盧 慧，伍冰倩，王伊帆，劉妮妮，孟凡虹，胡振宇，趙瑞瑞，趙 珩

(中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081)

富氫水處理對采后番茄果實(shí)灰霉病抗性的影響

盧 慧，伍冰倩*，王伊帆，劉妮妮，孟凡虹，胡振宇，趙瑞瑞，趙 珩**

(中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081)

以采后番茄果實(shí)為試驗(yàn)材料，通過不同濃度富氫水(HRW)浸泡番茄果實(shí)，研究氫氣對番茄果實(shí)抗灰霉病的作用效果。結(jié)果表明，與對照組(蒸餾水處理)相比，50%和75% HRW處理降低了損傷接種番茄果實(shí)的發(fā)病情況，接菌后9 d病斑面積分別是對照組的87.2%和77.9%；HRW處理可以不同程度地提高番茄果實(shí)的多酚氧化酶(PPO)活性，其中75% HRW處理組PPO活性在接菌后3 d與對照組差異達(dá)到極顯著水平(P<0.001)，是對照組的1.59倍；HRW處理提高了番茄果實(shí)中的一氧化氮含量，其中50% HRW處理組在接菌后3 d和9 d與對照組差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.001)，分別是對照組的2.56倍和3.13倍。綜上所述，氫氣可能作為信號(hào)分子參與植物脅迫應(yīng)答反應(yīng)，增強(qiáng)了番茄果實(shí)對灰霉菌的抗性。

番茄果實(shí)； 氫氣； 富氫水； 灰霉菌； 抗病性

氫氣 (H2) 是一種小分子氣體，具有抗氧化、抗炎和抗過敏的作用[1-2]，并能選擇性地降低生物體內(nèi)的羥基自由基 (·OH) 和過氧亞硝基 (ONOO-) 含量[3-4]，常作為治療性醫(yī)療氣體用于臨床。H2可以通過直接吸入、以富氫水(hydrogen-rich water,HRW)的形式口服攝入、以富氫水生理鹽水注射以及氫浴[5]的形式作用于人體和動(dòng)物模型，治療包括帕金森病、糖尿病、神經(jīng)損傷以及腎損傷等的多種疾病[6-8]。近年來的研究表明，H2能夠作為一種新型的信號(hào)分子參與植物脅迫應(yīng)答[9]。H2能夠緩解鹽脅迫[10]，降低鹽脅迫和百草枯造成的氧化損傷[11]；具有抗氧化、延緩植物衰老的作用[12]；能促使植物氣孔關(guān)閉，增強(qiáng)植物耐旱能力[13]；緩解金屬離子造成的氧化損傷[14-15]；誘導(dǎo)植物不定根的產(chǎn)生[16-17]；參與植物激素調(diào)控的抗病蟲害信號(hào)途徑[18]。

番茄是研究果實(shí)采后生理與病理的一種經(jīng)典模式材料[19]。番茄灰霉病是由灰霉菌(Botrytiscinerea)引起的，灰霉病發(fā)病后傳播速度很快，能造成嚴(yán)重的爛果現(xiàn)象，是影響番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害之一[20-22]。本研究以采后番茄果實(shí)為試驗(yàn)材料，通過不同濃度HRW浸泡番茄果實(shí)，檢測HRW對損傷接種番茄果實(shí)發(fā)病情況、病斑面積、多酚氧化酶(PPO)活性和一氧化氮(NO)含量的影響，研究H2對番茄抗灰霉菌的作用效果，旨在探索利用小分子氣體提高采后番茄果實(shí)抗真菌病害的新型方式，對提高番茄自身抗性、保護(hù)生態(tài)環(huán)境、提高經(jīng)濟(jì)效益具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料和方法

1.1 材料

將番茄(Solanumlycopersicumvs.Messina) 播種于山東濱州番茄種植基地大棚中，標(biāo)記花期。采摘綠熟期(花期為45 d)番茄果實(shí)立即運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，挑選大小均勻、無病蟲害和傷痕的完好果實(shí)，置于(25±1)℃、相對濕度90%～95%的環(huán)境中釋放田間熱，次日進(jìn)行處理。

1.2 方法

1.2.1 HRW的制備 參考林玉婷[23]的方法，稍加改動(dòng)。將H2以150 mL/min的流速通入含5 L蒸餾水的廣口瓶中持續(xù)4 h，即為飽和HRW。氣相色譜測定表明，飽和HRW中H2濃度為0.25 mmol/L，常溫下該濃度能夠保持12 h。之后立即用蒸餾水按不同體積比將HRW稀釋至試驗(yàn)所需濃度。

