王 靜，周 祁，李麗華，郝風(fēng)聲，魏遠(yuǎn)方，楊立均，劉衛(wèi)群*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002； 4.河南省煙草公司 駐馬店市公司，河南 駐馬店463000)

煙草的TMV侵染耐受性與谷胱甘肽代謝途徑的關(guān)系

王 靜1，周 祁2，李麗華3，郝風(fēng)聲2，魏遠(yuǎn)方2，楊立均4，劉衛(wèi)群2*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002； 4.河南省煙草公司 駐馬店市公司，河南 駐馬店463000)

為了深入了解煙草對煙草花葉病毒(TMV)的抗性機(jī)制，以耐受TMV感染品種豫煙8號和具有相同遺傳背景對花葉病敏感的品種NC89為材料，通過對高通量測序獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，二者接種TMV后的差異表達(dá)基因富集通路中共同存在谷胱甘肽代謝途徑，且耐受性品種豫煙8號中該途徑有增強的趨勢。采用熒光定量PCR和分光光度法檢測了兩品種接種TMV前后谷胱甘肽代謝途徑中關(guān)鍵酶谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)基因表達(dá)水平、酶活性以及谷胱甘肽(GSH)含量的變化。結(jié)果表明，接種TMV后兩品種中GST基因表達(dá)水平升高，GST酶活性增強，GSH含量升高，耐受性品種豫煙8號增幅更明顯。通過硫元素的豐缺試驗研究了接種TMV對GST基因及與TMV侵染耐受性相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示，+S和-S處理中兩品種接種病毒后這些基因的表達(dá)趨勢一致，-S處理的表達(dá)量低于+S處理。GST、PR1-a、HSP90和Catalase-3這些抗病相關(guān)基因都呈上調(diào)表達(dá)，其中豫煙8號接種后的表達(dá)量均高于NC89；而PsbA和PhotosystemⅡ 10kDapolypeptide2個涉及光合作用的基因均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，但是接種后豫煙8號的下調(diào)幅度小于NC89。以上表明，在耐受TMV感染的品種中，谷胱甘肽代謝增強對細(xì)胞環(huán)境的氧化還原平衡有一定的促進(jìn)作用，使光系統(tǒng)Ⅱ中的關(guān)鍵成分D1蛋白基因PsbA的表達(dá)相對穩(wěn)定，從而減輕光合系統(tǒng)的破壞程度。

煙草花葉病毒； 耐受性； 谷胱甘肽； 谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶

煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus,TMV)是世界上最先被分離、鑒定的病毒[1]，也是煙草栽培生產(chǎn)上普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重的侵染性病原[2]，其寄主范圍非常廣泛，可侵染茄科、葫蘆科、十字花科、藜科、莧科、豆科和商陸科等36科350種植物[3]。自Mayer[4]首次發(fā)現(xiàn)感染TMV煙草的葉片通過汁液傳播可以使健康煙株感病至今，國內(nèi)外針對抗TMV的研究主要集中在TMV的發(fā)生條件、防治措施和篩選抗TMV煙草品種等領(lǐng)域。但由于該病毒的寄主范圍廣，且與寄主的寄生關(guān)系復(fù)雜，使得花葉病的研究和防治還未達(dá)到理想的效果。隨著植物病毒抗藥性的增加和人們對生態(tài)環(huán)境的重視，化學(xué)藥劑防治的發(fā)展受到限制。同時，由于遠(yuǎn)緣煙草品種在雜交育種時存在生殖隔離，抗性基因在品種間很難轉(zhuǎn)移。這一系列問題導(dǎo)致煙草花葉病仍是現(xiàn)階段煙葉生產(chǎn)中的主要病害，許多研究工作尚需進(jìn)一步深入開展。

近年來，功能基因組學(xué)的發(fā)展，尤其是轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的深入研究，在探討特定時期基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)豐度及大規(guī)模分析基因的表達(dá)模式等方面起著重要的作用[5-7]。為了更深入地了解煙草對花葉病的抗性機(jī)制，楊立均等[8]從TMV高發(fā)病的NC89煙田中篩選出無病健壯變異單株，經(jīng)過幾代選育而成豫煙8號品系，將其作為一個耐受病毒侵染的材料，以對花葉病敏感的NC89作為參照材料，通過高通量測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)，2個品種在響應(yīng)TMV的差異表達(dá)基因富集通路中共同存在谷胱甘肽代謝途徑，而且在耐受性品種豫煙8號的特異表達(dá)基因富集通路中也存在該途徑，表明耐受性品種感染TMV后該途徑的某些物質(zhì)發(fā)生了特異性變化(未發(fā)表)。因此，本研究采用熒光定量PCR和分光光度法對該通路中的關(guān)鍵酶谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)基因表達(dá)水平和由該基因編碼的GST酶活性以及谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量進(jìn)行檢測，探討谷胱甘肽代謝途徑增強對提高TMV侵染耐受性的作用，為進(jìn)一步闡明TMV與植物互作機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料

