張耀廣，楊宗燦，劉向真，楊永鋒，梁 慎，李家美*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南 鄭州 450000； 3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 鄭州 450002)

陳化煙葉中1株果膠酶高產(chǎn)菌的分離、篩選與鑒定

張耀廣1，楊宗燦2，劉向真2，楊永鋒1，梁 慎3，李家美1*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南 鄭州 450000； 3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 鄭州 450002)

烤煙中的高果膠含量嚴(yán)重影響煙草吸食品質(zhì)和陳化速度。為降低煙草中的果膠含量，提高煙草及煙草制品的品質(zhì)及安全性，從不同年份和不同產(chǎn)地的18份復(fù)烤煙草中共分離篩選出有降解果膠能力的細(xì)菌38株和真菌9株。其中，XC-8、XC-30、SMXP-57、SMXP-58、SMXP-62共5株細(xì)菌具有較高的降解果膠的能力，在發(fā)酵時(shí)間24 h、發(fā)酵溫度30 ℃、接種量10%條件下果膠酶活性分別為176、179、143、192、121 U/mL。其中，菌株SMXP-58酶活性最高(192 U/mL)，通過(guò)16S rDNA序列分析并結(jié)合形態(tài)、理化特性分析，確定SMXP-58菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。將SMXP-58菌株制成的菌劑(9.6×107個(gè)/mL)噴施于100 g煙葉表面，發(fā)酵3 d的煙葉評(píng)吸總分提高了1.02，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，在發(fā)酵時(shí)間60 h、菌液量1 mL、水量20 mL的條件下，煙葉中果膠含量最低(7.45%)。

陳化煙葉； 枯草芽孢桿菌； 果膠酶； 酶活性

煙葉陳化是提高煙葉吸食品質(zhì)、增加香氣、降低危害性的重要環(huán)節(jié)。未經(jīng)陳化的烤煙中因含有較多的蛋白質(zhì)、果膠、纖維素、淀粉和高級(jí)脂肪酸等大分子物質(zhì)，在燃燒過(guò)程中產(chǎn)生令人不舒服的氣味而不能直接吸食。其中，以α-1,4糖苷鍵聚合形成的聚半乳糖醛酸[1]為基本結(jié)構(gòu)的果膠是煙草中的重要成分。果膠類物質(zhì)含量過(guò)高，會(huì)造成煙草燃燒不完全而產(chǎn)生甲醇，甲醇進(jìn)一步氧化成甲醛、甲酸等，對(duì)煙草吸食及安全性產(chǎn)生不利影響。因此，果膠含量已成為評(píng)價(jià)煙草及煙草制品品質(zhì)的重要指標(biāo)，降低煙葉中的果膠含量對(duì)提高煙草品質(zhì)有重要意義[2-4]。

