韋珍珍，毋瑞華，魏小春，楊 妍，田保明，位 芳*，師恭曜，曹剛強，張曉偉

(1．鄭州大學 生命科學學院， 河南 鄭州 450001； 2．河南省農(nóng)業(yè)科學院 園藝研究所，河南 鄭州 450002)

白菜同源多倍體減數(shù)分裂期聯(lián)會復合體蛋白ZYP1的細胞學分析

韋珍珍1，毋瑞華1，魏小春2，楊 妍1，田保明1，位 芳1*，師恭曜1，曹剛強1，張曉偉2

(1．鄭州大學 生命科學學院， 河南 鄭州 450001； 2．河南省農(nóng)業(yè)科學院 園藝研究所，河南 鄭州 450002)

為解析多倍體植物減數(shù)分裂期同源染色體的正常配對和聯(lián)會的細胞學機制，以白菜同源多倍體為研究對象，利用免疫熒光分析技術，解析了聯(lián)會復合體相關蛋白ZYP1在減數(shù)分裂前期I過程中的細胞學行為。結果表明：與二倍體相比，白菜同源多倍體減數(shù)分裂期同源染色體聯(lián)會、配對及分離過程基本正常，聯(lián)會復合體蛋白ZYP1抗體熒光信號變化趨勢基本一致，但ZYP1免疫熒光信號顯著增強。因此，與二倍體相比，同源多倍體植物很可能通過增強聯(lián)會復合體蛋白ZYP1的表達水平，以協(xié)調(diào)同源染色體的正常聯(lián)會與配對，進而保證多倍體植物的正常減數(shù)分裂過程。

減數(shù)分裂； 聯(lián)會復合體； ZYP1； 同源四倍體； 白菜

多倍體植物在自然界中廣泛存在。有研究表明，多倍體化是促使植物進化的重要動力[1]。同源多倍體來自內(nèi)部一個或單個物種種群之間的多倍化事件，隨著基因組加倍的進行，單個或者多個基因的功能會有所改變，調(diào)控系統(tǒng)中的一些基因數(shù)量也會增加，這就需要一個系統(tǒng)有規(guī)律的調(diào)控網(wǎng)絡[2]。減數(shù)分裂過程在有性生殖物種代代相傳歷程中是一個重要的環(huán)節(jié)，在整個減數(shù)分裂過程中，前期 Ⅰ 相對復雜一些，會發(fā)生同源染色體間的相互配對、聯(lián)會和重組，這個過程的正常進行，對于之后二價體能否正確形成和同源染色體能否精確分離起著非常重要的作用[3]。

與二倍體相比，同源多倍體植物由于染色體數(shù)目加倍，減數(shù)分裂過程中要維持同源染色體的正常聯(lián)會、配對及分離，需要在調(diào)控機制方面有所改變，以適應由于同源染色體數(shù)目增加而引起的紊亂[4]。聯(lián)會復合體SC 在細線期出現(xiàn)，偶線期逐步組裝，粗線期趨于成熟，而從雙線期開始解體。若其出現(xiàn)異常，將直接導致減數(shù)分裂不能正常進行，甚至不育[5-6]。ZYP1是擬南芥中最早鑒定的參與調(diào)控同源染色體配對與聯(lián)會的橫向細絲蛋白，若ZYP1缺失，聯(lián)會復合體SC則不能正常形成，且減數(shù)分裂前期Ⅰ推遲[7-8]。ZYP1蛋白信號出現(xiàn)在細線期，偶線期逐漸增多，粗線期達到最大，終變期幾乎消失[9-10]。在擬南芥zyp1突變體中，交叉頻率比野生型減少了70%[11]；而水稻zep1突變體中，交叉頻率較野生型有所增加[12]。在RNA干擾的大麥中，只有不到一半的同源染色體配對形成二價體，同時能觀察到許多單價體的出現(xiàn)，導致染色體不分離甚至不育[13-14]。因此，選取白菜二倍體、同源四倍體為研究材料，通過免疫熒光技術，分析了聯(lián)會復合體蛋白ZYP1在減數(shù)分裂過程中的動態(tài)變化，并對其細胞學行為進行了研究。將獲得的ZYP1蛋白多克隆抗體進行免疫熒光染色，以解析多倍體植物減數(shù)分裂期同源染色體的正常配對和聯(lián)會的細胞學機制，為多倍體植物基因組的遺傳穩(wěn)定性提供細胞學理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

白菜品種Yellow sarson二倍體和同源四倍體，由河南省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所提供，種植于河南省農(nóng)業(yè)科學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 擬南芥ZYP1蛋白多克隆抗體的制備 通過克隆擬南芥ZYP1 基因片段，構建重組載體pET-28a(+)- ZYP1 ，優(yōu)化大腸桿菌(Escherichiacoli)誘導表達體系，將親和層析純化后的ZYP1融合蛋白免疫新西蘭大白兔(Oryctolaguscuniculus)，制備ZYP1蛋白的多克隆抗體，并通過Western blot和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)確定抗血清的特異性和效價。具體方法參考文獻[15]。