Trizol試劑購自Invitrogen生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑均購自TaKaRa公司；還原型谷胱甘肽試劑盒和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶試劑盒均購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。供試材料豫煙8號和NC89均由駐馬店市煙草公司提供。

1.2 病毒源提取、接種與取樣

TMV病毒源提取與接種參照楊立均等[9]的方法。兩品種接種病毒后分別在0 h和24 h取接種葉片上部葉，立即用液氮冷凍處理。

1.3 總 RNA 提取與cDNA第一鏈合成

總RNA提取采用Trizol試劑按操作手冊進(jìn)行；cDNA第一鏈合成按照TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明書進(jìn)行操作。

1.4 差異表達(dá)基因的篩選和實時熒光定量PCR驗證

對前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)中進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽代謝途徑處于高水平。為了驗證轉(zhuǎn)錄組分析所獲得的差異表達(dá)基因的可靠性，對GST基因的表達(dá)水平變化進(jìn)行驗證，根據(jù)基因序列設(shè)計特異性引物(表 1)，選用煙草Actin基因為內(nèi)參基因。實時熒光定量PCR的反應(yīng)體系(總體系10 μL)為：SYBR GREEN 5 μL、正向引物(F) 0.1 μL、反向引物(R) 0.1 μL、cDNA 1.25 μL、DEPC水 3.55 μL。每個樣品做3組重復(fù)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。反應(yīng)在BioRad IQ5 熒光定量PCR儀上進(jìn)行，結(jié)果采用 2-ΔΔCT法分析，其中，CT是循環(huán)閾值，ΔCT是目的基因與內(nèi)參基因CT值的差值，ΔΔCT是不同時間處理與對照ΔCT值的差值。

表1 差異表達(dá)基因的熒光定量PCR引物序列

1.5 兩品種接種TMV前后GSH含量和GST活性的測定

將組織在液氮中磨碎，分別采用還原型谷胱甘肽試劑盒和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶試劑盒測定GSH含量和GST活性。

1.6 通過硫元素的豐缺試驗驗證兩品種對TMV耐受性的差異

試驗按照H?ller等[10]的方法進(jìn)行。首先，將豫煙8號和NC89分別在石英砂上催芽；3周后將幼苗轉(zhuǎn)移至石英砂與蛭石比例為1∶3的基質(zhì)中，其中一部分用+S營養(yǎng)液[+S營養(yǎng)液配方：5 mmol/L KNO3、1 mmol/L KH2PO4、 2 mmol/L Mg(NO3)2、2.5 mmol/L CaSO4、1 mmol/L MgSO4、70 μmol/L EDTA-FeNa、4 mmol/L Ca(NO3)2、0.9 μmol/L ZnCl2、30 μmol/L H3BO3、0.9 μmol/L CuCl2、0.5 μmol/L MoO3、20 μmol/L MnCl2]給予充足的硫培養(yǎng)，另一部分一次性加5 mL+S營養(yǎng)液，之后采用不含硫配方的營養(yǎng)液(-S營養(yǎng)液，配方是將+S 配方中2.5 mmol/L CaSO4換成0.86 mmol/L CaCl2，去掉 1 mmol/L MgSO4)；溫度保持在18～22 ℃，濕度70%，光周期12 h。4周后接種TMV，提取RNA后分別對GST、PR1-a、HSP90、Catalase-3、PhotosystemⅡ 10kDapolypeptide和PsbA基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測，其引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩品種接種TMV前后谷胱甘肽代謝途徑差異表達(dá)基因的篩選

已有研究表明，GST是植物體中廣泛存在的一種具有多種功能的超家族酶，它不僅參與初生代謝、次生代謝、除草劑解毒[11-12]，還具有保護(hù)植物免受氧化損傷及異源物質(zhì)隔離等作用[13-15]。兩品種接種TMV前后谷胱甘肽代謝途徑中共有29個差異表達(dá)的unigene，其中，有20個為編碼GST的unigene。相對NC89品種，豫煙8號接種TMV后有17個GST unigene高表達(dá)(表2)，推測GST的高表達(dá)對抵抗TMV侵染具有重要意義。

