范志剛，覃西，吳軍，黃聰聰，何蟬伊，符瑞祥，周利民，李斯

(1.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，海南 海口 571199;2.海南醫(yī)學(xué)院熱帶病重點實驗室，熱帶病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室(籌備教育部重點實驗室)，海南 ?？?571199；3.海南省腫瘤醫(yī)院檢驗科，海南 ?？?570100；4.海南省腫瘤醫(yī)院胸外科，海南 ?？?570100；5.海南醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心，海南 ?？?571199；6.海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院心理學(xué)教研室，海南 ?？?570216)

·經(jīng)驗交流·

水樣糞便中糞類圓線蟲幼蟲的收集方法

范志剛1,2，覃西3，吳軍4，黃聰聰4，何蟬伊1，符瑞祥1，周利民5，李斯6

(1.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，海南 海口 571199;2.海南醫(yī)學(xué)院熱帶病重點實驗室，熱帶病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室(籌備教育部重點實驗室)，海南 ?？?571199；3.海南省腫瘤醫(yī)院檢驗科，海南 ?？?570100；4.海南省腫瘤醫(yī)院胸外科，海南 ?？?570100；5.海南醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心，海南 ?？?571199；6.海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院心理學(xué)教研室，海南 ?？?570216)

糞類圓線蟲；幼蟲；收集

糞類圓線蟲(Strongyloides stercoralis)是一種兼性寄生蟲，可以引起人獸共患寄生蟲病，并可在宿主體內(nèi)自體感染、播散性超度感染[1-2]。該蟲引起的人類疾病易被忽略而誤診、漏診。一旦患者免疫力下降或受損，該蟲大量增殖，可導(dǎo)致患者全身播散性感染，全身各器官衰竭，甚至死亡[1-2]。2017年2月13日在海南省腫瘤醫(yī)院一名67歲男性患者水樣糞便中發(fā)現(xiàn)糞類圓線蟲幼蟲。為開展后續(xù)DNA和RNA的提取等研究，需要從患者水樣糞便中分離其幼蟲。蠕蟲幼蟲收集常用方法有貝爾曼氏法、平皿法、Koga法等方法，其中貝爾曼氏法和Koga法適用于糞類圓線蟲幼蟲收集[3-4]。這幾種方法主要用于從成形糞便中收集幼蟲的病原學(xué)檢測，不適合用于從水樣糞便中收集糞類圓線蟲幼蟲，其次它們的收集物中有雜質(zhì)，不利于開展后續(xù)糞類圓線蟲幼蟲DNA和RNA的提取等研究。因此，為從患者水樣糞便中收集無雜質(zhì)的糞類圓線蟲幼蟲，探索采用綜合方法收集。

1 資料與方法

1.1 對象及糞便收集 海南省腫瘤醫(yī)院67歲男性患者水樣糞便。家屬將3個塑料袋分層套在便盆上，患者大便入塑料袋中。

1.2 幼蟲收集 采用離掏濾法(簡稱CWF法)，即離心沉淀法、改良淘洗法和改良鉤蚴培養(yǎng)法這三種方法聯(lián)合收集幼蟲。將收集的大便分次轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，2 000 r/min離心10 min，收集沉淀，標記為“樣本1”。采用生理鹽水或雙蒸水混勻沉淀，2 000 r/min離心10 min，重復(fù)此步驟到混合液澄清為止，2000 r/min離心10 min，收集沉淀，標記為“樣本2”，待用。將濾紙剪成寬度與500 mL燒杯等寬的T型或者長方形。用少許生理鹽水或雙蒸水混勻待用沉淀，滴加在濾紙中部，放入500 mL燒杯中，濾紙上端采用固定方法固定在燒杯口上方。用生理鹽水或雙蒸水沿燒杯壁加入，至濾紙底部0.5～1 cm，不接觸沉淀混合物為宜。室溫放置。每隔1～2 h觀察液面。根據(jù)觀察情況，收集燒杯中的液體于15 mL離心管中，2 000 r/min離心10 min，收集沉淀。采用雙蒸水混勻沉淀，2 000 r/min離心10 min，重復(fù)此步驟2～3次，保存沉淀，標記為“樣本3”，待用。

1.3 幼蟲檢查 根據(jù)沉淀多少，分別用1～5 mL生理鹽水稀釋取樣本1、樣本2和樣本3，混勻后，取一滴采用直接涂片法，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

