由淑萍，從美麗，倪國華，詹懷峰，王紅軍，金 晶，馬登娥，葉力夏提，趙志強，蔣 紅，劉 濤

·論著·

哈薩克族原發(fā)性高血壓病患者全血DNA甲基化位點篩查及異常甲基化譜的構(gòu)建

由淑萍1，從美麗2，倪國華3，詹懷峰4，王紅軍5，金 晶6，馬登娥7，葉力夏提4，趙志強1，蔣 紅1，劉 濤8*

目的 應用基因芯片技術(shù)篩選哈薩克族原發(fā)性高血壓病(EH)患者異常DNA甲基化位點，初步構(gòu)建哈薩克族EH異常甲基化譜，為深入研究哈薩克族EH的發(fā)生機制提供理論依據(jù)。方法 2014年6月—2015年10月，在新疆烏魯木齊縣隨機抽取哈薩克族牧民或半農(nóng)牧民3 042例為調(diào)研對象，從其中的1 487例EH患者中隨機選取3例作為EH組，并選取年齡匹配的3例健康者作為對照組。采用Illumina Human Methylation 450K BeadChip芯片對兩組受試者的全血進行全基因組DNA甲基化檢測，篩選DNA異常甲基化位點，采用Gene Ontology(GO)富集分析和Pathway分析了解異常甲基化基因的功能。結(jié)果 EH組和對照組間存在427個差異甲基化位點，其中高甲基化位點148個，低甲基化位點279個；這些位點位于不同的染色體上，其中以1號和6號染色體最多，Y染色體未見差異甲基化位點；GO富集分析結(jié)果顯示，差異甲基化基因主要參與糖蛋白生物合成與代謝、血管發(fā)育、脈管系統(tǒng)發(fā)展、膠原蛋白結(jié)合等生物學過程；Pathway分析結(jié)果顯示，差異甲基化基因主要參與了硫酸軟骨素生物合成、胰島素信號通路、胞吞等。結(jié)論 發(fā)生EH時DNA甲基化狀態(tài)發(fā)生改變，多條差異甲基化基因與EH相關(guān)通路有關(guān)，但本研究僅是哈薩克族EH全基因組甲基化譜的開端，異常甲基化基因作為發(fā)生EH的候選分子標志物，若要獲得更全面、更精確的結(jié)果，還需要進一步擴大樣本量進行分析及驗證。

高血壓；哈薩克族；DNA甲基化；基因芯片

由淑萍，從美麗，倪國華，等.哈薩克族原發(fā)性高血壓病患者全血DNA甲基化位點篩查及異常甲基化譜的構(gòu)建[J].中國全科醫(yī)學，2017，20(6)：678-683.[www.chinagp.net]

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原發(fā)性高血壓病(essential hypertension，EH)系一種常見的遺傳性疾病，病因復雜，已成為心腦血管疾病最重要的致病危險因素[1]。盡管研究表明EH有顯著的家族遺傳性及聚集性，但目前單純的全基因組DNA堿基序列檢測對血壓變異性的解釋仍非常局限[2]；如同卵雙生的兩位EH患者，其血壓值、患病時間及病情進展等諸多生物學特點并不完全相同，表觀遺傳學因素或參與其中。研究顯示，哈薩克族為中國少數(shù)民族中EH患病率最高的民族，約為48.97%[3]，其中新疆巴里坤地區(qū)哈薩克族EH檢出率為61.60%，明顯高于漢族的38.60%[4]；而有關(guān)DNA甲基化在哈薩克族EH患者發(fā)病機制中的作用研究尚少[5-7]。DNA甲基化是目前研究最為清晰且重要的一類表觀遺傳修飾形式，當環(huán)境因素發(fā)生變化時即可引起相關(guān)基因的表達變化，進而影響整個基因網(wǎng)絡(luò)或調(diào)控通路，導致異常表型。本研究采用Illumina Human Methylation 450K BeadChip芯片對哈薩克族EH患者和健康者的外周血樣本進行全基因組表觀遺傳學關(guān)聯(lián)研究(epigenome - wide association studies，EWAS)，分析組間差異甲基化位點，并對異常表達的甲基化基因進行生物信息學分析，了解其參與的生物學過程及調(diào)控的信號通路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2014年6月—2015年10月，在新疆烏魯木齊縣隨機抽取哈薩克族牧民或半農(nóng)牧民3 042例為調(diào)研對象，其中EH患者1 487例，EH患病率為48.88%。從1 487例EH患者中隨機選取3例作為EH組，并選取年齡匹配的3例健康者作為對照組。兩組受