表2 兩品種接種TMV前后谷胱甘肽代謝途徑的差異表達(dá)基因

續(xù)表2 兩品種接種TMV前后谷胱甘肽代謝途徑的差異表達(dá)基因

2.2 熒光定量PCR驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

為了驗證上述篩選的差異表達(dá)基因，采用熒光定量PCR對兩品種接種TMV前后的樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，兩品種在接種TMV 24 h后GST均上調(diào)表達(dá)(圖1)，且豫煙8號急速上調(diào)，表達(dá)量是NC89的2倍，這與轉(zhuǎn)錄組分析的上調(diào)趨勢吻合。

Y、N分別代表豫煙8號、NC89，Yd、Nd分別代表接種TMV 24 h后的豫煙8號、NC89，下同圖1 熒光定量PCR驗證GST基因的表達(dá)趨勢

2.3 兩品種接種TMV前后GSH含量和GST活性的變化

為了探明谷胱甘肽代謝途徑與TMV耐受性的關(guān)系，檢測了兩品種接種TMV前(CK)和接種TMV 24 h后的GSH含量和GST活性。結(jié)果顯示，兩品種接種TMV后GSH含量以及GST活性都升高，其中,豫煙8號接種后上升幅度更為明顯，GSH含量升高將近1倍(圖2)，GST活性是接種前的1.7倍(圖3)，表明谷胱甘肽代謝途徑在煙草防御TMV侵染過程中起了重要的作用。

圖2 接種TMV對GSH含量的影響

圖3 接種TMV對GST活性的影響

2.4 不同硫元素濃度下接種TMV對GST及與TMV侵染耐受性相關(guān)基因表達(dá)的影響

許多文獻(xiàn)已經(jīng)報道,提供充足的硫元素能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對TMV的抗性，這種誘導(dǎo)抗性與谷胱甘肽代謝增強有關(guān)，因此，將這種抗性稱為硫誘導(dǎo)抗性或增強抗性(SIR/SED)[16-17]。為了評估GST及與TMV侵染耐受性相關(guān)基因的功能，對豫煙8號和NC89分別進(jìn)行了缺硫(-S)和富硫(+S)處理并接種TMV，采用熒光定量PCR技術(shù)對這8個樣品的GST基因及其他5個與TMV抗性相關(guān)(PR1-a、HSP90和Catalase-3)或涉及光合作用(PsbA、PhotosystemⅡ 10kDapolypeptide)的基因進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示(圖4)，2個品種接種TMV前后，-S處理中這6個基因的表達(dá)趨勢與+S處理一致，表達(dá)量稍低于后者。NC89和豫煙8號2個品種接種TMV后，GST、PR1-a、HSP90和Catalase-3這些抗病相關(guān)基因都呈上調(diào)表達(dá)，其中，豫煙8號接種后的表達(dá)量均高于NC89；2個涉及光合作用的基因均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，但是接種后豫煙8號的下調(diào)幅度小于NC89，尤其是-S處理中NC89接種后PsbA的表達(dá)量下調(diào)幅度明顯大于豫煙8號，其表達(dá)量僅為豫煙8號表達(dá)量的一半。以上表明，供應(yīng)充足的硫元素能提高植物的TMV耐受性，并且在耐受TMV感染的品種中，由于谷胱甘肽代謝增強，對細(xì)胞環(huán)境的氧化還原平衡有一定的促進(jìn)作用，使光系統(tǒng)Ⅱ中的關(guān)鍵成分D1蛋白基因PsbA的表達(dá)相對穩(wěn)定，從而減輕光合系統(tǒng)的破壞程度。

圖4 GST及與TMV侵染耐受性相關(guān)基因的定量檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