目前，為加速煙草陳化速度，提高煙草吸食質(zhì)量、安全性及經(jīng)濟(jì)效益，人們常利用有益微生物來(lái)降解煙葉中大分子物質(zhì)的含量。在煙葉醇化或發(fā)酵中，煙葉表面微生物的種類和數(shù)量對(duì)醇化效果影響較大[3]。Chen等[4]從醇化多年的煙葉中分離到一株能夠有效降低白肋煙、香料煙和津巴布韋烤煙等煙葉煙堿含量的假單胞菌(Pseudomonassp.)，該菌的酶液可以改善煙葉吸食品質(zhì)、減少煙葉刺激性及青雜氣；Gong等[5]從煙草栽培土壤中分離到一株能有效降解煙葉煙堿含量的紅球菌(Rhodococcussp.)；黃靜文等[6]從烤煙葉面上分離篩選出一株短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)Van35，將其制成菌液噴施于煙絲上并置于45 ℃、濕度60%條件下發(fā)酵處理21 d后，煙絲中纖維素、蛋白質(zhì)、總氮和煙堿含量均有所下降。謝和等[7]在烤煙發(fā)酵過(guò)程中施加枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，經(jīng)過(guò)45 ℃、相對(duì)濕度65%條件下發(fā)酵8 d，煙葉中總游離氨基酸含量均有不同程度的降低。而在利用產(chǎn)果膠酶微生物降解煙草果膠含量方面，人們也做了很多研究工作。何偉等[8]從片煙樣品中篩選得到一株果膠酶高產(chǎn)菌株克雷伯氏桿菌(Klebsiellasp.)，并對(duì)此菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。賀兆偉等[9]報(bào)道了一株疣孢青霉(Penicilliumverruculosum)，能夠降解煙草果膠。代同成等[10]以果膠為碳源，對(duì)津巴布韋片煙煙葉表面產(chǎn)果膠酶細(xì)菌進(jìn)行了分離和篩選。而在自然陳化中，果膠難以被降解。目前，從陳化煙葉中分離篩選具有較強(qiáng)降解果膠能力的微生物以降解煙葉中果膠的研究較少。鑒于此，本研究以源自河南、云南和福建不同年份的陳化煙葉為研究材料，從中分離篩選出能夠高效降解果膠的微生物，用以降解煙葉中果膠質(zhì)，以進(jìn)一步提高煙葉的吸食品質(zhì)，提高煙葉吸食的安全性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試煙葉 河南(許昌和三門峽)、福建(三明和南平)、云南(楚雄和臨滄)6個(gè)產(chǎn)地2011、2012、2013年3 a共18份復(fù)烤煙葉樣品，粉碎后用于篩選果膠酶產(chǎn)生菌；2015年洛陽(yáng)復(fù)烤煙DBH41用于篩選菌株的應(yīng)用驗(yàn)證。

1.1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、H2O 1 000 mL、瓊脂粉 12 g，pH值 7.0，121 ℃滅菌20 min。液體NA培養(yǎng)基不加瓊脂粉，該培養(yǎng)基用于細(xì)菌的分離與培養(yǎng)。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂粉 12 g、H2O 1 000 mL，用于煙葉表面真菌的分離與篩選。

果膠酶產(chǎn)生菌選擇培養(yǎng)基：果膠 4 g、K2HPO40.1 g、MgSO40.5 g、NaNO33 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、剛果紅0.4 g、瓊脂粉12 g、H2O 1 000 mL，pH 值7.0，121 ℃滅菌20 min，用于篩選降解果膠的微生物。

產(chǎn)果膠酶培養(yǎng)基：桔皮粉1 g、K2HPO40.1 g、MgSO40.5 g、NaNO33 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、H2O 1 000 mL，用于微生物果膠酶誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 煙葉中微生物的初步分離 稱取1 g煙葉粉末，加入含有9 mL無(wú)菌水的試管中，250 r/min振蕩15 min后，靜置5 min。采用2層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾。取此菌懸液1 mL于9 mL無(wú)菌水中，依次配制10-2和10-3稀釋度的菌懸液；并吸取10-2、10-3稀釋度的菌懸液100 μL，分別涂布于NA和PDA培養(yǎng)基平板上，并分別置于37 ℃和28 ℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.2 產(chǎn)果膠酶微生物的篩選 將上述分離獲得的細(xì)菌、真菌依次接種到果膠酶產(chǎn)生菌選擇培養(yǎng)基上，細(xì)菌在37 ℃條件下培養(yǎng)，真菌在28 ℃條件下培養(yǎng)。觀察并計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑的比值和透明圈明顯程度。

將能夠在果膠酶產(chǎn)生菌選擇培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈的菌株接種到含有5 mL液體NA的18 mm×180 mm的試管中，30 ℃下150 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，按照10%的接種量接入含50 mL產(chǎn)果膠酶培養(yǎng)基的錐形瓶中，30 ℃下150 r/min培養(yǎng)24 h。取發(fā)酵24 h的菌液，于3 500 r/min條件下離心10 min后測(cè)其果膠酶活性。

