萬安琪，蔣繼志，沙海天，李 穎，王蓓蓓，金 鑫，張亞輝

(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

拮抗細菌W-7的鑒定及其對致病疫霉的抑制作用

萬安琪，蔣繼志*，沙海天，李 穎，王蓓蓓，金 鑫，張亞輝

(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

為明確分離純化自馬鈴薯晚疫病病葉上的一株對致病疫霉菌絲生長有明顯抑制作用的細菌W-7的分類地位、抑菌作用及其防病潛力，采用傳統(tǒng)方法和16S rDNA序列分析相結(jié)合對該菌株進行鑒定，以平板對峙法和打孔法分別測定細菌活體、菌液和無菌體發(fā)酵液以及不同濃度菌液的抑菌作用，顯微鏡觀察該菌株對病菌菌體形態(tài)的影響，并采用塊莖切片法評價菌液的離體防病效果。結(jié)果表明，綜合菌落特征、生理生化特性以及16S rDNA序列分析結(jié)果，初步確定W-7菌株為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)；該菌株菌液的抑菌作用最強，抑菌率達到94.44%，菌液能使致病疫霉菌絲變形；將菌液稀釋至原液濃度的25%后，抑菌率仍能達到87.65%，其在馬鈴薯塊莖切片上對晚疫病的預(yù)防效果為73.40%。拮抗細菌W-7在防治馬鈴薯晚疫病方面具有一定潛力。

致病疫霉； 拮抗細菌； 短小芽孢桿菌； 鑒定； 抑制作用

馬鈴薯是世界四大糧食作物之一，其種植面積和產(chǎn)量均在逐年增加。隨著近年我國馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的確立，馬鈴薯將成為我國繼水稻和小麥之外的又一主糧。預(yù)計到2020年，我國50%以上的馬鈴薯將作為主糧消耗[1]。此外，馬鈴薯淀粉及其衍生物廣泛應(yīng)用于造紙、紡織、醫(yī)藥、化工等多個領(lǐng)域，具有很高的經(jīng)濟價值。但隨著全球馬鈴薯種植面積的不斷擴大，特別是在其生長季節(jié)降水充沛的馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)，馬鈴薯病害逐年加重，其中由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的晚疫病已被公認為世界第一大作物病害[2]。致病疫霉屬于卵菌中水生與陸生群體的過渡類型，寄生性很強又可人工培養(yǎng)，生理分化與變異頻繁，加之A2交配型在世界各地相繼出現(xiàn)[3]，有性生殖概率大幅度上升，導(dǎo)致生理小種類型已由單一基因型轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)合基因型，且已經(jīng)出現(xiàn)了能克服生產(chǎn)中現(xiàn)有11個抗晚疫病基因(R1—R11)的超級生理小種(1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11)[4]，同時抗藥性也在不斷增強[5]。這給當(dāng)前生產(chǎn)中主要依靠化學(xué)農(nóng)藥防治該病帶來了巨大挑戰(zhàn)。因此，探討防治該病的新途徑或新措施迫在眉睫，其中篩選和利用拮抗微生物抑制致病疫霉進而防治馬鈴薯晚疫病，或者將生防菌或生防制劑與農(nóng)業(yè)栽培、化學(xué)農(nóng)藥等構(gòu)建成集成化防病措施正在受到許多學(xué)者的關(guān)注[6]。已報道的致病疫霉拮抗菌主要分離自蔬菜地或馬鈴薯根際土壤[7-8]，筆者所在的河北大學(xué)微生物系統(tǒng)學(xué)與生物多樣性研究實驗室在前期研究中也篩選出了多株顯著抑制致病疫霉生長的拮抗菌[7-9]，但這些菌株的抑菌作用不夠穩(wěn)定，尤其是不易在馬鈴薯植株中定殖，限制了對這些菌株的進一步研究和利用。迄今，從馬鈴薯植株分離致病疫霉拮抗菌的報道還比較少[8]。W-7菌株是河北大學(xué)微生物系統(tǒng)學(xué)與生物多樣性研究實驗室從馬鈴薯晚疫病病葉上分離純化致病疫霉菌株過程中獲得的一株細菌，其對致病疫霉菌絲生長有很強的抑制作用，本試驗對該菌株進行初步鑒定，并測定其活體菌株、菌液及無菌體發(fā)酵液對致病疫霉的抑制作用和離體防病效果，為揭示該菌株的抑菌特性和防病潛力提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