GST是植物體內(nèi)普遍存在的小分子抗氧化物質(zhì)，它在還原態(tài)硫的儲存和轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)和核酸的合成、酶活性的調(diào)節(jié)、組織抗氧化特性的維持以及對氧化還原敏感信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)中起著重要作用[18-19]。大量研究表明，植物防御能力的強弱與抗氧化系統(tǒng)水平的高低具有相關(guān)性，如Ball等[20]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，對鎘敏感的GSH1突變體rax1-1改變了谷胱甘肽代謝，推測野生型植株中，谷胱甘肽代謝可能在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和控制防御基因的表達(dá)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽代謝途徑是2個煙草品種接種TMV后的差異表達(dá)基因富集通路中共同存在的代謝途徑之一，且在豫煙8號接種后特異表達(dá)基因富集通路中該途徑增強，尤其是該通路中的關(guān)鍵酶GST在豫煙8號接種TMV后高表達(dá)。研究表明，GST是谷胱甘肽代謝中重要的酶之一，除具有結(jié)合細(xì)胞內(nèi)有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)運外排的生理解毒功能和谷胱甘肽還原酶的功能外，還可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，在植物修復(fù)中起著重要的作用[21-22]。目前，GST表達(dá)的增強已經(jīng)被認(rèn)為是植物對脅迫響應(yīng)的重要標(biāo)志之一[23]。本試驗也發(fā)現(xiàn)，接種TMV后，抗性品種豫煙8號中的GST表達(dá)水平和GST酶活性均高于NC89品種；且無論在+S處理還是-S處理中，豫煙8號接種前后GST的表達(dá)量以及抗病相關(guān)基因PR1-a、HSP90和Catalase-3的表達(dá)量均高于NC89，同時豫煙8號中光系統(tǒng)Ⅱ的關(guān)鍵成分D1蛋白基因PsbA的表達(dá)相對穩(wěn)定。由此推測，豫煙8號活躍的谷胱甘肽代謝維持了體內(nèi)氧化還原平衡，從而減輕光合系統(tǒng)的破壞程度，這與Lim等[24]的研究結(jié)果一致。Lim等[24]發(fā)現(xiàn)，在瞿麥(DianthussuperbusL．)中過量表達(dá)煙草GST基因能夠增強其在干旱及不同光照條件下的光合作用。因此，增強谷胱甘肽代謝途徑有利于提高植物對TMV感染的耐受性。

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Relationship of Tolerance to TMV and Glutathione Metabolic Pathway in Tobacco

WANG Jing1,ZHOU Qi2,LI Lihua3,HAO Fengsheng2,WEI Yuanfang2,YANG Lijun4,LIU Weiqun2*

(1.College of Tobacco Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 2.College of Life Sciences,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 3.Cereal Crop Research Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 4.Zhumadian Branch of Henan Province Tobacco Company,Zhumadian 463000,China)

In order to further explore the resistance mechanism of tobacco to tobacco mosaic virus(TMV),two tobacco varieties,NC89 and Yuyan 8 which is tolerant to TMV and has the same genetic background as NC89,were used as materials,and bioinformatics analysis using transcriptome data obtained by high-throughput sequencing found that there was common response to glutathione metabolism after inoculation with TMV in the two varieties,and the response of Yuyan 8 was enhanced.We detected the change of transcription of glutathione S-transferase(GST)gene in glutathione metabolic pathway with quantitative PCR,the enzyme activity of GST and glutathione(GSH)content with spectrophotometry in the two varieties after inoculated by TMV.The results showed that the transcription level ofGSTgene,the enzyme activity of GST and the GSH content were increased,and the increase rate in Yuyan 8 was higher.The influence of TMV infection on the expression level ofGSTand other genes related to TMV tolerance was studied by the sulfur concentration experiment.The result showed that whether +S or -S,the expression trend of these genes in the two varieties was same,but the expression level in -S treatment was less than in the +S treatment.The expression of the genes related with disease resistance(GST,PR1-a,HSP90,Catalase-3)was increased after infection by TMV,and the expression level of Yuyan 8 was higher than NC89.The two genes involved in photosynthesis,PsbAandPhotosystemⅡ 10kDapolypeptideshowed reduced expression,but the reduced rate in Yuyan 8 was less than NC89.The results above indicated that in the varieties resistant to TMV infection,enhancement of glutathione metabolic pathway was beneficial to cellular redox balance,which stabilized the expression ofPsbAthat encodes the key D1 protein in photosystem Ⅱ,and decreased the damage degree of TMV to photosynthetic system.

TMV; tolerance; glutathione; glutathione S-transferase

2016-10-04

駐馬店市煙草公司科技計劃項目

王 靜(1985-)，女，山西長治人，講師，博士，主要從事植物逆境分子生物學(xué)研究。 E-mail：wangjing040922@126.com

*通訊作者：劉衛(wèi)群(1956-)，女，河北臨城人，教授，博士，主要從事植物逆境分子生物學(xué)研究。 E-mail：liuweiqun2004@126.com

S435.72

A

1004-3268(2017)02-0049-06