李法君

(山東省濰坊科技學(xué)院 262700)

啟動(dòng)子(promoter)是一段位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游，提供RNA聚合酶識別和結(jié)合的DNA序列，長度因生物種類而異， 一般不超過200 bp。它是典型的順式作用元件，與轉(zhuǎn)錄因子(反式作用因子)相結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)的水平、部位及方式。本文介紹了啟動(dòng)子的相關(guān)知識，以便于全面清晰地認(rèn)識啟動(dòng)子。

1 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)

1.1 原核生物的啟動(dòng)子 一般長度為20～200 bp，通常由4部分組成[1]：①轉(zhuǎn)錄起始序列CAT：為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；②pribnow box(-10區(qū))：其共有序列為TATAAT，是 RNA 聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)；③sextama box(-35區(qū))：其共有序列是 TTGACA，是 RNA 聚合酶的識別位點(diǎn)；④間隔區(qū)：為pribnow box與sextama box之間的區(qū)域，當(dāng)兩者的中心位置相距16～18 bp時(shí)，該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄功能較強(qiáng)，而當(dāng)兩者的中心位置之間的距離比這更近或更遠(yuǎn)時(shí)，起始轉(zhuǎn)錄的功能均會(huì)減弱。

1.2 真核生物的啟動(dòng)子 根據(jù)真核基因編碼的產(chǎn)物和RNA 聚合酶的種類，可把真核生物的啟動(dòng)子分為三類：rRNA基因啟動(dòng)子(Ⅰ型)、mRNA 基因啟動(dòng)子(Ⅱ型)和 tRNA 基因啟動(dòng)子(Ⅲ型)。 Ⅰ型啟動(dòng)子和Ⅲ型啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)簡單。Ⅱ型啟動(dòng)子相對復(fù)雜，包括4個(gè)主要部位[2]：①轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)：其堿基大多為A；②TATA box：為真核生物啟動(dòng)子的核心元件，其共有序列為TATA(A/T)A(A/T)，由富含AT的7個(gè)核苷酸構(gòu)成，它的功能與原核啟動(dòng)子pribnow box相似，能決定 RNA 聚合酶Ⅱ的位置，控制轉(zhuǎn)錄起始的準(zhǔn)確性及效率；③CAAT box：其共有序列為GGNCAATCT，為RNA聚合酶Ⅱ的一個(gè)結(jié)合點(diǎn)，控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率；④增強(qiáng)子序列：能提高轉(zhuǎn)錄的速率。

2 啟動(dòng)子的分類

依據(jù)轉(zhuǎn)錄模式的不同，啟動(dòng)子可分為：①組成型啟動(dòng)子：在該類型啟動(dòng)子控制下，結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄大致恒定在一定水平上，在不同組織、部位表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異，如花椰菜花葉病毒的啟動(dòng)子；②組織特異啟動(dòng)子：又稱器官特異性啟動(dòng)子。在這類啟動(dòng)子調(diào)控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達(dá)，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性，如煙草的花粉絨氈層細(xì)胞中特異表達(dá)基因的啟動(dòng)子；③誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：是指在某些特定的物理或化學(xué)信號的刺激下，該種類型的啟動(dòng)子可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平，如光誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、熱誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子和真菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子等。

3 啟動(dòng)子功能的研究方法

3.1 生物信息學(xué)預(yù)測 啟動(dòng)子作為調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的重要元件，目前主要是通過生物信息學(xué)對其結(jié)構(gòu)特征、轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)及其結(jié)合因子進(jìn)行預(yù)測。常用的預(yù)測軟件包括[3]FirstEF(人的啟動(dòng)子預(yù)測)、BDGP(果蠅的啟動(dòng)子預(yù)測)、BIMAS(真核生物的啟動(dòng)子預(yù)測)、CONSITE(轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測)、TRES(轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子分析)、TESS(轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測)、TRRD(真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域分析)、Gene-Regulation(真核生物轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測)和TRANSFAC(真核生物轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測)等。筆者曾借助Gene-Regulation軟件分析了日本沼蝦胰島素樣促雄性腺激素基因的啟動(dòng)子序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等[4]。

3.2 酵母單雜交實(shí)驗(yàn) 酵母單雜交技術(shù)的基本原理為：真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域組成。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL 4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，GAL 4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)。GAL 4的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，GAL 4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用?；诖?，可將GAL 4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為文庫蛋白編碼基因，只要其表達(dá)的蛋白能與目的基因相互作用，同樣可通過轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶，啟動(dòng)下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。例如，Rishmawi等[5]在擬南芥中通過酵母單雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)WRKY75 蛋白可與 CAPRICE 基因的啟動(dòng)子序列結(jié)合，調(diào)控后者的表達(dá)。