1.2.3 煙葉中果膠酶產(chǎn)生菌的果膠酶活性測(cè)定 采用DNS法[11]測(cè)定果膠酶活性，利用3,5-二硝基水楊酸與醛糖共熱產(chǎn)生棕紅色的氨基化合物，其顏色淺深在一定范圍內(nèi)與還原糖含量成正比的原理，于540 nm處測(cè)其吸光度，根據(jù)還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出果膠酶活性。在含桔皮粉的產(chǎn)果膠酶培養(yǎng)基中進(jìn)行菌株果膠酶誘導(dǎo)培養(yǎng)，并測(cè)其酶活性。定義1 mL酶液在30 ℃條件下，1 h分解果膠產(chǎn)生1 mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活性單位。酶活性計(jì)算公式:X=[(A-A0)×D×5]/(K×t)，式中，A為酶液吸光度，A0為空白樣的吸光度，K為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，D為稀釋倍數(shù)(1 000倍)，t為反應(yīng)時(shí)間(h)。

1.2.4 果膠酶產(chǎn)生菌SMXP-58的16S rDNA分析 以FP(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’)和RP(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)為引物，對(duì)篩選得到的果膠酶產(chǎn)生菌SMXP-58進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL：TaKaRa LATaq(5 U/μL)0.5 μL、10×LATaqbuffer 5 μL、dNTP mixture 2 μL、模板 0.5 μg、FP (10 μmol/L)2 μL、RP(10 μmol/L)2 μL，加ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 45 s、72 ℃ 80 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

下載同源性較高的14種菌株[蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、簡(jiǎn)單芽孢桿菌(Bacillussimplex)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、嗜硼芽孢桿菌(Bacillusboroniphilus)、梭形芽孢桿菌(Bacillusfusiformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)等]的16S rDNA序列，將測(cè)得序列與14種菌株通過(guò)DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.2.5 果膠酶產(chǎn)生菌SMXP-58的形態(tài)學(xué)與理化性質(zhì)鑒定 將SMXP-58接種在NA固體培養(yǎng)基上，于37 ℃條件下培養(yǎng)24～72 h后，觀察菌落外部形態(tài)特征；使用顯微鏡觀察真菌形態(tài)，油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)[12-13]。

參考朱大恒等[14]的方法，對(duì)果膠酶產(chǎn)生菌SMXP-58分別進(jìn)行革蘭氏染色、V-P、過(guò)氧化氫酶、甲基紅試驗(yàn)以及抗生素反應(yīng)試驗(yàn)。

1.2.6 果膠酶產(chǎn)生菌SMXP-58在煙葉發(fā)酵中的應(yīng)用

1.2.6.1 SMXP-58菌劑的制備 將保存?zhèn)溆玫木闟MXP-58移入LB平板上，置于生化氣候箱中37 ℃培養(yǎng)1～2 d，于超凈工作臺(tái)中刮取少量菌體，加入到含有5 mL液體LB的18 mm×180 mm的試管中，30 ℃、150 r/min條件下于搖床中培養(yǎng)過(guò)夜，將1 mL菌懸液接種于含100 mL LB培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶(已滅菌)中，30 ℃、150 r/min條件下于搖床中培養(yǎng)，至菌懸液OD540值為2時(shí)，3 600 r/min離心10 min，棄上清液，加入等體積的無(wú)菌水，即得液態(tài)菌劑(9.6×107個(gè)/mL)。

1.2.6.2 SMXP-58菌劑發(fā)酵不同時(shí)間對(duì)煙葉感官品質(zhì)的影響 取100 g 2015年洛陽(yáng)復(fù)烤煙DBH41，施用菌劑量為1 mL、水量為20 mL，同時(shí)以不施加菌劑和水為CK，分別發(fā)酵1(T1)、2(T2)、3(T3)、4(T4)、5(T5)、6(T6) d，于30 ℃暗處發(fā)酵。發(fā)酵完成后，再將煙葉80 ℃處理30 min，然后45 ℃烘干，平衡水分后制成卷煙并進(jìn)行評(píng)吸。

1.2.6.3 SMXP-58菌劑發(fā)酵煙葉條件的正交試驗(yàn) 根據(jù)1.2.6.2的結(jié)果，進(jìn)一步優(yōu)化SMXP-58菌劑發(fā)酵煙葉的條件：取100 g 2015年洛陽(yáng)復(fù)烤煙DBH41，以發(fā)酵時(shí)間(A)、菌液量(B)、水量(C)為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)三因素三水平(表1)正交試驗(yàn)，優(yōu)化SMXP-58菌株有效降解煙葉果膠的適宜條件。

