侯雪峰+孫帥+汪剛+邱輝輝+丁淑敏+劉瑩+劉丹+封亮+賈曉斌

[摘要]建立一種超高效液相色譜法同時測定墨旱蓮中的異槲皮苷、木犀草苷、異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯、芹菜素8種成分含量的方法。采用Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm），流動相A為乙腈，B為0.1%的甲酸水，梯度洗脫條件：0～4 min，10%～13% A；4～10 min，13%～16% A；10～13 min，16%～25% A；13～17 min，25%～28% A；17～20 min，28%～40% A；20～25 min，40%～95% A。流速：0.3 mL·min^-1；柱溫35 ℃；檢測波長350 nm。研究結(jié)果表明各指標成分之間分離度良好，在選定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.999 0），平均加樣回收率（n=6）在96.60%～103.4%，RSD為0.86%～2.4%。所建立的UPLC同時測定墨旱蓮藥材中8種指標成分的含量的方法回收率較好，重復性、穩(wěn)定性良好，為墨旱蓮的鑒別及質(zhì)量評價提供了科學依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]墨旱蓮； 超高液相色譜法； 多指標成分； 含量測定

[Abstract]To establish an UPLC method for the simultaneous determination of 8 compounds in Eclipta Herba， such as isoquercitrin， luteoloside， demethylwedelolactone， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C， luteolin， wedelolactone and apigenin. The experiment was performed with a Waters Acquity UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm， 1.7 μm） column by gradient elution of 0.1% formic acid in water and acetonitrile： 0-4 min，10%-13% A； 4-10 min， 13%-16% A； 10-13 min， 16%-25% A； 13-17 min， 25%-28% A； 17-20 min，28%-40% A；20-25 min，40%-95% A. The flow rate was 0.3 mL·min^-1 .The condition of was the colum temperature was maintained at 35 ℃ and the detected wavelength was set at 350 mm. 8 components were separated clearly by this method. Also a good linearity was obtained between the chosen concentration（r≥0.999 0）. The measured data showed that the recovery rate range from 96.60%-103.4% （n=6） and their RSD values were 0.86%-2.4%. The method has high recovery rate， good reproducibility and stability. It provides a scientific basis for the identification and quality evaluation of Eclipta Herba.

[Key words]Eclipta Herba； UPLC； multi-component quantification； content determination

doi：10.4268/cjcmm20162116

墨旱蓮為菊科植物鱧腸Eclipta prostrate L.干燥地上部分^[1]，廣泛分布于河南、安徽、江蘇、江西、浙江、福建、廣東、廣西、湖南、湖北等地^[2]。其始載于《新修本草》，有滋陰益腎涼血止血之功效?，F(xiàn)代藥理研究證明，墨旱蓮具有保肝益腎^[3-4]、調(diào)節(jié)免疫^[5-6]、抗氧化^[7-8]、抗菌抗炎^[9]、抗瘧疾^[10]及抗腫瘤^[11-12]等作用，其主要化學成分主要有香豆草醚類、黃酮類、酚酸類等^[13]。目前《中國藥典》2015年版對墨旱蓮藥材的質(zhì)量評價依賴于蟛蜞菊內(nèi)酯單一化學成分的含量測定^[1]。然而傳統(tǒng)中藥的療效是多成分共同作用的結(jié)果，單一活性成分并不能代表藥材整體的質(zhì)量。近年來多指標評價墨旱蓮的活性成分的報道較少，且多為2種成分同時定量^[14-15]，運用方法多為HPLC，大多集中在某一類別化學成分的評價^[16-18]。然而HPLC耗時長，其靈敏度較低，面對傳統(tǒng)中藥中低含量成分的檢測問題時常常束手無策。

