占今舜，劉明美,2，詹 康，趙國琦*

（1.揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇揚州 225009；2.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學院淮安生物工程分院，江蘇淮安 223200）

苜蓿黃酮對奶牛乳腺上皮細胞乳蛋白、乳脂和乳糖合成的影響

占今舜1，劉明美1,2，詹 康1，趙國琦1*

（1.揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇揚州 225009；2.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學院淮安生物工程分院，江蘇淮安 223200）

本試驗旨在研究苜蓿黃酮對體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞乳蛋白、乳脂和乳糖合成相關(guān)基因表達的影響。將乳腺上皮細胞分成5組，每組培養(yǎng)基中分別含有0、25、50、75、100 μg/mL苜蓿黃酮，細胞在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，然后檢測相關(guān)基因的表達。結(jié)果表明：添加苜蓿黃酮具有降低乳腺上皮細胞的mTOR相對表達量的趨勢（P=0.09），25 μ g/mL組的S6K1和eIF4E相對表達量顯著低于50 μ g/mL組（P＜0.05），而對氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白無影響；苜蓿黃酮具有降低FATP1相對表達量的趨勢（P=0.06），50 μ g/mL組PPAR-γ 、SCD1和FASN相對表達量最高均顯著高于0 μg/mL（P＜0.05）組；50 μg/mL組的Glut1和Glut4相對表達量顯著高于25 μg/mL組（P＜0.05），0 μg/mL組的Glut8相對表達量顯著低于50～100 μg/mL組（P＜0.05），而β-1,4-Gal T相對表達量顯著高于其他各組（P＜0.05），25 μg/mL組的HK2相對表達量顯著低于0 μg/mL組（P＜0.05）。結(jié)果提示，苜蓿黃酮能夠調(diào)節(jié)乳蛋白、乳脂和乳糖的合成。

苜蓿；黃酮類化合物；奶牛；奶牛乳腺上皮細胞

黃酮類化合物（Flavonoids）是以2-苯基色原酮為母核而衍生的，以C6-C3-C6為碳架的一類化合物，其廣泛存在于植物中，是植物一種主要的次生代謝產(chǎn)物。研究表明，黃酮類化合物具有抗氧化、改善血液循環(huán)、抑制炎癥等作用，添加在飼料中可促進動物生長和改善繁殖性能等[1]。紫花苜蓿（Medicagosativa）由于營養(yǎng)價值高，含有豐富的蛋白質(zhì)、粗纖維、維生素以及微量元素，被稱為“牧草之王”，是我國最重要的栽培牧草之一[2]。苜蓿中黃酮含量較高，據(jù)報道，45個紫花苜蓿品種中有70%以上品種的總黃酮含量為0.6%～0.9%。研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿黃酮能夠提高麻雞的生產(chǎn)性能，提高小鼠的生長性能和改善其特異性和非特異性免疫功能以及過影響下丘腦－垂體－卵巢性腺軸來改善妊娠期間雌鼠的繁殖性能[3-5]。日糧中添加大豆黃酮能夠提高奶牛乳脂率、乳蛋白和乳糖的含量；添加染料木黃酮能顯著提高牛奶的乳脂率和乳蛋白率，而添加蘆丁不會影響乳脂率、乳蛋白和乳糖的含量[6-8]。說明黃酮類化合物對奶牛乳品質(zhì)有一定的影響作用，且不同結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物作用不同。細胞培養(yǎng)技術(shù)是通過體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在建立無菌、適溫和一定的營養(yǎng)條件，使活體內(nèi)取出與試驗相關(guān)組織或細胞生長和生存并維持其結(jié)構(gòu)與功能的一種方法。該方法具有易于提供性狀相似的試驗對象、耗資少、對于大型經(jīng)濟動物來講比較經(jīng)濟等特點。目前，苜蓿黃酮對奶牛乳品質(zhì)的影響尚未有報道。因此，本試驗通過細胞培養(yǎng)技術(shù)來研究苜蓿黃酮對乳脂、乳蛋白和乳糖相關(guān)合成相關(guān)基因表達的影響，從而了解苜蓿黃酮調(diào)節(jié)奶牛乳品質(zhì)的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 苜蓿黃酮提取和純化均由陜西綠清生物工程有限公司完成。奶牛乳腺上皮細胞由本試驗室通過組織塊培養(yǎng)法獲得，純化后通過共聚焦顯微鏡觀察細胞角蛋白18來證明所培養(yǎng)的細胞為上皮型細胞[9]。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 試驗于2015年3月開始進行，取密度為5×105個/mL細胞接種到6孔板，將細胞置于DMEM/F12（Gibco，美國）培養(yǎng)基在37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有10%的胎牛血清（Gibco，美國）、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素（Sigma，美國）。試驗分為5組，即基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加0、25、50、75、100 μg/mL苜蓿黃酮，每組5個重復，其中苜蓿黃酮用DMSO（索萊寶，北京）完全溶解，各處理組中的二甲基亞砜（DMSO）含量為2%。培養(yǎng)72 h后進行細胞RNA提取。