本研究背景：

高血壓作為全球主要的公共健康問題，導致每年超過760萬人死亡，是心腦血管疾病的最大危險因素。目前，全球高血壓患病率逐年增加，中國成年人高血壓患病率為18.8%，我國40歲以上男性高血壓患病率為28.9%，女性為26.9%。據(jù)世界衛(wèi)生組織預測，到2020年全球高血壓患者將上升到1.5億人。哈薩克族是我國群體遺傳結(jié)構(gòu)及高血壓發(fā)病較有特點的一個民族，該民族長期生活在新疆干旱地區(qū)，為我國高血壓患病率最高的5個民族之一。其高血壓發(fā)病機制至今尚未完全闡明，但飲食因素可通過機體表觀遺傳學改變、DNA甲基化譜的改變導致機體對高血壓易感。

試者均系男性；平均年齡(54.7±2.7)歲；均無心腦血管疾??；18 kg/m2≤體質(zhì)指數(shù)(body mass index,BMI)<24 kg/m2。EH組納入標準：參照2012年高血壓防治指南中EH的診斷標準[8]，收縮壓≥160 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)或舒張壓≥100 mm Hg；正在服用降壓藥。

1.2 材料及儀器 DNA提取試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕，Illumina Human Methylation 450K BeadChip芯片(美國Illumina公司)，EZ DNA MethylationTMKit(德國 QIAGEN公司)；Illumina HiScan Microarray Scanner system芯片掃描儀(美國Illumina公司)，低溫離心機(美國SIGMA 公司)，魚躍-臺式血壓計(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 體格檢查和血樣本采集 體格檢查：測量身高、體質(zhì)量、血壓及腰圍。測量兩組受試者坐位右臂肱動脈血壓，共3遍，取平均值記錄。血樣本采集：采集兩組受試者晨起空腹肘正中靜脈血3 ml，5%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，室溫放置2 h后于-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 全基因組甲基化檢測

1.3.2.1 全基因組DNA的提取 采用DNA提取試劑盒對6份血樣本進行DNA提取。采用核酸蛋白測定儀檢測血樣本DNA濃度及純度，2%瓊脂凝膠電泳檢測DNA完整性，結(jié)果顯示全基因組DNA條帶清晰，無雜帶彌散帶，且OD260/OD280介于1.8～2.0，總量>5 μg，為合格DNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 亞硫酸氫鹽處理全基因組DNA 采用DNA CpG島甲基化修飾試劑盒(EZ DNA MethylationTMKit)對待測DNA樣品進行亞硫酸氫鈉修飾。

1.3.2.3 全基因組擴增、雜交、掃描 亞硫酸氫鈉修飾后每個樣本進行全基因組的擴增、斷裂、酶切片段；處理后的樣本采用PCR純化試劑盒進行純化、沉淀、重懸，后經(jīng)Illumina Human Methylation 450K BeadChip芯片上雜交、洗滌、延伸、染色、掃描等過程，獲得DNA甲基化信號。信號的采集與芯片結(jié)果分析采用GenomeStudio?甲基化分析系統(tǒng)。

1.4 原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制 DNA甲基化比例背景數(shù)值矯正采用Illumina Human Methylaion 450K BeadChip芯片內(nèi)置的標準對照位點。根據(jù)每個檢測位點的重復雜交探針熒光信號強度的分布情況來計算該位點準確檢出的P值，需去除任意樣本中P>10-5的位點及本身即是單核苷酸多態(tài)性(SNP)或探針覆蓋的區(qū)域內(nèi)存在SNP。