樣本1糞樣直接離心后收集的幼蟲中有很多雜質(zhì)，樣本2離心+淘洗后收集的幼蟲中也有雜質(zhì)，樣本3離心+淘洗+濾紙分離后收集的幼蟲中無雜質(zhì)。

3 討論

糞類圓線蟲可怕之處是其具有機會致病性，并可自體感染和播散性超度感染?；颊呙庖吡φr，該蟲引起的臨床癥狀輕，易被忽略而導(dǎo)致誤診、漏診。一旦患者免疫力下降或受損，該蟲大量增殖，可導(dǎo)致患者全身播散性感染，造成全身各器官衰竭，甚至死亡。更可怕的是基層醫(yī)院檢驗醫(yī)生和臨床醫(yī)生對其知之甚少以及醫(yī)院所用病原學(xué)檢驗方法檢出率有限。目前，我們幫忙鑒定蟲，大多數(shù)是因為患者感染蟲數(shù)多而被檢驗醫(yī)師發(fā)現(xiàn)。就第一次全國人體寄生蟲分布調(diào)查報告顯示海南省居民糞類圓線蟲感染率居全國之首，感染率為1.091%[1]，2007年至今，海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和海南省腫瘤醫(yī)院確診的糞類圓線蟲病例主要由我們鑒定蟲種確定的。因此，臨床檢驗需要有新的簡易的檢出率高的檢查糞類圓線蟲的方法。為此，課題組2017年2月13日和14日收集了海南省腫瘤醫(yī)院一名67歲男性患者水樣糞便，欲從中分離糞類圓線蟲幼蟲開展后續(xù)研究，為研發(fā)新的檢測方法研究奠定基礎(chǔ)。

經(jīng)過分析，課題組改良了淘洗法和鉤蚴培養(yǎng)法。改良的淘洗法沒有用篩網(wǎng)，改良的鉤蚴培養(yǎng)法將試管改為燒杯。從水樣糞便中分離糞類圓線蟲幼蟲采用了離掏濾法，即結(jié)合了離心沉淀法、改良淘洗法和改良鉤蚴培養(yǎng)法這三種方法于一體。離掏濾法不僅區(qū)別于蠕蟲幼蟲收集常用方法貝爾曼氏法、平皿法和Koga法方法，也區(qū)別于離心沉淀法、淘洗法和鉤蚴培養(yǎng)法。貝爾曼氏法、平皿法和Koga法方法這三種方法主要適用于成形糞便中收集幼蟲，而不適合用于從水樣糞便中收集幼蟲，并且這三種方法收集物中有雜質(zhì)，不利于開展后續(xù)DNA和RNA的提取等研究。離心沉淀法和淘洗法同樣無法去除雜質(zhì)，不利于開展后續(xù)DNA和RNA的提取等研究。試管鉤蚴培養(yǎng)法主要用于幼蟲的病原學(xué)檢查，不適用于從大量水樣糞便中收集幼蟲，這需要大量的試管。將離心沉淀法、改良淘洗法、改良鉤蚴培養(yǎng)法進行有機組合，可以獲得沒有雜質(zhì)的糞類圓線蟲，優(yōu)于以上各種方法，并可以用于貝爾曼氏法、平皿法和Koga法方法這三種方法去除雜質(zhì)的后續(xù)工作，方便后續(xù)DNA和RNA的提取等研究。

[1]吳觀陵,溫廷桓,胡孝素,等.人體寄生蟲學(xué)[M].4版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:571-573.

[2]諸欣平,蘇川.人體寄生蟲學(xué)[M].8版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2015:168-171.

[3]杜尊偉,姜進勇,Peter Steinmann,等.不同檢測方法對糞類圓線蟲鉤蟲檢出率的比較[J].中國血吸蟲病防治雜志,2009,21(1):64-66.

[4]姜進勇,杜尊偉,王學(xué)忠,等.云南省勐?？h居民糞類圓線蟲感染調(diào)查[J].中國病原生物學(xué)雜志,2008,3(3):242,202.

R532.1

B

1003—6350（2017）22—3764—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.22.051

國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(編號：201511810012)；海南省自然基金項目(編號：20158368)；海南醫(yī)學(xué)院培育基金(編號：HY2015-14、HY2016-12)；海南醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(編號：HYXC2014019)；?？谑袘?yīng)用技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目(編號：2014-60)

李斯。E-mail：lisibei52@163.com

2017-03-02)