1.2.2 細胞RNA提取和cDNA的合成 去除細胞培養(yǎng)液，在6孔板中每個孔中直接加入1 mL的Trizol，混勻靜置5 min。然后根據(jù)天根生化科技有限公司RNA提取試劑盒中的說明書進行總RNA的提取，采用One Drop儀器進行總RNA的濃度和純度的測定。采用Roche反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA的合成，操作在冰上進行。反應(yīng)體系為20 μL：Total RNA 1μ L，Anchored-oligo（dT）18 primer 1μ L，Random hexamer primer 2 μ L，Water（PCR-grade）9 μ L，Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer 4 μ L，protector RNase Inhibitor 0.5 μL，Deoxynucleotide Mix 2 μ L，Transcriptor Reverse Transcriptase 0.5 μ L。反應(yīng)條件：25℃ 10 min，55℃30 min。所得cDNA保存于-20℃待測。

1.2.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中的基因序列，采用primer 5.0軟件設(shè)計引物，引物由Invitrogen公司合成（表1）。

1.2.4 熒光定量PCR條件 根據(jù)Roche試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)液，操作在冰上進行。反應(yīng)液組成：Master Mix 10 μ L，上、下游引物各1 μ L，PCR級水3 μL，cDNA 5μ L。將反應(yīng)液置入羅氏96孔PCR反應(yīng)板中，然后在羅氏Light Cycler 96 PCR儀上進行檢測。PCR反應(yīng)條件為95℃預變性600 s；PCR反應(yīng)為95℃ 10 s，退火60℃和72℃延伸各10 s，循環(huán)45次；熔解曲線分析65℃ 60 s。

1.3 統(tǒng)計分析 基因相對表達量采用2-△△Ct方法進行計算，試驗數(shù)據(jù)先用Excel 2007進行預處理，數(shù)據(jù)采用IBMSPSSstatistics 21.0單因素方差分析（ANOVA），LSD法多重比較， P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿黃酮對乳蛋白合成基因表達的影響 從表2中可知，苜蓿黃酮對奶牛乳腺上皮細胞的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白基因（LAT1和CAT1）表達沒有顯著影響。添加苜蓿黃酮具有降低乳腺上皮細胞的mTOR相對表達量的趨勢（P=0.09），降低4EBPI的相對表達量，但各組未達顯著性。25 μg/mL組的S6K1相對表達量顯著低于0、50、75 μg/mL組（P＜0.05）；eIF4E相對表達量顯著低于50 μg/mL組（P＜0.05）。說明苜蓿黃酮能夠影響奶牛乳蛋白合成。