1.5 芯片數(shù)據(jù)的處理 采用R軟件minfi包對芯片的原始數(shù)據(jù)進行過濾、背景數(shù)值校正、數(shù)據(jù)歸一化等預處理；采用R軟件IMA包對樣本分組間的甲基化位點和甲基化區(qū)域的差異進行篩選。差異甲基化基因的篩選標準：采用beta值衡量該位點甲基化程度。beta值區(qū)間為(0,1)，越接近于1表示該位點甲基化程度越高，越接近于0表示該位點甲基化程度越低。差異甲基化位點的篩選條件包括：(1)與對照組比較P<0.05；(2)|beta.difference|>0.14。

1.6 統(tǒng)計學方法 芯片原始數(shù)據(jù)采用R軟件minfi包和IMA包進行數(shù)據(jù)處理，采用t檢驗方法對芯片數(shù)據(jù)處理后的差異甲基化位點進行組間篩選，按基因注釋分類將基因分為TSS1500、TSS200、5′UTR、1stExon、gene body和3′UTR 6個區(qū)域，差異甲基化位點篩選到上述6個區(qū)域內(nèi)。采用SAS統(tǒng)計學軟件對差異甲基化位點進行層次聚類(Hierarchical Clustering)。采用GoMiner數(shù)據(jù)庫進行生物信息學分析及Gene Ontology(GO)富集分析，采用KEGG數(shù)據(jù)庫進行Pathway分析。

2 結(jié)果

2.1 芯片數(shù)據(jù)及樣本的質(zhì)量控制 每個樣本均有2個密度峰值，未甲基化的密度峰值<0.2，甲基化的密度峰值>0.8；每個樣本的beta值密度曲線趨于一致；EH組與對照組的樣本在聚類分析后相似的樣本分別出現(xiàn)在不同的簇中(樣本分組符合試驗設(shè)計需求，見圖1，本文圖1～2彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。

注：1、2、3為EH組；6、7、9為對照組

圖1 EH組與對照組樣本基線數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制圖

Figure 1 Quality control charts of baseline data of EH and control group

2.2 差異甲基化位點及聚類分析 EH組和對照組間存在差異甲基化位點427個，其中高甲基化位點148個，低甲基化位點279個。按照基因注釋分類，TSS1500區(qū)域存在59個差異化位點；TSS200區(qū)域存在35個差異化位點；5′UTR區(qū)域和1stExon區(qū)域存在47個差異化位點；gene body區(qū)域存在86個差異化位點；3′UTR區(qū)域存在10個差異化位點。對差異甲基化位點的beta值進行層次聚類分析發(fā)現(xiàn)，EH組存在較多高甲基化位點，而對照組存在較多低甲基化位點(見圖2)。

圖2 EH組與對照組樣本差異甲基化位點聚類圖

Figure 2 Clustering charts of differential methylated sites of EH and control group

2.3 差異甲基化位點的染色體分布 染色體定位分析可以挖掘高甲基化或低甲基化的基因是否有染色體的偏向性或成簇分布的特點，將樣本分組間差異甲基化位點定位在染色體上，427個差異甲基化位點位于不同的染色體上，在1號染色體發(fā)現(xiàn)的差異甲基化位點最多，共41個，其次為6號染色體，共36個，再次是19號染色體，共32個；Y染色體未發(fā)現(xiàn)差異甲基化位點(見圖3)。

2.4 DNA差異甲基化基因GO富集分析和Pathway分析 GO富集分析顯示，差異甲基化基因主要參與糖蛋白生物合成過程、糖蛋白代謝過程、血管發(fā)育、脈管系統(tǒng)發(fā)展、膠原蛋白結(jié)合等多個生物過程(見表1)。同時，Pathway分析顯示，差異甲基化基因主要參與了硫酸軟骨素生物合成、胰島素信號通路、胞吞等(見表2)。

