間下，不同濃度的DHA對C2C12細(xì)胞的增殖均無明顯影響。

此外，本研究結(jié)果顯示50、100 μmol/L的EPA處理C2C12細(xì)胞48 h，可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且隨著濃度的增加，細(xì)胞凋亡越顯著，提示高濃度EPA抑制細(xì)胞增殖可能與其促進細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。然而，50、100 μmol/L的DHA對細(xì)胞凋亡無明顯影響。本研究推測DHA處理C2C12細(xì)胞48 h，未對細(xì)胞增殖和凋亡產(chǎn)生影響，可能與處理時間有關(guān)。

目前，有研究表明EPA和DHA的作用涉及細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡過程中的多個基因和信號通路。Erk1/2 MApK信號通路促進成肌細(xì)胞的增殖并抑制分化[22]。Peng等[21]研究發(fā)現(xiàn)，EPA和DHA能抑制C2C12細(xì)胞內(nèi)Erk1/2蛋白磷酸化水平，并且下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin E和CDK2的表達(dá)。EPA和DHA具有抗癌作用，可通過抑制Bcl-2表達(dá)、激活Caspases、改變膜的結(jié)構(gòu)等途徑促進細(xì)胞凋亡[23-24]。但EPA和DHA對成肌細(xì)胞增殖和凋亡的作用機制仍不清楚，有待進一步研究。

4 結(jié) 論

骨骼肌的胚胎發(fā)育決定了出生后肌纖維的數(shù)量和性狀。母體在妊娠期間補充EPA和DHA，胎兒組織中EPA和DHA的含量會不斷增加。雖然EPA和DHA能促進胎兒大腦發(fā)育及視覺系統(tǒng)的發(fā)育，但本研究結(jié)果提示隨著EPA和DHA濃度的不斷增加和作用時間的延長，可能會對胚胎骨骼肌的發(fā)育產(chǎn)生不利影響，這為妊娠時期母體合理補充營養(yǎng)素EPA和DHA提供了一定的理論依據(jù)。

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Efects of Diferent Concentrations of EPA and DHA on Proliferation and Apoptosis of C2C12 Myoblast

ZHANG lin1, LⅠU Yan1,2, LⅠU Yu-Lan1, ZHANG Jing1*
(1. Hubei Key Laboratory of Animal Nutrition and Feedscience, Wuhan Polytechnic University, Hubei Wuhan 430023, China; 2. College of life Sciences,South-Central University for Nationalities, Hubei Wuhan 430074, China)

This experiment was conducted to investigate the efects of eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA) on cell proliferation and apoptosis of C2C12 myoblasts. We treated C2C12 myoblasts with different concentrations of DHA and EPA (0, 6.25, 12.5, 25, 50 and 100 μ mol/L, respectively) for 12 h, 24 h and 48 h, and monitored the cell lines for alterations in proliferation with the Cell Counting Kit-8. Ⅰn addition, we detected the C2C12 apoptosis under treatment with diferent concentrations of DHA and EPA (0, 50 and 100 μ mol/L) for 48 h by using the TUNEL assay. The results showed that the C2C12 proliferation was signifcantly inhibited after the treatment with 50 and 100 μ mol/L EPA for 48 h. However, there was no obvious diference in the proliferation of the C2C12 treated with various concentrations of DHA. Ⅰn addition, the TUNEL assay showed that treatment with EPA increased the number of apoptotic cells, and the cellular apoptosis was more obvious under treatment with 100 μ mol/L EPA. Compared with the control group, no obvious cellular apoptosis was observed under treatment with DHA. These results indicate that, EPA can inhibit C2C12 myoblast proliferation and promote its apoptosis, while DHA have no obvious effects on cell proliferation and apoptosis.

Eicosapentaenoic acid; Docosahexaenoic acid; Myoblasts; Cell proliferation; Apoptosis

S865.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-01-061

2016-07-27；

2016-09-02

湖北省自然科學(xué)資助項目（2015CFB514）；湖北省高等學(xué)校優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團隊計劃項目（T201508）

張琳（1991-），女，湖北棗陽人，碩士生，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)，E-mail:2223102573@qq.com

*通訊作者：張晶（1985-），女，湖北武漢人，博士，講師，研究方向為骨骼肌發(fā)育和肌肉損傷的機制，E-mail:judyzhang 1103@163.com