1.2.2 番茄果實(shí)處理 參考Hu等[12]的方法，稍加改動(dòng)。將番茄果實(shí)浸泡在3%次氯酸鈉溶液中2 min進(jìn)行表面消毒，清水洗凈后自然晾干。共設(shè)5組處理：蒸餾水對照、25% HRW、50% HRW、75% HRW、100% HRW。用不同濃度HRW浸泡番茄30 min后，取出晾干。

接種前，用槍頭在番茄果實(shí)赤道部位扎2個(gè)寬2 mm、深4 mm的孔；取在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d的番茄灰霉菌，在無菌條件下用無菌水(含0.01% Tween-80)配制成1×106cfu/mL的孢子懸浮液；向每個(gè)孔中注入10 μL孢子懸浮液。接種后，將果實(shí)置于(25±1)℃、相對濕度90%～95%的環(huán)境中。分別于0、3、6、9 d進(jìn)行取樣，每個(gè)處理分別取30個(gè)番茄果實(shí)，環(huán)灰霉病斑切取1 cm 寬度未發(fā)病的果皮，并迅速切成小塊，用液氮速凍后，保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.3 指標(biāo)測定 接種灰霉菌后0 d、3 d、6 d和9 d，各處理組隨機(jī)選取10個(gè)番茄進(jìn)行拍照，記錄番茄果實(shí)發(fā)病情況。果實(shí)損傷病斑面積統(tǒng)計(jì)參考方中達(dá)[24]的方法，于接種灰霉菌后的3 d、6 d和9 d共3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(發(fā)病明顯、病斑直徑適宜統(tǒng)計(jì))統(tǒng)計(jì)番茄果實(shí)病斑直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次，每次統(tǒng)計(jì)10個(gè)果實(shí)，病斑面積計(jì)算公式：病斑面積(mm2)=3.14×(病斑直徑/2)2。PPO活性的測定參照Zauberman等[25]的方法；組織內(nèi)NO含量用一氧化氮試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度HRW處理對番茄果實(shí)發(fā)病情況和病斑面積的影響

對照組番茄果實(shí)在接種灰霉菌后3 d開始出現(xiàn)明顯病癥，9 d發(fā)病狀況明顯，發(fā)病果實(shí)接種處可見邊緣明顯的輻射形水浸狀病斑。接種灰霉菌后9 d，25% HRW處理組與對照組番茄果實(shí)的發(fā)病情況相近，與對照組相比，100% HRW處理組番茄果實(shí)的發(fā)病情況更明顯，而50%和75% HRW處理明顯降低了損傷接種番茄果實(shí)的發(fā)病情況(圖1A)。此外，75%和100% HRW處理組的番茄果實(shí)成熟較為緩慢，變紅程度低于對照組，表明H2可能具有抗氧化、延緩果實(shí)衰老的作用。

從圖1B可以看出，除100% HRW處理組接菌9 d番茄病斑面積較對照組高(為對照組的1.72倍)以外，25%、50%、75% HRW處理組病斑面積均較對照組降低，接菌9 d其病斑面積分別為對照組的84.4%、87.2%、77.9%。上述結(jié)果說明，HRW處理可在一定程度上增強(qiáng)番茄果實(shí)抗灰霉菌侵染的能力，綜合發(fā)病情況，初步認(rèn)為50%和75% HRW 2組處理對番茄果實(shí)的保護(hù)作用相對其他組更好，而100% HRW預(yù)處理則加重了病情。

圖1 不同濃度HRW處理對接種后番茄果實(shí)發(fā)病情況(A)和病斑面積(B)的影響

2.2 不同濃度HRW處理對番茄果實(shí)PPO活性的影響

PPO是與植物抗病性密切相關(guān)的酶，它在植物的防衛(wèi)反應(yīng)中起著重要作用[26]。從圖2可以看出，HRW處理可以不同程度地提高接菌后番茄果實(shí)的PPO活性。25%、50%和75% 3個(gè)HRW處理組，隨接菌時(shí)間延長PPO活性整體表現(xiàn)出先增高后降低的趨勢。25% HRW處理組PPO活性僅在接菌后3 d高于對照組，是對照組的1.24倍，差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，6 d和9 d均低于對照組。50%和75% HRW處理組番茄PPO活性在接菌后3 d和6 d均高于對照組，兩組處理在接菌后3 d的PPO活性分別是對照組的1.19倍和1.59倍，其中，75% HRW處理組與對照組差異達(dá)到極顯著水平(P<0.001)；接菌后6 d的PPO活性分別是對照組的1.05倍和1.06倍，差異未達(dá)到顯著水平；接菌后9 d則低于對照組。100% HRW處理組番茄PPO活性始終高于對照組，接菌后3 d、6 d和9 d分別是對照組的1.74倍、1.07倍和1.11倍，其中，接菌后3 d差異達(dá)到極顯著水平(P<0.001)，接菌后9 d差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