表1 菌株SMXP-58降解煙葉中果膠的正交試驗(yàn)因素和水平

煙葉中果膠含量采用咔唑硫酸分光光度法測(cè)定[15]，根據(jù)不同煙葉樣品中半乳糖醛酸(GA)的含量，換算出相應(yīng)煙葉中的果膠含量。GA=[C×50/(5×50)]/(W×106)×100%，其中，C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的所測(cè)果膠液中GA的濃度(mg/L)，W為煙葉樣品粉末質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 陳化煙葉中果膠酶產(chǎn)生菌的初篩結(jié)果

以河南(許昌和三門峽)、福建(三明和南平)、云南(楚雄和臨滄)6個(gè)產(chǎn)地2011、2012、2013年3個(gè)年份共計(jì)18份復(fù)烤煙葉樣品為材料，經(jīng)菌落大小、顏色、形態(tài)分析，共分離獲得細(xì)菌123株、真菌9株。這些細(xì)菌、真菌經(jīng)果膠酶產(chǎn)生菌選擇培養(yǎng)基篩選，獲得能夠產(chǎn)生果膠降解透明圈的細(xì)菌38株、真菌9株。將透明圈/菌落直徑較大的5株細(xì)菌分別命名為XC-8、XC-30、SMX-57、SMXP-58、SMX-62，透明圈/菌落直徑分別為1.9、1.8、1.6、2.5、1.6，其中SMXP-58菌株透明圈與菌落直徑比值最大、最明顯。然后，對(duì)此5株細(xì)菌進(jìn)行了果膠酶活性測(cè)定。

2.2 陳化煙葉中高產(chǎn)果膠酶產(chǎn)生菌的復(fù)篩結(jié)果

將初篩的 5個(gè)菌株接種于產(chǎn)果膠酶培養(yǎng)基中，于30 ℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，測(cè)定OD540并計(jì)算果膠酶活性(表2)。由表2可見(jiàn)，菌株SMXP-58具有最高的果膠酶活性(192 U/mL)，可以作為煙葉中高果膠酶產(chǎn)生菌候選菌株。

表2 煙葉中果膠酶產(chǎn)生菌的果膠酶活性 U/mL

2.3 果膠酶產(chǎn)生菌SMXP-58的16S rDNA序列分析

采用16S rDNA基因片段通用引物FP/RP對(duì)SMXP-58進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行測(cè)序，目的片段為1 416 bp，使用DNAMAN軟件，選取同源性較高的14種模式細(xì)菌菌株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，菌株SMXP-58與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的同源性最高，達(dá)99%，表明SMXP-58與枯草芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近(圖1)。

圖1 菌株SMXP-58與相關(guān)菌株基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

2.4 果膠酶產(chǎn)生菌SMXP-58的形態(tài)學(xué)觀察

在30 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，SMXP-58菌落直徑為2～5 mm，乳白色，無(wú)光澤，不透明，表面平整或出現(xiàn)不規(guī)則褶皺凸起，菌落近圓形或不規(guī)則，菌落邊緣呈不規(guī)則細(xì)波狀。菌株個(gè)體呈桿狀，很少呈鏈狀，菌體大小為(0.7～1.0) μm×(1.4～2.0)μm(圖2)。

圖2 菌株SMXP-58的形態(tài)(×100)

2.5 果膠酶產(chǎn)生菌SMXP-58的理化鑒定

經(jīng)試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，菌株SMXP-58革蘭氏染色呈陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)呈陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)呈陽(yáng)性，酪素水解試驗(yàn)呈陽(yáng)性?？股?30 μg/mL)試驗(yàn)表明，該菌對(duì)鏈霉素、氨芐青霉素有抗性，對(duì)頭孢菌素、卡那霉素敏感(表3)。