3 討論

表觀遺傳的修飾不涉及DNA堿基序列的改變，能導致基因表達的可遺傳性變化，如DNA甲基化或組蛋白的乙?；萚9-11]。DNA異常甲基化成為心腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展的重要原因，而EH又是心腦血管疾病最重要的危險因素，已成為目前研究的熱點[12]。在EH的致病因素中，全基因組許多調(diào)控基因的信息會因表觀遺傳學修飾的改變而改變，在基因序列未改變的情況下導致啟動子、增強子等重要調(diào)控元件DNA甲基化，影響和調(diào)節(jié)基因的功能和特性，控制基因表達的時間、空間位置和表達方式。本研究從全基因組角度，探測哈薩克族EH患者DNA甲基化水平，并篩選甲基化位點，了解引發(fā)EH的相關(guān)基因參與分子功能、代謝過程、細胞組成等多個生物過程的作用，探尋其促進血管應激反應、調(diào)節(jié)細胞的吞吐及活力、促進組織細胞修復和血管功能構(gòu)建的表觀遺傳學過程，以利于解決EH的發(fā)病、恢復問題，并為其發(fā)病的細胞和分子機制研究提供理論依據(jù)[13-15]。

圖3 差異甲基化位點在染色體的分布情況

Table 1 GO enrichment analysis of differential methylated gene in EH group

涉及通路數(shù)量P值Benjamini值GO:0009101:糖蛋白生物合成過程a90.0014790.833960GO:0009100:糖蛋白代謝過程a100.0018470.674114GO:0001568:血管發(fā)育a110.0020040.555577GO:0001944:脈管系統(tǒng)發(fā)展a110.0023960.516900GO:0007155:細胞黏附200.0033800.560177GO:0022610:生物黏附200.0034330.501043GO:0070085:糖基化70.0082710.762870GO:0006486:蛋白氨基酸的糖基化70.0082710.762870GO:0043413:生物大分子的糖基化70.0082710.762870GO:0035295:血管的發(fā)展90.0108250.808013GO:0005518:膠原蛋白結(jié)合a40.0143950.997767GO:0007568:老化60.0175020.907424GO:0005976:多糖代謝過程60.0181300.891326GO:0034199:激活蛋白激酶A的活性30.0221070.915000GO:0005246:鈣通道調(diào)節(jié)活性30.0238670.993810GO:0043062:細胞外結(jié)構(gòu)組織70.0245770.919165GO:0004672:蛋白激酶活性160.0266040.977267GO:0035239:血管形態(tài)發(fā)生60.0302750.943215

注：a表示與EH發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切的生物學過程

表2 EH組差異甲基化基因Pathway分析

本研究運用DNA甲基化芯片的方法檢測EH患者與健康受試者全血DNA差異甲基化位點，同時對差異甲基化基因進行GO富集分析和Pathway分析，共發(fā)現(xiàn)427個差異甲基化位點，初步建立了哈薩克族EH異常甲基化譜，但構(gòu)建的哈薩克族EH異常甲基化譜在實際應用前仍需進行大樣本量的驗證。與對照組比較，EH患者DNA甲基化程度無論在CpG島還是在啟動子區(qū)，均呈現(xiàn)出明顯的差異甲基化，即EH患者啟動子區(qū)CpG島整體表現(xiàn)為高甲基化狀態(tài)。導致這些啟動子區(qū)發(fā)生高甲基化的重要基因主要有3大類：一是糖蛋白生物合成和代謝基因，包括甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(diacylgycerol acyltransferase,DGAT)、N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶9(polypeptide N-acetylgalactosaminyl transferase 9,GALNT9)等，這些基因?qū)χ敬x、脂類沉積和血脂水平有很大影響；二是與血管、脈管系統(tǒng)發(fā)展相關(guān)的基因，包括血管內(nèi)皮細胞生長因子受體1(vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR1/FLT1)、同源框轉(zhuǎn)錄因子2(caudal-type homeobox transcription factor 2,CDX2)、Meox家族中的Meox2等，這些基因參與了血管平滑肌細胞(VSMC)和心肌細胞周期的調(diào)控作用，在心血管系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮作用[16-17]；三是與蛋白酶、鈣通道及代謝相關(guān)的基因，如長鏈酯酰輔酶A合成酶家族3(long chain acyl-CoA synthetase 3,ACSL3)等。