2.2 苜蓿黃酮對乳脂合成基因表達的影響 從表3中可知，苜蓿黃酮具有降低FATP1相對表達量的趨勢（P=0.06），但各組SREBP1相對表達量之間無顯著性差異。添加50 μg/mL組的PPAR-γ 、SCD1和FASN相對表達量均顯著高于0、25 μg/mL組（P＜0.05）。結(jié)果表明，苜蓿黃酮對乳脂合成具有調(diào)節(jié)作用。

2.3 苜蓿黃酮對乳糖合成基因表達的影響 由表4可知，50 μg/mL組的Glut1和 Glut4相對表達量顯著高于25 μg/mL組（P＜0.05）；0 μg/mL組的Glut8相對表達量顯著低于其他組（P＜0.05），而β-1,4-Gal T相對表達量顯著高于其他各組（P＜0.05）；25 μg/mL組的HK2相對表達量顯著低于0 μg/mL組（P＜0.05），其他各組之間無顯著差異。結(jié)果表明，苜蓿黃酮對乳糖合成具有一定的影響作用。

表2 苜蓿黃酮對乳蛋白合成基因表達的影響

表3 苜蓿黃酮對乳脂合成基因表達的影響

3 討論與結(jié)論

乳蛋白合成受到氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、蛋白酪氨酸激酶-2信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子-5信號轉(zhuǎn)導途徑（Jak2-Stat5）和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路的調(diào)控[10]。乳腺是奶牛合成乳蛋白的重要器官，乳中的大部分乳蛋白是以氨基酸為原料合成的。乳腺上皮細胞通過氨基酸轉(zhuǎn)運載體將血液中游離氨基酸轉(zhuǎn)進乳腺來合成乳蛋白。氨基酸轉(zhuǎn)運載體CAT1（SLC7A1）能特異的轉(zhuǎn)運堿性氨基酸（賴氨酸、精氨酸和組氨酸），而LAT1（SlC7A5）能夠轉(zhuǎn)運大分子的支鏈氨基酸、中性氨基酸和一些必需氨基酸，其對蛋白質(zhì)的合成有促進作用[11]。從本試驗結(jié)果來看，苜蓿黃酮不會影響乳腺上皮細胞對氨基酸的吸收。4EBPl和S6K1是蛋白翻譯的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，4EBPl能夠與eIF4E相結(jié)合會抑制蛋白質(zhì)的翻譯。而mTOR能夠抑制4EBPl發(fā)生磷酸化，促使eIF4E與4EBPl分離，導致eIF4E的表達增高，從而促進關(guān)鍵蛋白質(zhì)的翻譯。另外，mTOR能夠使S6K1蛋白磷酸化，增強含嘧啶基因mRNA的翻譯功能，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成[12]。從本試驗結(jié)果來看25 μg/mL苜蓿黃酮組的mTOR、S6K1和eIF4E相對表達最低，說明添加低劑量苜蓿黃酮可能會通過降低mTOR表達，降低S6K1磷酸化和降低eIF4E表達，降低mRNA的翻譯，進而降低乳蛋白的合成。但隨著苜蓿黃酮劑量的升高，可能對乳蛋白的合成會有所升高。

表4 苜蓿黃酮對乳糖合成基因表達的影響

一部分乳脂是由乳腺上皮細胞利用乙酸、β-羥丁酸等物質(zhì)在各種酶的作用下從頭合成，另一部分是從血液中獲取。脂肪酸合成酶（FAS）是脂肪合成的一個關(guān)鍵酶，其能夠催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A生成長鏈脂肪酸。當FAS酶活性提高，丙二酰輔酶A能不斷催化合成長鏈脂肪酸，進而導致脂肪的沉積。硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD）是催化飽和脂肪酸形成單不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶。通過敲除SCD基因的小鼠，雖增加采食高能飼糧，但其體脂的沉積卻大大減少。說明SCD能夠促進脂肪的合成。脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白（FATPs）參與機體內(nèi)細胞的脂肪酸跨膜轉(zhuǎn)運和脂質(zhì)代謝。FATP1可以促進細胞對長鏈脂肪酸的吸收并促進甘油三酯的儲存[13]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)脂肪合成基因的重要因子，能夠調(diào)控膽固醇和脂肪酸合成基因的表達。SREBP1是脂肪合成有關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的決定子，能夠參與調(diào)控多種脂肪合成相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄激活過程。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）是脂質(zhì)代謝的主要調(diào)控因子，PPAR-γ能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)蛋白酶、脂肪酸轉(zhuǎn)運酶和脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達來調(diào)節(jié)脂肪酸和膽固醇的攝入。研究發(fā)現(xiàn)，使用PPAR-γ激動劑后能夠上調(diào)SCD、FAS等表達[14]。從本試驗結(jié)果看，苜蓿黃酮可能會通過促進PPAR-γ表達來上調(diào)FATP1、SCD和FAS表達，進而提高乳脂的合成。