表3 菌株SMXP-58的部分生理生化特性

注：+表示陽(yáng)性，-表示陰性；Cef+、Str+、Kan+、Amp+分別為頭孢菌素、鏈霉素、卡那霉素、氨芐青霉素。

2.6 SMXP-58菌劑發(fā)酵不同時(shí)間對(duì)煙葉感官品質(zhì)的影響

由表4可見(jiàn)，施用SMXP-58菌劑后發(fā)酵1、2、3、4、5、6 d，煙葉的評(píng)吸總分較CK有所提升，以發(fā)酵3 d的評(píng)吸總分最高，為59.51，較CK提升1.02分?？梢?jiàn),最佳發(fā)酵時(shí)間在3 d左右，故進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化時(shí)在3 d(72 h)的基礎(chǔ)上各±12 h，將發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)為60、72、84 h。

表4 經(jīng)SMXP-58菌劑發(fā)酵煙葉的評(píng)吸總分

2.7 SMXP-58菌劑發(fā)酵煙葉條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

由于在一定范圍內(nèi)，煙葉果膠含量越低越好。由表5可見(jiàn)，最優(yōu)水平組合為A1B1C2，即發(fā)酵時(shí)間為60 h，菌液量為1 mL(100 g煙葉)，水量為20 mL(100 g煙葉)，在此條件下發(fā)酵效果最好，果膠含量最低；比較R值可知RB>RC>RA，可見(jiàn)，菌液量對(duì)發(fā)酵效果的影響最大，其次是水量，而發(fā)酵時(shí)間的影響最小。

對(duì)優(yōu)化處理方案進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，將由菌株SMXP-58制成的菌劑噴施于100 g煙葉表面，按發(fā)酵時(shí)間60 h、菌液量1 mL、水量20 mL對(duì)煙葉進(jìn)行發(fā)酵后，煙葉中的果膠含量為7.45%，低于表5中結(jié)果。

表5 菌株SMXP-58優(yōu)化降解煙葉中果膠的正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究分離出123株細(xì)菌和9株真菌，總體數(shù)量較少。韓錦峰等[16]認(rèn)為，煙葉中某些成分會(huì)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，且煙葉烘烤的高溫殺死了大量不耐高溫的微生物。其中，具有果膠酶分泌特性的微生物包括38株細(xì)菌(占總體細(xì)菌的30.9%)以及9株真菌，對(duì)果膠酶產(chǎn)生菌進(jìn)行初篩時(shí)，5個(gè)菌株計(jì)算得出的透明圈/菌落直徑與復(fù)篩時(shí)測(cè)得的果膠酶活性有一定的相關(guān)性，透明圈/菌落直徑大的菌株果膠酶活性也較高，根據(jù)透明圈/菌落直徑大小可簡(jiǎn)化篩選果膠酶產(chǎn)生菌的過(guò)程。其中，菌株SMXP-58表現(xiàn)出透明圈較大、透明度高、果膠酶活性高的特點(diǎn)。

16S rDNA序列分析結(jié)果顯示，SMXP-58菌株與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的同源性高達(dá)99%，親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)學(xué)與理化鑒定，參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[12]，確定菌株SMXP-58為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

將由菌株SMXP-58制成的菌劑(9.6×107個(gè)/mL)噴施于100 g煙葉表面，在發(fā)酵時(shí)間60 h、菌液量1 mL、水量20 mL的條件下，煙葉中果膠含量可降低至7.45%，有效加速了煙葉中果膠的降解并改善煙葉品質(zhì)。

[1] 趙銘欽,汪耀富,杜長(zhǎng)彬,等.陳化期間煙葉香氣成分消長(zhǎng)規(guī)律的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1997,2(3):73-77.

[2] 朱大恒,韓錦峰,張愛(ài)萍,等.自然醇化與人工發(fā)酵對(duì)烤煙化學(xué)成分變化的影響比較研究[J].煙草科技,1999(1):3-5.

[3] 楊金奎,段焰青,陳春梅,等.醇化煙葉表面可培養(yǎng)微生物的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析[J].煙草科技,2008(11):51-55.

[4] Chen C M,Li X E,Yang J K,etal.Isolation of nicotine-degrading bacteriumPseudomonassp.Nic22,and its potential application in tobacco processing[J].International Biodeterioration & Biodegradation,2008,62(3):226-231.