致病疫霉W101菌株為河北大學(xué)微生物系統(tǒng)學(xué)與生物多樣性研究實驗室分離鑒定并保存的菌株，細菌W-7菌株為河北大學(xué)微生物系統(tǒng)學(xué)與生物多樣性研究實驗室前期從內(nèi)蒙古自治區(qū)克山農(nóng)場馬鈴薯晚疫病病葉上分離純化保存的菌株。

1.2 菌株培養(yǎng)特性、革蘭氏染色及形態(tài)特征的觀察

在LB培養(yǎng)基、高氏1號培養(yǎng)基、KMB培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上對W-7進行劃線培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)72 h后觀察其生長及培養(yǎng)特性；挑取在LB培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)24 h的W-7菌落進行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)；同時，將W-7接種于LB液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)12 h后稀釋并涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)72 h，觀察其菌落形態(tài)。

1.3 菌株生理生化試驗

參照文獻[10-11]測定W-7菌株的主要生理生化特性，包括觸酶反應(yīng)、淀粉水解、硝酸鹽還原、吲哚產(chǎn)生、V-P反應(yīng)、馬尿酸鹽水解、明膠水解、葡萄糖產(chǎn)酸、葡萄糖產(chǎn)氣、木糖產(chǎn)酸、甘露醇產(chǎn)酸、檸檬酸鹽利用等。

1.4 菌株16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

將W-7菌株送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行16S rDNA序列測定，序列提交至NCBI網(wǎng)站，獲取該序列的登錄號。將測序結(jié)果進行BLAST比對，下載與W-7菌株相似性達到95%以上菌株的16S rDNA序列。采用ClustalX軟件進行序列比對，將比對結(jié)果導(dǎo)入Mega 5.0軟件，用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 活體菌株、菌液及無菌體發(fā)酵液對致病疫霉抑菌活性的測定

參照文獻[8-9]的方法制備W-7菌株的活體、菌液及無菌體發(fā)酵液。采用對峙培養(yǎng)法測定活體菌株對致病疫霉的抑制作用，在致病疫霉菌餅(直徑9 mm)兩側(cè)20 mm處分別接一環(huán)W-7菌株，以單獨培養(yǎng)致病疫霉為對照；采用打孔法分別測定菌液和無菌體發(fā)酵液的抑菌活性[8]，在致病疫霉菌餅兩側(cè)20 mm處打孔，孔中加入50 μL菌液或無菌體發(fā)酵液，以加入等體積LB液體培養(yǎng)基為對照。試驗重復(fù)3次，20 ℃培養(yǎng)7～10 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，統(tǒng)計抑菌率。

抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100%。

1.6 不同濃度W-7菌液對致病疫霉的抑制作用測定

W-7菌株的菌液(原液)用液體LB培養(yǎng)基稀釋，兩者體積比分別設(shè)為0∶1、1∶3、1∶1、3∶1、1∶0，稀釋后的濃度分別為原液濃度的0、25%、50%、75%、100%，以打孔法測定不同濃度菌液的抑菌作用[9]。試驗重復(fù)3次，20 ℃培養(yǎng)7～10 d后統(tǒng)計抑菌率。

1.7 菌液在離體塊莖上的防病作用測定

參照蔣繼志等[8]的方法在馬鈴薯塊莖表面滴加20 μL 25%的W-7菌株菌液，對照組滴加等體積液體LB培養(yǎng)基，20 ℃培養(yǎng)2 d后接種致病疫霉菌餅(9 mm)，20 ℃培養(yǎng)5～7 d，根據(jù)文獻[12]統(tǒng)計病情指數(shù)，計算其病害預(yù)防效果。

1.8 菌液對致病疫霉菌絲形態(tài)的影響觀察

用已滅菌的牙簽挑取與25%的W-7菌株菌液對峙培養(yǎng)后受抑制的致病疫霉菌落邊緣的菌絲體，顯微鏡觀察菌絲形態(tài)，并與正常致病疫霉菌絲進行對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 W-7菌株培養(yǎng)特性、菌落特征及革蘭氏染色結(jié)果