乳糖主要由乳腺上皮細胞通過葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（ Glut）吸收乳腺組織的血糖進入細胞內(nèi)合成。對于奶牛， Glut1是最主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，但泌乳期乳腺也能表達 Glut 4和 Glut8[15]。催化乳糖合成的酶類包括己糖激酶和乳糖合成酶。己糖激酶（HK）能使葡萄糖磷酸化為葡萄糖-6-磷酸，然后在變位酶和UTP 的作用下生成UDP-半乳糖。乳糖合成酶由 β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（β-1,4-GT）及必需輔助因子 α-乳白蛋白（α-lA）組成，是乳糖合成與分泌過程的主要限速酶，能夠催化葡萄糖和 UDP-半乳糖合成乳糖。從本試驗結(jié)果來看，苜蓿黃酮能夠提高 Glut8的表達，但對 Glut1和 Glut4表達的影響不大；能夠降低β-1,4- GT和HK2表達。結(jié)果表明，苜蓿黃酮可能會通過調(diào)節(jié)催化乳糖合成酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白來調(diào)節(jié)乳糖的合成。

以上結(jié)果說明，苜蓿黃酮能夠調(diào)節(jié)乳腺上皮細胞乳蛋白、乳脂和乳糖合成相關(guān)基因的表達來調(diào)控乳蛋白、乳脂和乳糖的合成。然而通過體外細胞培養(yǎng)相對于機體這個系統(tǒng)來講，會存在很大的差異，因此試驗的結(jié)果可能會與在體內(nèi)研究的結(jié)果存在差異。

[1] 占今舜,趙越,張彬. 大豆黃酮在禽類生產(chǎn)中的應(yīng)用研究進展[J]. 家禽科學, 2012, (4):49- 52.

[2] 占今舜, 魏明吉, 蘇效雙,等. 苜蓿黃酮對熱應(yīng)激下體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞凋亡的影響[J]. 草業(yè)學報, 2016, 25(4):159- 165.

[3] 歐陽克蕙,熊小文,王文君,等. 苜蓿黃酮對崇仁麻雞生長性能及肌肉化學成分的影響[J]. 草業(yè)學報, 2013, 22(4):340- 345.

[4] 朱宇旌,張勇,寧自利,等. 苜蓿異黃酮提取物對小鼠生長和免疫功能的影響[J]. 營養(yǎng)學報, 2008, 30(6):615-618.

[5] 王偉,田苗苗,梁新平,等. 苜?？傸S酮對妊娠雌鼠繁殖性能及相關(guān)基因表達量的影響[J].草業(yè)學報, 2013, 22(6):249- 256.

[6] 楊建英. 大豆黃酮對不同泌乳期奶牛產(chǎn)奶量,乳成分的影響及相關(guān)作用機制的研究[D]. 鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學, 2003.

[7] 李晶晶. 日糧中添加染料木黃酮對荷斯坦奶牛生產(chǎn)性能和血液生化指標的影響[D]. 保定:河北農(nóng)業(yè)大學, 2008.

[8] 郭旭東. 蘆丁對奶牛泌乳性能,瘤胃消化代謝和對大鼠乳腺發(fā)育的影響[D] .北京:中國農(nóng)業(yè)科學院, 2011.