與對照組相比，*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001。下同圖2 不同濃度HRW處理對接種后番茄果實(shí)PPO活性的影響

2.3 不同濃度HRW處理對番茄果實(shí)內(nèi)源NO含量的影響

NO在植物抗病防御反應(yīng)和脅迫響應(yīng)中具有至關(guān)重要的作用[27-28]，能有效誘導(dǎo)采后番茄果實(shí)的抗病性[29]。對接種灰霉菌后的番茄果實(shí)進(jìn)行NO含量測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HRW處理提高了番茄體內(nèi)的NO含量，4個(gè)處理組NO含量在接菌后3 d、6 d和9 d均高于對照組(圖3)。在接菌后3 d，25%和50% HRW處理組NO含量分別是對照組的2.24倍和2.56倍，25% HRW處理組與對照組差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，50% HRW處理組與對照組差異更為明顯(P<0.001)；在接菌后6 d，25%、50%、75% HRW處理組NO含量分別是對照組的2.22、2.16、2.05倍，差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)；在接菌后9 d，25%、50%、75% HRW處理組NO含量分別是對照組的2.30、3.13、1.40倍，其中，25% HRW處理組與對照組差異達(dá)到了顯著水平(P<0.05)，50% HRW處理組與對照組差異達(dá)到了極顯著水平(P<0.001)；100% HRW處理組NO含量在接菌后3 d、6 d和9 d均高于對照組，但均未達(dá)到顯著水平。以上結(jié)果表明，在接種灰霉菌后，50% HRW組番茄果實(shí)NO含量升高程度較其他處理組更明顯。

圖3 不同濃度HRW處理對接種后番茄果實(shí)NO含量的影響

3 結(jié)論與討論

H2作為一種重要的信號(hào)分子，參與調(diào)節(jié)植物的多種非生物脅迫反應(yīng)[11,18,30]，能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對非生物脅迫的抗性，如耐鹽、抗百草枯、抗氧化脅迫、抗重金屬等[15]。Zeng等[18]以水稻和綠豆種子為試驗(yàn)材料，通過不同濃度的HRW處理，證明H2作為抗氧化劑、種子萌發(fā)和植物脅迫反應(yīng)中的信號(hào)分子等多種角色，參與高等植物水楊酸、茉莉酸和乙烯等激素調(diào)控的抗病蟲害信號(hào)途徑；H2能調(diào)控植物激素受體基因的轉(zhuǎn)錄并促使抗氧化基因表達(dá)量上調(diào)；植物能產(chǎn)生內(nèi)源H2，其產(chǎn)量也受到茉莉酸和乙烯濃度的影響。

本研究以番茄果實(shí)為試驗(yàn)材料，以HRW浸泡番茄果實(shí)的方式提供外源H2，通過損傷接種灰霉菌引發(fā)番茄果實(shí)的灰霉病，研究H2在采后番茄果實(shí)抗灰霉菌中的作用。結(jié)果顯示，25% HRW處理組與對照組發(fā)病程度相似，50% 和75% HRW處理明顯降低了接種灰霉菌番茄果實(shí)的發(fā)病情況和病斑面積，而100% HRW處理則加重了病情。PPO參與植物體內(nèi)酚類物質(zhì)代謝，它能將植物的酚類物質(zhì)氧化成毒性更強(qiáng)的醌類物質(zhì)，毒殺病原菌并限制其擴(kuò)散，起到抗病的作用[26]。因此，PPO常作為植物抗病的重要生理指標(biāo)之一。Li等[31]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PPO的轉(zhuǎn)基因番茄具有更強(qiáng)的抵御病原菌侵染的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，接菌后3 d和6 d，與對照組相比，50%和75% HRW處理不同程度地提高了番茄果實(shí)的PPO活性。鄭鄢燕[22]發(fā)現(xiàn)，外源NO處理能增強(qiáng)番茄果實(shí)的抗病性。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，25%和50% HRW處理在接菌后3 d、6 d和9 d可以不同程度地促進(jìn)番茄果實(shí)內(nèi)源NO含量增加，差異均達(dá)到顯著水平，75% HRW處理組在接菌后6 d番茄果實(shí)內(nèi)源NO含量也顯著增加，總體上50% HRW處理組番茄果實(shí)NO含量升高程度較其他處理組更明顯。綜上所述，中等濃度的HRW處理(50%、75%)在一定程度上增強(qiáng)了番茄果實(shí)抗灰霉病侵染的能力，低濃度的HRW處理(25%)沒有起到保護(hù)作用，而過高濃度的HRW處理(100%)不僅未提高番茄果實(shí)的抗病性，而且可能增加灰霉菌對番茄果實(shí)的傷害。