在差異甲基化基因Pathway分析中還發(fā)現(xiàn)，差異甲基化基因主要涉及的通路包括：(1)硫酸軟骨素生物合成通路作為最積極的部分作用于哈薩克族EH患者的發(fā)病及病情進展中，分析原因為硫酸軟骨素廣泛存在于人的軟骨組織中，哈薩克族人群高鹽高脂飲食，而硫酸軟骨素可以清除體內(nèi)血液中的脂質(zhì)和脂蛋白，清除膽固醇，并增加脂質(zhì)和脂肪酸在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)換率；參與其中的主要基因包括XYLT1、UST、CHST3、DSE。(2)正常生理狀態(tài)下，胰島素可以通過磷酸肌醇3-激酶(PI-3K)途徑促進血管舒張及生存，同時還通過有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑促進血管收縮并致有絲分裂，當胰島素抵抗時，PI-3K途徑轉(zhuǎn)導的胰島素信號變遲緩，但MAPK級聯(lián)反應途徑的信號依然如常，這些不平衡會使胰島素抵抗者患EH及動脈粥樣硬化的風險更高[18]。本研究結(jié)果也表明，胰島素信號通路中的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在心血管系統(tǒng)中有表達，對EH的作用明顯，涉及的基因包括CBLC、SOCS2、PYGL、PRKAR1B、RHEB、MAPK10、RPTOR。(3)胞吞作用在血管內(nèi)皮細胞的遷移、血管組織損傷的修復及炎癥發(fā)生等過程中發(fā)揮重要的作用，涉及的基因主要包括CBLC、FLT1、TGFBR1、MET、GRK5、IQSEC3、RAB11FIP1、CSF1R。

綜上所述，基因芯片在技術(shù)可靠性得到保證的基礎(chǔ)上，具有高靈敏度、高通量等特點，本研究表明EH患者DNA啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)會發(fā)生改變，初步探索了DNA差異甲基化在EH中的作用，分析哈薩克族EH患者DNA甲基化基因顯示，XYLT1、UST、CHST3、DSE、CBLC等差異甲基化基因與多條EH相關(guān)通路有關(guān)，本研究僅是哈薩克族EH全基因組甲基化譜的開端，作為EH的候選分子標志物，若要獲得更全面、更精確的結(jié)果，還需要進一步擴大樣本量進行分析及驗證，為將來更好得研究哈薩克族EH的細胞信號轉(zhuǎn)導通路、多個基因、蛋白、代謝產(chǎn)物及疾病發(fā)生提供基礎(chǔ)依據(jù)。

作者貢獻：由淑萍進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，由淑萍、從美麗、倪國華、詹懷峰、王紅軍、金晶、馬登娥、葉力夏提、趙志強、蔣紅、劉濤進行研究的實施與可行性分析；由淑萍、倪國華、詹懷峰、王紅軍、金晶、馬登娥、葉力夏提、趙志強進行數(shù)據(jù)收集，由淑萍、趙志強、蔣紅進行數(shù)據(jù)整理，由淑萍、趙志強進行統(tǒng)計學處理，由淑萍、從美麗、蔣紅進行結(jié)果的分析與解釋，由淑萍、從美麗、趙志強、蔣紅進行論文撰寫，由淑萍、從美麗進行論文修訂，由淑萍、從美麗、蔣紅、劉濤負責文章的質(zhì)量控制及審校，由淑萍、從美麗對文章負責。