將W-7分別在KMB、PDA、高氏1號以及LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，觀察發(fā)現(xiàn)，在KMB培養(yǎng)基上，菌落邊緣不整齊，正面黃白相間，反面乳黃色(圖1A、B)；在PDA培養(yǎng)基上，正面黃色，反面淡黃色(圖1C、D)；在高氏1號培養(yǎng)基上，菌落邊緣較整齊，正反面均為乳黃色，且生長速率較前兩者慢(圖1E、F)；在LB培養(yǎng)基上，正面乳白色，反面乳黃色，生長速率居中(圖1G、H)。將W-7菌株稀釋涂布培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)有不透明菌落和半透明菌落2種形態(tài)；不透明菌落乳白色、圓形，邊緣比較整齊，表面濕滑有黏性，菌落向外突出生長；半透明菌落乳黃色、光滑、濕潤；此外，隨培養(yǎng)時間延長，不透明菌落邊緣開始皺縮，表面形成褶皺(圖1I)。該菌革蘭氏染色呈陽性，鏡檢發(fā)現(xiàn)，菌體呈短桿狀，大部分單獨存在，少部分成鏈排列(圖1J)，有芽孢生成但不易觀察到。依據(jù)這些特征發(fā)現(xiàn)，W-7菌株與文獻[13]描述的芽孢桿菌科芽孢桿菌屬(Bacillus)較為接近，尤其是菌體短小，且具有不透明菌落和半透明菌落2種菌落特征，與其中的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)更接近。

A、B為KMB培養(yǎng)基，C、D為PDA培養(yǎng)基，E、F為高氏1號培養(yǎng)基，G、H為LB培養(yǎng)基，其中，A、C、E、G為正面，B、D、F、H為背面； I為2種菌落形態(tài)； J為革蘭氏染色 圖1 W-7菌株的培養(yǎng)特性、菌落特征及革蘭氏染色

2.2 W-7菌株生理生化試驗鑒定結(jié)果

依據(jù)2.1的結(jié)果可知，W-7菌株與芽孢桿菌屬的短小芽孢桿菌較為接近，根據(jù)參考文獻[10-11]的描述，對W-7菌株的主要生理生化特性進行了測定，并與其近似的枯草芽孢桿菌(Bacilllussubtilis)和地衣芽孢桿菌(Bacilluslincheniformis)的特性進行了比較(表1)。結(jié)果顯示，W-7菌株的淀粉水解、硝酸鹽還原以及馬尿酸鹽水解反應(yīng)均與短小芽孢桿菌完全一致，而這3項正是區(qū)分短小芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的主要特征。據(jù)此，可初步推測W-7菌株屬于短小芽孢桿菌。

2.3 W-7菌株16S rDNA序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

序列分析結(jié)果顯示，W-7菌株的16S rDNA序列為1 436 bp，提交至NCBI網(wǎng)站所獲得的登錄號為KX056277。將該序列通過BLAST與GenBank中已有菌株的16S rDNA序列進行比對，并從中選擇了9株相似性高于95%的菌株，以Escherichiacolistrain AE 1-2作為外群，采用ClustalX軟件進行序列比對，使用Neighbor-Joining法(Mega 5.0軟件)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示。W-7菌株與B.pumilusstrain ATCC 7061和B.pumilusstrain NBRC 12092位于同一分支，其相似性達到99%，說明W-7菌株與短小芽孢桿菌高度相似。因此，結(jié)合W-7菌株的培養(yǎng)特征、菌落特征、革蘭氏染色結(jié)果以及生理生化特性等，初步確定W-7菌株為短小芽孢桿菌。

表1 W-7菌株的部分生理生化特性

注： BP—短小芽孢桿菌(B.pumilus)，BS—枯草芽孢桿菌(B.subtilis)， BL—地衣芽孢桿菌(B.lincheniformis)；+表示陽性，-表示陰性。

圖2 根據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的W-7及相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 W-7菌株活體、菌液和無菌體發(fā)酵液對致病疫霉菌絲生長的影響