與施用農(nóng)藥進(jìn)行植物病害防治相比，使用適當(dāng)濃度的HRW處理植物提高其抗病能力是綠色環(huán)保、簡單易行的。然而，還需要進(jìn)一步深入研究H2如何參與植物抗病途徑，明確H2作為信號(hào)分子在植物抗病途徑中的作用機(jī)制。

[1] Ohsawa I,Ishikawa M,Takahashi K,etal.Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals[J].Nature Medicine,2007,13(6):688-694.

[2] Hong Y,Chen S,Zhang J M.Hydrogen as a selective antioxidant:A review of clinical and experimental studies[J].Journal of International Medical Research,2010,38 (6):1893-1903.

[3] Nakao A,Toyoda Y,Sharma P,etal.Effectiveness of hydrogen rich water on antioxidant status of subjects with potential metabolic syndrome—An open label pilot study[J].Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition,2010,46(2):140-149.

[4] Ohta S.Recent progress toward hydrogen medicine:Potential of molecular hydrogen for preventive and therapeutic applications[J].Current Pharmaceutical Design,2011,17(22):2241-2252.

[5] Shen M,Zhang H,Yu C,etal.A review of experimental studies of hydrogen as a new therapeutic agent in emergency and critical care medicine[J].Medical Gas Research,2014,4(1):1-8.

[6] Nagata K,Nakashima-Kamimura N,Mikami T,etal.Consumption of molecular hydrogen prevents the stress-induced impairments in hippocampus-dependent learning tasks during chronic physical restraint in mice[J].Neuropsychopharmacology,2009,34(2):501-508.

[7] Nakashima-Kamimura N,Mori T,Ohsawa I,etal.Molecular hydrogen alleviates nephrotoxicity induced by an anti-cancer drug cisplatin without compromising anti-tumor activity in mice[J].Cancer Chemotherapy and Pharmacology,2009,64(4):753-761.

[8] Fu G,Zhang L,Cui W,etal.Induction of heme oxygenase-1 with β-CD-hemin complex mitigates cadmium-induced oxidative damage in the roots ofMedicagosativa[J].Plant and Soil,2011,345(1/2):271-285.

[9] 劉方,劉勇波,李俊生,等.氫氣在植物抗脅迫中的作用[J].植物生理學(xué)報(bào),2015,51(2):141-152.

[10] Xu S,Zhu S,Jiang Y,etal.Hydrogen-rich water alleviates salt stress in rice during seed germination[J].Plant and Soil,2013,370(1/2):47-57.

[11] Xie Y,Mao Y,Lai D,etal.H2enhancesArabidopsissalt tolerance by manipulating ZAT10/12-mediated antioxidant defence and controlling sodium exclusion[J].PLoS One,2012,7(11):e49800.

[12] Hu H,Li P,Wang Y,etal.Hydrogen-rich water delays postharvest ripening and senescence of kiwifruit[J].Food Chemistry,2014,156(11):100-109.

[13] Xie Y,Mao Y,Zhang W,etal.Reactive oxygen species-dependent nitric oxide production contributes to hydrogen-promoted stomatal closure inArabidopsis[J].Plant Physiology,2014,165(2):759-773.

[14] Chen M,Cui W,Zhu K,etal.Hydrogen-rich water alleviates aluminum-induced inhibition of root elongation in alfalfa via decreasing nitric oxide production[J].Journal of Hazardous Materials,2013,267(1):40-47.

[15] Cui W,Fang P,Zhu K,etal.Hydrogen-rich water confers plant tolerance to mercury toxicity in alfalfa seedlings[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2014,105:103-111.

[16] Lin Y,Zhang W,Qi F,etal.Hydrogen-rich water regulates cucumber adventitious root development in a heme oxygenase-1/carbon monoxide-dependent manner[J].Journal of Plant Physiology,2014,171(2):1-8.

[17] 朱永超.一氧化氮參與氫氣誘導(dǎo)黃瓜和萬壽菊不定根的發(fā)生[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[18] Zeng J,Zhang M,Sun X.Molecular hydrogen is involved in phytohormone signaling and stress responses in plants[J].PLoS One,2013,8(8):e71038.