UPLC具有耐高壓、快速分離、高靈敏度、高分離度等特點，能克服HPLC靈敏度低，分析時間長等缺點，在中藥等復雜體系的分離分析上具有明顯優(yōu)勢^[18]，被廣泛地應用于中藥復雜體系的研究^[19-20]。本實驗首次建立了UPLC同時測定墨旱蓮藥材中8種活性成分含量的測定方法，該方法經(jīng)試驗認證安全可靠簡便易行，重現(xiàn)性好，溶劑消耗少，為建立墨旱蓮藥材的質(zhì)量控制與評價標準提供借鑒。

1 材料

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀，包括二元梯度泵、恒溫自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器（DAD）以及Waters Empower 2軟件（美國 Waters 公司）。Mettler Toledo MS105DU分析天平（Mettler Toledo 分析儀器有限公司）；KQ5200DE 型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）。

木犀草苷（批號111720-201408）、木犀草素（批號111520-201104）、蟛蜞菊內(nèi)酯（批號111885-201403）、芹菜素（批號111901-201102）和異槲皮苷（批號111809-201403）均購自中國食品藥品檢定研究院；異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯（批號150401）、異綠原酸A（批號150311）和異綠原酸C（批號150420）均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，所有對照品純度均≥98.0%。甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純，購自美國TEDIA公司，水為Mlliipore超純水。6個批次墨旱蓮藥材（產(chǎn)地為安徽亳州；批號分別為150722，150731，150804，150830，150922，151011）購于精華制藥亳州康普有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學生藥學教研室吳德康教授鑒定為菊科植物鱧腸E. prostrate的干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）； 流動相A為乙腈，B為0.1%的甲酸水，梯度洗脫條件：0～4 min，10%～13% A；4～10 min，13%～16% A；10～13 min，16%～25% A；13～17 min，25%～28% A；17～20 min，28%～40% A；20～25 min，40%～95% A。流速0.3 mL·min^-1；柱溫35 ℃；檢測波長350 nm；進樣量2 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備 分別稱取異槲皮苷、木犀草苷、異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯、芹菜素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成對照品儲備液，備用。依次精密量取上述8個對照品儲備液適量置10 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，制成含異槲皮苷42.16 mg·L^-1、木犀草苷81.60 mg·L^-1、異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯36.80 mg·L^-1、異綠原酸A 40.80 mg·L^-1、異綠原酸C 14.60 mg·L^-1、木犀草素14.20 mg·L^-1、蟛蜞菊內(nèi)酯208.00 mg·L^-1、芹菜素21.60 mg·L^-1的混合對照品溶液。

2.3 供試樣品溶液的制備 取墨旱蓮藥材粉末（過3號篩）1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入80%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量；超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min后，放至室溫，再次稱定質(zhì)量，用80%甲醇補足失重，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得?；旌蠈φ掌芳肮┰嚻飞V圖見圖 1。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密移取上述混合對照品溶液，加80%甲醇稀釋，稀釋倍數(shù)分別為0， 2.5， 10， 20， 50， 100倍，得一系列對照品混合溶液，搖勻。在上述色譜條件下進樣分析，以各成分峰面積為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度（mg·L^-1）為橫坐標（X），繪制標準曲線，計算回歸方程和線性范圍見表 1。

2.5 檢出限和定量限的測定 將2.2項下的混合對照品溶液用80%甲醇逐級稀釋后，以S/N≥3～4計算檢測限（LOD），以S/N≥10～12計算最小定量限（LOQ），結(jié)果見表 1。