采用對峙法和打孔法測定的結(jié)果表明，W-7菌株的活體、在一定條件下培養(yǎng)的菌液和無菌體發(fā)酵液對致病疫霉菌絲生長均有顯著的抑制作用(圖3)，其中，以菌液(圖3B)的抑制作用最強，抑菌率達到94.44%，與活體菌株(圖3A，抑菌率為83.33%)的抑制作用有顯著差異(P<0.05)，與無菌體發(fā)酵液(圖3C，66.67%)有極顯著差異(P<0.01)。

A、B、C分別為活體菌株、菌液、發(fā)酵液對致病疫霉的抑制作用，D為對照圖3 W-7活體菌株、菌液及無菌體發(fā)酵液對致病疫霉的抑制作用

2.5 不同濃度菌液對致病疫霉菌絲生長的抑制作用

進一步將菌液稀釋后測定發(fā)現(xiàn)，不同濃度的菌液對致病疫霉菌絲生長均有很強的抑制作用，其中，菌液原液的抑菌作用最強，抑菌率為93.82%，雖然隨菌液濃度降低抑菌強度也逐漸減弱，但當(dāng)菌液原液稀釋3倍體積后，即濃度為原液的25%時，抑菌率仍能達到87.65%(圖4)；統(tǒng)計分析顯示，菌液原液的抑菌作用與稀釋后不同濃度菌液之間均有顯著差異(P<0.05)。

2.6 菌液在離體塊莖上的防病作用

經(jīng)W-7菌株25%的菌液預(yù)防處理的馬鈴薯塊莖正反面均無變軟現(xiàn)象，塊莖表面菌絲體十分稀疏，甚至沒有菌絲體；而對照組塊莖表面遍布菌絲體，有變軟腐爛現(xiàn)象(圖5)。用菌液進行預(yù)防處理后病情指數(shù)為25，對照病情指數(shù)為94，其預(yù)防效果達到73.40%，表明該菌株菌液有明顯的病害預(yù)防效果。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖4 不同濃度菌液對致病疫霉的抑制作用

圖5 菌液在離體塊莖上的防病作用

2.7 菌液對致病疫霉菌體形態(tài)的影響

挑取受W-7菌株25%的菌液抑制的致病疫霉菌絲在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，大部分菌絲都表現(xiàn)出不同程度的畸變。與菌絲無隔、粗細比較均勻、外壁光滑、內(nèi)容物分布均勻的正常菌絲體(圖6A)相比，受抑制的菌絲體彎曲折疊、粗細不均(圖6B)，外壁粗糙、內(nèi)含物分布不均、有大量隔膜產(chǎn)生等(圖6C)。

A為正常菌絲，B、C均為受抑制菌絲圖6 受W-7菌液抑制的致病疫霉菌絲體(10×40)