3.3 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)分析 ChIP也稱結(jié)合位點(diǎn)分析法，其原理是在生理?xiàng)l件下將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)，并在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物，之后再用超聲波將所得的復(fù)合物隨機(jī)切割成不同長度的染色質(zhì)片段并沉淀之，最后富集、純化及其鑒定特異性目的蛋白結(jié)合的DNA片段，從而獲得蛋白質(zhì)和DNA相互作用的信息。由ChIP衍生的染色質(zhì)免疫共沉淀-芯片(ChIP-chip)技術(shù)和與第二代測序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-seq 技術(shù)是目前在啟動(dòng)子研究領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的兩種技術(shù)。Lei等[6]在模式生物線蟲中同時(shí)運(yùn)用ChIP-chip和ChIP-seq技術(shù)證實(shí)，HLH-1蛋白可以與多個(gè)基因的啟動(dòng)子序列的E-box區(qū)域結(jié)合。

3.4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法 該方法的原理是通過一定的轉(zhuǎn)染程序?qū)⒑瑔?dòng)子序列(調(diào)控區(qū))的質(zhì)粒導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞。在正常情況下，調(diào)控區(qū)會(huì)調(diào)控“報(bào)告基因”的表達(dá)。報(bào)告基因是一類在mRNA和蛋白質(zhì)分子中均容易被檢測的基因。含“報(bào)告基因”的質(zhì)粒在培養(yǎng)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄后，可在特定時(shí)刻測定其生產(chǎn)的mRNA或相應(yīng)的蛋白質(zhì)來評價(jià)調(diào)控區(qū)的活性。所以，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法通常用來測定啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的高低。Zi等[7]將豬FUT1基因的5′側(cè)翼序列構(gòu)建到含p-GL3 啟動(dòng)子的報(bào)告基因載體中，進(jìn)而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞，結(jié)果顯示啟動(dòng)子序列的1150～849 bp部分是FUT1 基因的重要調(diào)控區(qū)。

3.5 凝膠阻滯分析 又稱為電泳遷移率分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)。其基本原理是：蛋白質(zhì)與末端標(biāo)記的核酸探針結(jié)合后所形成的復(fù)合物的電泳遷移速度比無蛋白結(jié)合的核酸探針要慢。該方法可以檢測核酸(DNA或RNA)與結(jié)合蛋白的相互作用，已經(jīng)被用于鑒定啟動(dòng)子的結(jié)合蛋白。Seluk等[8]用 EMSA方法證明轉(zhuǎn)錄因子Elk1 能夠結(jié)合到KATNB1基因啟動(dòng)子上，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。

4 啟動(dòng)子的甲基化與多態(tài)性

4.1 啟動(dòng)子的甲基化 DNA甲基化是指在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA的CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，多見于基因啟動(dòng)子序列的CpG島。啟動(dòng)子甲基化調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制可能是啟動(dòng)子甲基化的區(qū)域能夠與DNA 結(jié)合蛋白相互結(jié)合，通過改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象或者占據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)而阻斷轉(zhuǎn)錄因子與順式元件的結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。FHIT基因是重要的腫瘤抑制基因。研究表明肺癌中FHIT基因啟動(dòng)子序列甲基化率明顯高于正常肺組織，提示甲基化抑制FHIT基因的表達(dá)可能是肺癌發(fā)生的原因之一[9]。

4.2 啟動(dòng)子的多態(tài)性 啟動(dòng)子的多態(tài)性主要是指在基因組DNA水平上由于單個(gè)核苷酸的變異所引起的啟動(dòng)子序列多態(tài)性。啟動(dòng)子多態(tài)性調(diào)控基因表達(dá)的原理可能是：單個(gè)核苷酸的變異引起轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的改變，進(jìn)而影響基因的表達(dá)，并最終影響生物體的性狀。研究表明，務(wù)川黑牛STAT3基因啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)；相關(guān)性分析表明，A-322G位點(diǎn)對務(wù)川黑牛體重有極顯著影響，其中AG基因型的個(gè)體表現(xiàn)為更出色的體重性狀[10]。

5 展望

基因的表達(dá)調(diào)控是多因素、多層次綜合作用的結(jié)果，啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控中心一直是研究的熱點(diǎn)，雖然相關(guān)研究已經(jīng)取得眾多研究成果。但是也應(yīng)認(rèn)識到，現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)手段和方法的局限性以及不同物種啟動(dòng)子的復(fù)雜性，使得人們還不能十分清晰地了解啟動(dòng)子。相信隨著新的分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，啟動(dòng)子的功能必然會(huì)得到全面的揭示。

(基金項(xiàng)目：山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃項(xiàng)目,No. J16LE59；山東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目，No.2016ZRCM12)