[5] Gong X W,Yang J K,Duan Y Q,etal.Isolation and characterization ofRhodococcussp.Y22 and its potential application to tobacco processing[J].Research in Microbiology,2009,160(3):200-204.

[6] 黃靜文,段焰青,者為,等.短小芽孢桿菌改善煙葉品質(zhì)的研究[J].煙草科技,2010(8):61-64.

[7] 謝和,韓忠禮,趙維娜.微生物發(fā)酵對(duì)烤煙內(nèi)在品質(zhì)的影響[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào),1999,18(4):227-230.

[8] 何偉,付相敏,王金華,等.一株從片煙中分離的果膠酶菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].湖北工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,30(5):16-19,41.

[9] 賀兆偉,奚家勤,鄧賓玲,等.煙葉中高產(chǎn)果膠酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)[J].煙草科技,2013(5):72-76.

[10] 代同成,范堅(jiān)強(qiáng),鄭湖南,等.片煙產(chǎn)果膠酶細(xì)菌的鑒定及酶活測(cè)定[J].微生物學(xué)通報(bào),2011,38(6):816-824.

[11] 張飛,岳田利,費(fèi)堅(jiān),等.果膠酶活力的測(cè)定方法研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2004,13(4):134-137.

[12] 布坎南R E,吉本斯N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].8版.北京:科學(xué)出版社,1984:274-442.

[13] 李振高,駱永明,滕應(yīng).土壤與微生物研究法[M].北京:科學(xué)出版社,2008:162-163.

[14] 朱大恒,李彩霞.煙氣有害成分與煙葉化學(xué)成分的關(guān)系[J].煙草科技,1999(4):25-27.

[15] 張小玲.果膠的咔唑硫酸分光光度測(cè)定法研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,34(1):75-78.

[16] 韓錦峰,朱大恒,劉衛(wèi)群,等.陳化發(fā)酵期間烤煙葉面微生物活性及其應(yīng)用研究[J].中國(guó)煙草科學(xué),1997(4):13-14.

Isolation,Screening and Identification of A High Pectinase-producing Bacterial Strain from Aging Tobacco Leaf

ZHANG Yaoguang1,YANG Zongcan2,LIU Xiangzhen2,YANG Yongfeng1,LIANG Shen3,LI Jiamei1*

(1.College of Life Sciences,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 2.Technology Center of China Tobacco Henan Industrial Co.,Ltd.,Zhengzhou 450000,China; 3.Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

The amount of pectin in flue-cured tobacco seriously influences the qulity and aging speed of tobacco.In order to decrease the pectin content in flue-cured tobacco,improve the quality and safety of flue-cured tobacco,38 bacterial strains and 9 fungi strains which could degrading the pectin were isolated from 18 kinds of flue-cured tobacco from different years and different origins.The bacterial strains XC-8,XC-30,SMXP-57,SMXP-58,SMXP-62 possessed higher ability of degrading pectin substance,and their enzymatic activity were 176,179,143,192,121 U/mL when the culture period was 24 h at the temperature of 30 ℃ and innoculation amount of 10%.Strain SMXP-58 possessed the highest enzymatic activity(192 U/mL),which was identified asBacillussubtilisbased on 16S rDNA sequence analysis and morphological,physichemical characters analysis.Total score of smoking increased by 1.02 after spraying the bacterial agent(9.6×107bacteria per milliliter) made from SMXP-58 on the 100 g tabacco.Tobacc pectin was the least with 7.45% under the conditions of fermenting 60 h，bacterial agent 1 mL,water 20 mL.

aging tobacco leaf;Bacillussubtilis; pectinase; enzymatic activity

2015-08-15

河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(30800675)

張耀廣(1990-)，男，河南漯河人，在讀碩士研究生，研究方向：煙葉陳化。E-mail:ygzhanghn@sina.com

*通訊作者：李家美(1969-)，男，河南信陽(yáng)人，副教授，博士，主要從事植物資源保護(hù)研究。E-mail:jmli@ibcas.ac.cn

TS41+4

A

1004-3268(2017)02-0143-05