本文無利益沖突。

志謝：感謝新疆烏魯木齊縣甘溝鄉(xiāng)衛(wèi)生院、水西溝鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院、小渠子鄉(xiāng)衛(wèi)生院、板房溝衛(wèi)生院全體醫(yī)務人員的大力支持和配合。

本研究不足之處：

環(huán)境危險因素如何通過調(diào)控機體遺傳學特征，特別是表觀遺傳學特征，導致新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓病高發(fā)的機制尚未進行深入研究，將作為下一步的研究內(nèi)容。

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(本文編輯：毛亞敏)

Blood Screening for DNA Methylation Sites and Construction of Aberrant Methylation Profile in Kazak Essential Hypertensive Patients

YOUShu-ping1,CONGMei-li2,NIGuo-hua3,ZHANHuai-feng4,WANGHong-jun5,JINJing6,MADeng-e7,YELIXIATI4,ZHAOZhi-qiang1,JIANGHong1,LIUTao8*

1.SchoolofNursing,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000，China2.MedicalLaboratoryAnimalCenter,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China3.TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China4.GangouHospital,UrumqiCounty,Urumqi830000,China5.XiaoquziHospital,UrumqiCounty,Urumqi830000,China6.ShuixigouCenterHospital,UrumqiCounty,Urumqi830000,China7.BanfanggouCenterHospital,UrumqiCounty,Urumqi830000,China8.SchoolofPublicHealth,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054，China

Objective To screen aberrant DNA methylation sites of Kazak essential hypertension(EH) by using gene chip technique，and construct Kazak EH aberrant methylation profiles preliminarily，so as to provide a theoretical basis for intensive study of the mechanism of Kazak EH.Methods From June 2014 to October 2015,using random sampling method,3 042 Kazak herdsmen or semi-nomads were selected as the participants of this study from Urumqi County.Of them,1 487 had EH.And from the 1 487 EH patients,3 were randomly selected as the EH group,and other 3 age-matched healthy volunteers as the control group.Using Illumina Human Methylation 450K BeadChip,we measured the whole blood of all subjects for detecting DNA methylation and screening the aberrant methylation sites of DNA.We analyzed the function of abnormal methylation genes by using Gene Ontology(GO) enrichment analysis and Pathway analysis.Results There were 427 significantly differential methylated sites in EH and normal groups,where in 148 high methylation sites,279 low methylation sites;these sites were located on different chromosomes;among them,chromosome 1 and chromosome 6 were the most,no differential methylated site was found in Y chromosome.GO enrichment analysis showed that aberrant methylation genes mainly involved in the processes of glycoprotein biosynthesis and metabolism,vascular development,vasculature development,collagen binding and so on.Pathway analysis demonstrated that aberrant methylation genes mainly played a part in chondroitin sulfate biosynthesis,insulin signaling pathway,endocytosis and so forth.Conclusion The occurrence of EH involves in the changes in DNA methylation status.A number of differential methylated genes are related with EH associated signaling pathway.This study is only the beginning of construction of Kazak EH genome methylation profile,and the obtained aberrant methylation gene can be considered as a candidate early risk molecular marker of EH.However,more comprehensive and accurate study results need the analysis and verification of a larger sample.

Hypertension;Kazak;DNA methylation;Gene chip

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金資助項目(2015211C020)

R 544.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.06.009

2016-08-21；

2016-11-29)

1.830000新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學護理學院

2.830054新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心

3.830054新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院

4.830000新疆烏魯木齊市烏魯木齊縣甘溝鄉(xiāng)衛(wèi)生院

5.830000新疆烏魯木齊市烏魯木齊縣小渠子鄉(xiāng)衛(wèi)生院

6.830000新疆烏魯木齊市烏魯木齊縣水西溝鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院

7.830000新疆烏魯木齊市烏魯木齊縣板房溝鄉(xiāng)中心衛(wèi)生院

8.830054新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院

*通信作者：劉濤，教授；E-mail：xjmult@163.com

*Correspondingauthor:LIUTao，Professor；E-mail：xjmult@163.com