3 結(jié)論與討論

當(dāng)前在馬鈴薯生產(chǎn)中，除培育推廣抗病品種外，多種化學(xué)農(nóng)藥聯(lián)合施用[3]是防治馬鈴薯晚疫病的主要方法，但是由于A2交配型在世界范圍內(nèi)的廣泛遷移、生理小種變異迅速、化學(xué)農(nóng)藥廣泛使用引起菌株抗藥性增強[3]，使得晚疫病的防治面臨著更大的挑戰(zhàn)。鑒于拮抗細菌在生物防治方面的巨大優(yōu)勢[6]，利用拮抗細菌及其代謝產(chǎn)物抑制致病疫霉已引起了廣泛關(guān)注[5]。Bengtsson等[5]發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)2.74菌株產(chǎn)生的表面活性劑(1 mg/mL)可抑制致病疫霉菌絲生長，并能使60%的游動孢子裂解，預(yù)先處理馬鈴薯植株后對晚疫病的保護率在75%以上；Lamsal等[14]分離篩選出7株番茄根際細菌，其對致病疫霉菌絲生長均有較強的抑制作用，其中，AB15菌株的抑菌率最高(80%)，預(yù)處理番茄植株后晚疫病的發(fā)病率比對照下降了74%；Zegeye等[15]研究表明，熒光假單胞菌Bak150菌株能強烈抑制致病疫霉菌絲生長，抑制率為88%，溫室中該菌株處理葉片后病情曲線下面積(AUDPC=765.1)顯著低于未做任何防病處理的對照(AUDPC=1 045)(P<0.05)。吳艷清等[9]從狗尾草中分離的細菌Y-1和Y-3菌株對致病疫霉有明顯抑制作用，抑菌率在80%以上，從Y-3菌株提取的脂肽粗提物抑制率高達90%以上；蔣繼志等[8]從馬鈴薯根際土壤中分離的一株熒光假單胞菌M15菌株對致病疫霉有顯著的抑制作用，其菌液抑菌率達到88.23%，在馬鈴薯塊莖切片上對晚疫病的預(yù)防效果為65.06%。本試驗對分離自馬鈴薯晚疫病病葉的W-7菌株進行了初步鑒定，將其歸屬于短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)，該菌株活體、菌液以及發(fā)酵液對致病疫霉菌絲生長均有很強的抑制作用，其中，以菌液的抑制率最高，達到94.44%，菌液濃度稀釋至25%后在馬鈴薯塊莖切片上對晚疫病的預(yù)防效果為73.40%。有文獻報道，短小芽孢桿菌中的一些菌株已被應(yīng)用于生物農(nóng)藥、肥料、飼料、酶制劑、醫(yī)學(xué)中的抗凝溶栓、環(huán)保等多個領(lǐng)域[16-18]，尤其是作為生防菌在抑制植物病原菌和防治病害方面已有許多應(yīng)用成果，其中，王會軍等[19]從油菜根內(nèi)分離的短小芽孢桿菌YN201305對十字花科根腫病菌有明顯裂解和抑制作用，盆栽試驗中對大白菜根腫病的防治效果達到65.12%。以上表明，短小芽孢桿菌應(yīng)用范圍廣泛且潛力巨大。本試驗中的W-7菌株分離自馬鈴薯葉片，其菌液對致病疫霉菌絲生長以及菌絲形態(tài)表現(xiàn)出非常強的抑制作用和影響，并且在馬鈴薯塊莖上具有較好的防病作用，暗示該菌株在防治馬鈴薯晚疫病方面有很大潛力，下一步擬對其實際防病效果開展研究，為盡快開發(fā)利用W-7菌株防治馬鈴薯晚疫病提供依據(jù)。

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Identification of Antagonistic Bacterium W-7 Strain and Its Inhibition on Phytophthora infestans

WAN Anqi，JIANG Jizhi*，SHA Haitian，LI Ying，WANG Beibei，JIN Xin，ZHANG Yahui

(College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China)

The bacterium W-7 strain was isolated from diseased leaf of potato late blight，and showed obvious suppression on mycelia growth ofPhytophthorainfestansin lab.The purpose of this paper was to clear its classification status,inhibitory characteristics onP.infestansand the potential in control potato late blight.The traditional method combined with 16S rDNA sequence analysis were used for identification of W-7 strain,and dual culture method and punch method were applied for testing the inhibition effect of living strain,bacterial fluid and free-cell fermentation liquid of W-7 strain onP.infestans.And potato tuber slices method was employed for evaluating the prevention effect of bacterial fluid against late blightinvitro.The W-7 strain was identified asBacilluspumilusbased on colony feature,partial physiology and biochemistry characteristics,and 16S rDNA sequence analysis.Its fluid had the strongest inhibition effect(94.44%) on pathogen mycelia growth compared with living strain and fermentation liquid.Especially,the inhibition rate and prevention effect on disease still reached 87.65%and 73.40%,respectively,after the bacterial fluid was diluted to 25% of initial concentration.It was observed that the bacterial fluid could cause deformation ofP.infestanshyphae.W-7 strain,which belongs toBacilluspumilus,has a great potential in controlling potato late blight in future.

Phytophthorainfestans; antagonistic bacteria;Bacilluspumilus; identification; inhibition effect

2016-08-11

河北省自然科學(xué)基金項目(C2015201231)；河北省科技支撐計劃項目(13226502D)；河北省生物學(xué)強勢特色學(xué)科建設(shè)專項

萬安琪(1992-)，女，湖北荊州人，在讀碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。 E-mail:wananqiwananqi@126.com

*通訊作者：蔣繼志(1960-)，男，寧夏中寧人，教授，主要從事植物病害生物防治研究。E-mail：jizhijiang909@163.com

S435.32；S476.1

A

1004-3268(2017)02-0055-06