[19] 生吉萍,羅云波,申琳.轉(zhuǎn)反義 ACC 合成酶基因番茄與普通番茄果實(shí)植物內(nèi)源激素含量的變化[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2000,33(3):43-48.

[20] 趙統(tǒng)敏,余文貴,趙麗萍,等.番茄抗灰霉病育種研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,27(5):1141-1147.

[21] 樊平聲,沙國棟,陳益芹,等.番茄灰霉病的防治研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(4):133-135.

[22] 鄭鄢燕.SlMPK1/2/3在外源NO誘導(dǎo)的采后番茄果實(shí)抗病途徑中的作用[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[23] 林玉婷.HO-1/CO信號(hào)系統(tǒng)參與H2S、β-CD-hemin和H2誘導(dǎo)的黃瓜不定根發(fā)生[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[24] 方中達(dá).植病研究方法[M].3版.北京:北京農(nóng)業(yè)出版社,1998.

[25] Zauberman G,Ronen R,Akerman M.Postharvest retention of the red color of litchi fruit pericarp[J].Scientia Horticulturae,1991,47(1):89-97.

[26] Mohammadi M,Kazemi H.Changes in peroxidase and polyphenol oxidase activities in susceptible and resistant wheat heads inoculated withFusariumgraminearum,and induced resistance[J].Plant Science,2002,162(4):491-498.

[27] Camp W V,Montagu M V,Inzé D.H2O2and NO:Redox signals in disease resistance[J].Trends in Plant Science,1998,3(3):330-334.

[28] Neill S,Desikan R,Hancock J.Hydrogen peroxide signalling[J].Current Opinion in Plant Biology,2002,5 (5):388-395.

[29] Fan B,Shen L,Liu K,etal.Interaction between nitric oxide and hydrogen peroxide in postharvest tomato resistance response toRhizopusnigricans[J].Journal of the Science of Food & Agriculture,2008,88(7):1238-1244.

[30] Jin Q,Zhu K,Cui W,etal.Hydrogen gas acts as a novel bioactive molecule in enhancing plant tolerance to paraquat-induced oxidative stress via the modulation of heme oxygenase-1 signalling system[J].Human & Experimental Toxicology,2013,36(5):956-969.

[31] Li L,Steffens J C.Overexpression of polyphenol oxidase in transgenic tomato plants results in enhanced bacterial disease resistance[J].Planta,2002,215(2):239-247.

Effects of Hydrogen-rich Water Treatment on Defense Responses of Postharvest Tomato Fruit to Botrytis cinerea

LU Hui,WU Bingqian*,WANG Yifan,LIU Nini,MENG Fanhong,HU Zhenyu,ZHAO Ruirui,ZHAO Heng**

(Department of Life and Environmental Sciences,Minzu University of China,Beijing 100081,China)

In this study,we used postharvest tomato fruit as experimental materials,which were soaked in different concentrations of hydrogen-rich water(HRW) and then inoculated withBotrytiscinerea,to study the protective effect of HRW in tomato resistance toBotrytiscinerea.Compared with the control group treated by distilled water,50% and 75% HRW treatments reduced the disease injury of inoculated tomato fruit,and the lesion areas at 9 d after inoculation were 87.2% and 77.9% of the control group,respectively.HRW treatment could increase the polyphenol oxidase(PPO) activity in different degree.The PPO activity of 75% HRW treatment group was significantly different from the control group after 3 d (P< 0.001),which was 1.59 times of the control group.The nitric oxide(NO) content of tomato fruit increased after HRW treatment.The NO content of 50% HRW treatment group was significantly different from the control group after 3 d and 9 d (P< 0.001),2.56 and 3.13 times of the control group,respectively.This study indicated that hydrogen might be involved in plant stress responses as a signaling molecule,and enhanced the defense responses of tomato fruit toBotrytiscinerea.

tomato fruit; hydrogen; hydrogen-rich water;Botrytiscinerea; disease resistance

2016-10-21

中共中央組織部“千人計(jì)劃”項(xiàng)目；中央民族大學(xué)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(YDZXXK201618)

盧 慧(1985-)，女，湖南長沙人，在讀博士研究生，研究方向：植物免疫學(xué)。E-mail：susanluhui@163.com 伍冰倩(1994-)，女，湖南衡陽人，在讀碩士研究生，研究方向：免疫學(xué)。E-mail：13810471803@163.com。*共同第一作者

**通訊作者：趙 珩(1970-)，女，安徽合肥人，教授，博士，主要從事免疫學(xué)研究。E-mail：hengzhao2000@gmail.com

S436.412.1

A

1004-3268(2017)02-0064-05