[9] 詹康,貢笑笑,左曉昕,等.奶牛乳腺上皮細胞系的培養(yǎng)與鑒定[J]. 動物營養(yǎng)學報, 2015, 27(8):2544- 2550.

[10] 林忠荔,江明鋒,任洪輝.牛乳蛋白合成的分子調(diào)控機制[J] .中國畜牧獸醫(yī), 2014, 41(5):158- 162.

[11] 熊霞,陽成波,印遇龍. 腸道氨基酸及氨基酸轉(zhuǎn)運載體研究進展[J] . 生理科學進展, 2012, 43(3):202- 206.

[12] Ⅰnoki K, Ouyang H, Li Y, et a1. Signaling by target of rapamycin proteins in cell growth control[J]. Microbiol Mol Biol Rev , 2005, 69(1):79-100.

[13] Lobo S, Wiczer B M, Smith A J, et al. Fatty acid metabolism in adipocytes: functional analysis of fatty acid transport proteins 1 and 4[J]. J Lipid Res, 2007, 48: 609- 620.

Efects of Alfalfa Flavonoids on Lactoprotein, Milk Fat and Lactose Synthesis in Bovine Mammary Epithelial Cells

ZHAN Jin-shun1, LⅠU Ming-mei1,2, ZHAN Kang1, ZHAO Guo-qi1*
(1. College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Jiangsu Yangzhou 225009, China; 2. Jiangsu Joint Ⅰnstitute of Technology of Profession of Huai’an Bio-engineering Branch, Jiangsu Huai’an 223200, China)

To study the effects of alfalfa flavonoids on gene expression of the lactoprotein, fat and lactose synthesis in bovine mammary epithelial cells. The bovine mammary epithelial cells were divided into 5 groups which had the concentrations of alfalfa favonoids 0, 25, 50, 75 and 100μg/mL, respectively. The cells of each groups were cultured at the condition of 37 ℃,5 % CO2in the cell incubator. The cells were cultured at 72 h and then collected to detect the gene expression. The results showed as follow: the relative expression of mTOR showed a tendency of decrease by alfalfa favonoids supplementation (P=0.09). The relative expression of S6K1 and eⅠF4E were signifcantly lower in 25 μg/mL group than that in 50 μg/mL group (P＜0.05). However, the relative expression of amino acid transporter was unafected by alfalfa favonoids. The relative expression of FATP1 had a tendency of decrease by supplementing alfalfa favonoids (P=0.06). Compared with 0 μg/mL group, the relative expression of PPAR-y ,SCD1 and FASN in 50 μg/mL group were signifcantly increased (P＜0.05). Compared with 25 μg/mL group, the relative expression of Glut1 and Glut4 in 50 μg/mL group and the relative expression of HK2 in 0 μg/mL group were signifcantly increased (P＜0.05). Compared with 0 μg/mL group, the relative expression of Glut8 in 50 to 100 μg/mL group were signifcantly increased (P＜0.05), whereas the relative expression of β-1,4-Gal T in other group were signifcantly decreased (P＜0.05). Ⅰn conclusion, alfalfa favonoids could regulate the synthesis of lactoprotein, milk fat and lactose.

Alfalfa; Flavonoids; Dairy cow; Bovine mammary epithelial cells

S823.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-01-091

2016-06-30；

2016-07-21

江蘇省高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程項目（PAPD）；長三角地區(qū)生鮮乳質(zhì)量安全追溯體系關(guān)鍵技術(shù)研究應(yīng)用項目（14395810100）；江蘇省高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目（KYZZ_0367））

占今舜（1985-），男，江西玉山人，博士研究生，主要從事動物營養(yǎng)與飼料科學研究，E-mail:zhanjinshun@sohu.com

*通訊作者：趙國琦，教授，博士生導師，E-mail:gqzhao@yzu.edu.cn