1.2.2 細胞學制片與觀察 將未開放的白菜花蕾置于固定液(V乙醇︰V冰乙酸=3︰1)中固定5～6 h，然后用清水沖洗干凈，在解剖鏡下用解剖針將花苞剝開挑取花藥，放入酶解液(5%的果膠酶與1%的纖維素酶)中37 ℃ 酶解30 min,然后將花藥置于干凈的玻片上，用解剖針敲碎，滴加100 μL 40%的乙酸，均勻涂布、烘干。滴加10 μL碘化丙啶(PI)染液(50 μg/mL)，蓋上玻片，鏡檢。

1.2.3 免疫熒光分析 將鏡檢過的玻片置于4%多聚甲醛中固定5 min；用PBS緩沖液洗3次，每次5 min；然后取100 μL 0.1%TritonX-100滴加于玻片上，室溫下孵育30 min；PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min，室溫下晾干。每張玻片上滴加200 μL 5%BSA，37 ℃孵育2 h；PBS緩沖液漂洗3次，每次10 min；室溫下晾干后滴加一抗工作液4 ℃孵育過夜。次日，PBS緩沖液漂洗3次，每次10 min；滴加熒光二抗工作液，37 ℃孵育2 h。用PBS緩沖液再次重復漂洗3次，每次10 min，避光晾干后滴加PI染液(50 μg/mL)，抗熒光淬滅劑封片后觀察。

2 結果與分析

2.1 白菜二倍體和同源四倍體減數(shù)分裂過程觀察

圖1所示，白菜二倍體和同源四倍體減數(shù)分裂過程中，細線期時，染色體開始凝集(圖1A和A′)，但仍以細線狀形式存在；偶線期時染色質(zhì)繼續(xù)凝集(圖1B和B′)，同源染色體開始發(fā)生聯(lián)會配對；粗線期時已完成聯(lián)會的2條染色體互相緊靠，纏繞在一起，成為短而粗的染色體(圖1C和C′)；雙線期時同源染色體相互分開，出現(xiàn)交叉現(xiàn)象(圖1D和E，圖1D′和E′)；終變期時，染色體開始向核靠近，緊密凝集(圖1F和F′)；減數(shù)第Ⅰ次分裂后期，同源染色體從赤道板向兩極分離開來(圖1G和G′)；減數(shù)第Ⅱ次分裂后期，姐妹染色單體都相互分開，有四分體出現(xiàn)(圖1H和H′)。結果表明，白菜二倍體和同源四倍體減數(shù)分裂過程中，染色體行為基本一致，同源四倍體白菜減數(shù)分裂后期、末期均無異常，能產(chǎn)生包含正常染色體數(shù)目的配子。

A和A′：白菜二倍體和同源四倍體細線期；B和B′：白菜二倍體和同源四倍體偶線期；C和C′：白菜二倍體和同源四倍體粗線期；D和E，D′和E′：白菜二倍體和同源四倍體雙線期；F和F′：白菜二倍體和同源四倍體終變期；G和G′：白菜二倍體和同源四倍體后期Ⅰ；H和H′：白菜二倍體和同源四倍體后期Ⅱ圖1 白菜二倍體和同源四倍體減數(shù)分裂基本過程

2.2 白菜二倍體和同源四倍體中ZYP1蛋白的免疫熒光分析

本研究使用的材料為二倍體、同源四倍體白菜，用細胞懸液制片法制備處于減數(shù)分裂期細胞的玻片，依次孵育抗血清(一抗)和熒光二抗，經(jīng)充分漂洗之后用PI染液壓片觀察。紅色為PI染液染色后的染色體，綠色代表ZYP1蛋白抗體熒光信號，ZYP1蛋白抗體熒光信號在二倍體、同源四倍體白菜中的變化趨勢基本一致，綠色熒光信號均在減數(shù)分裂細線期出現(xiàn)，偶線期逐漸增多，其中,部分以線狀形式沿染色體軸排布，粗線期時達到最大，雙線期逐步減少，到終變期幾乎消失。將二倍體及同源四倍體中ZYP1蛋白抗體熒光信號進行比較，如圖2所示，ZYP1蛋白抗體綠色熒光信號在細線期開始出現(xiàn)，此時在二倍體及同源四倍體中均較少；到偶線期時,二倍體及同源四倍體中ZYP1蛋白熒光信號均有所增加，但同源四倍體增加更多，比相對應的二倍體中含量多；粗線期時,二倍體及同源四倍體中ZYP1蛋白抗體熒光信號含量均達到最高水平，但同源四倍體中的含量仍比二倍體中的多；雙線期時，信號均開始減少，直至消失。同源四倍體中ZYP1蛋白抗體熒光信號的增多代表ZYP1蛋白表達量的增加，由于染色體加倍，聯(lián)會配對頻率提高，同源四倍體減數(shù)分裂時期對ZYP1蛋白的需求也相應提高，因此，ZYP1蛋白在同源四倍體減數(shù)分裂時期聯(lián)會配對時的表達量更高。