2.6 精密度試驗 日內(nèi)精密度：取同一混合對照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進樣6次，計算異槲皮苷、木犀草苷、異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯、芹菜素峰面積的RSD分別為0.84%，1.2%，1.6%，0.63%，0.33%，0.81%，1.1%，1.4%。日間精密度：每天1次，以混合對照品溶液連續(xù)進樣5d，計算異槲皮苷、木犀草苷、異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯、芹菜素峰面積的RSD分別為0.97%，1.3%，1.5%，0.93%，0.83%，1.2%，1.7%，1.9%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗 取墨旱蓮藥材（批號150830）粉末1 g，參照2.3項下操作，平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析，計算異槲皮苷、木犀草苷、異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯、芹菜素峰面積的RSD分別為1.7%，2.0%，2.6%，2.3%，1.1%，1.9%，2.5%，1.3%，表明重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取墨旱蓮藥材（批號150830）粉末1 g，按2.3項下操作，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過至棕色量瓶中，在上述色譜條件下分別在0，2，4，6，8，12 h進樣分析，計算異槲皮苷、木犀草苷、異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內(nèi)酯、芹菜素峰面積的RSD 分別為0.86%，1.8%，2.2%，2.6%，1.3%，1.9%，2.3%，2.4%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取9份已知含量的墨旱蓮藥材（批號150830）粉末0.020 0 g，分別精密加入高、中、低3種濃度的對照品溶液適量（分別相當于藥材原有含量的80%， 100%， 120%），每種濃度取3份，精密稱定，置離心管中，加入80%甲醇2 mL，密塞，稱定質(zhì)量；之后操作參照2.3項下方法制成供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析，計算平均回收率，見表2。8種被測成分回收率在96.60%～103.4%，RSD在0.86%～2.4%，表明方法回收率較好。

2.10 樣品含量測定 取6個批次的墨旱蓮藥材粉末，參照2.3項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析，每批樣品平行測定2次，按照外標一點法計算各樣品中8種成分的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

實驗初期對提取溶劑進行了考察，比較了不同濃度甲醇提取物的UPLC色譜圖，分別以純水， 40%，60%， 80%， 100%的甲醇溶劑超聲提取墨旱蓮藥材，其中以80%甲醇為提取溶劑時，色譜峰較多，且峰形好，提取效果最好。故本實驗最終確定用80%甲醇提取效果最佳。

在考察流動相時，有機相分別考察乙腈和甲醇，發(fā)現(xiàn)乙腈的分離效果較好，而用甲醇時色譜峰重疊、峰形差。此外，還考察了流動相中酸的種類對峰形的影響，分別采用了乙腈-0.1%乙酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液以及乙腈-0.1%磷酸水溶液等流動相進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在流動相中加入酸可在一定程度上改善峰形。其中，以乙腈-0.1%甲酸水溶液的峰形最佳。

從表2中可以看出不同批次的墨旱蓮藥材中6種成分含量差異并不是很大，可能是由于藥材出自同一產(chǎn)地，且均在同一年的同一采收期購置得到。然而墨旱蓮產(chǎn)區(qū)遍及全國各省^[2]，分布及其廣泛，且未有道地產(chǎn)區(qū)的記載。不同產(chǎn)地由于自然資源、氣候條件以及人文因素的不同^[21-22]，藥材質(zhì)量必將參差不齊。本課題組后續(xù)將進一步對不同產(chǎn)地墨旱蓮中化學成分的種類、含量及其量與量之間的關(guān)系進行比較，以期建立科學系統(tǒng)的藥材質(zhì)量評價方法，確定不同產(chǎn)地墨旱蓮藥材成分的差異性。

無論單味藥還是復方中藥，其藥效的發(fā)揮主要還是依靠組分的整體協(xié)同作用。長期以來，中藥多成分及多靶點的作用特點一直被大家所認同，中藥材的質(zhì)量評價不能停留在單一指標性成分上，建立多指標成分的測定方法，有助于實現(xiàn)現(xiàn)代中藥的多維質(zhì)量控制。本實驗首次利用UPLC對墨旱蓮中的異槲皮苷，木犀草苷，異去甲蟛蜞菊內(nèi)酯，異綠原酸A，異綠原酸C，木犀草素，蟛蜞菊內(nèi)酯，芹菜素等8種成分進行同時測定，分析方法靈敏、準確、快速，重現(xiàn)性好，分析效率高，30 min內(nèi)即可同時完成8種成分的準確測定，初步探究了墨旱蓮藥材的物質(zhì)基礎(chǔ)，為墨旱蓮藥材的評價及質(zhì)量控制提供借鑒。

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[責任編輯 丁廣治]