A和 A′：PI染液染色后處于細線期、偶線期、粗線期、雙線期的二倍體白菜和同源四倍體白菜細胞；B和B′：免疫熒光染色后處于細線期、偶線期、粗線期、雙線期的二倍體白菜細胞和同源四倍體白菜細胞中的ZYP1蛋白；C和C′：分別為A、B疊加和A′、B′疊加后的細胞圖2 白菜二倍體和同源四倍體減數(shù)分裂前期Ⅰ過程中ZYP1蛋白動態(tài)觀察

3 結論與討論

有關聯(lián)會復合體蛋白ZYP1在減數(shù)分裂中的表達時期及其作用方面的研究已經(jīng)很多[16-17]，本試驗將同源多倍體中ZYP1的分子細胞學行為與相對應的二倍體進行比較，這為探究多倍體聯(lián)會配對調(diào)控機制奠定了基礎。本研究通過觀察二倍體、同源四倍體白菜在減數(shù)分裂不同時期染色體的一些變化特征發(fā)現(xiàn)，同源四倍體細胞中染色體在加倍后減數(shù)分裂仍能正常進行，整個過程與二倍體材料染色體行為變化一致，但前期Ⅰ聯(lián)會配對頻率明顯提高。而ZYP1聯(lián)會配對中起著一定的調(diào)控作用，多倍體中ZYP1表達量也會發(fā)生相應的變化，因此，對多倍體中ZYP1蛋白的研究有助于探索多倍體聯(lián)會配對頻率提高的內(nèi)在機制。

同源多倍體由于染色體加倍，與二倍體相比要有更復雜的聯(lián)會方式，聯(lián)會頻率也會提高，要維持多倍體中同源染色體穩(wěn)定的聯(lián)會配對，需要一定的調(diào)控機制，而ZYP1蛋白直接參與聯(lián)會配對這一活動。將二倍體與同源四倍體白菜減數(shù)分裂前期Ⅰ各時期的熒光信號進行比較，直接清楚地了解減數(shù)分裂前期多倍體中ZYP1蛋白的表達量，并且結合ZYP1蛋白的功能，從而在細胞水平上闡明了同源四倍體白菜中ZYP1蛋白表達量提高的機制，有助于鞏固同源染色體的聯(lián)會和配對過程，以保證多倍體植物減數(shù)分裂過程正常，產(chǎn)生有功能的雌雄配子，保證多倍體植物正常繁衍。

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Cytological Analysis of Synaptonemal Complex Protein ZYP1 during Meiosis in Autopolyploid Brassica rapa

WEI Zhenzhen1,WU Ruihua1,WEI Xiaochun2,YANG Yan1,TIAN Baoming1,WEI Fang1*,SHI Gongyao1,CAO Gangqiang1,ZHANG Xiaowei2

( 1.School of Life Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China; 2.Institute of Horticulture,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

To understand the cytological mechanism of pairing and synapsis of homologous chromosomes in polyploid plants,the synaptonemal complex protein ZYP1 was cytologically analysed using immunostaining during meiotic prophase Ⅰ in autopolyploidBrassicarapain comparison with diploid counterparts.The results showed that,compared with diploids,autopolyploids showed a regular meiosis course including normal pairing,synapsis and separation of homologous chromosomes,and a similar dynamic behavior of ZYP1 protein.However,the fluorescence signal of ZYP1 revealed by their specific antibody was significantly enhanced in autopolyploids in contrast with diploids.Therefore,the present study indicated that autopolyploids probably increased the expression level of ZYP1 protein to coordinate pairing and synapsis of homologous chromosomes,to ensure a normal meiosis behavior in polyploid plants.

meiosis; synaptonemal complex; ZYP1; autoteraploid;Brassicarapa

2016-10-24

NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金項目(U1204308)；河南省教育廳高等學校重點科研項目(13A180437)

韋珍珍(1992-)，女，山西長治人，在讀碩士研究生，研究方向：植物細胞遺傳學。E-mail：1114242391@qq.com

*通訊作者：位 芳(1981-)，男，河南項城人，副教授，博士，主要從事植物分子細胞遺傳學方面的研究。 E-mail：fangwei@zzu.edu.cn

S634

A

1004-3268(2017)02-0078-05