仲 艷，李家春，李瑛光，王振中，黃文哲，蕭 偉（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港 222001）

HPLC法測定二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥中的有關(guān)物質(zhì)

仲 艷＊，李家春，李瑛光，王振中，黃文哲，蕭 偉#（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港 222001）

目的：建立測定二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥中有關(guān)物質(zhì)的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Waters Symmetry C18，流動相為甲醇-0.01 mol/L乙酸銨溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為240 nm，柱溫為40℃，進樣量為10μL。結(jié)果：在該色譜條件下，主成分峰與各雜質(zhì)峰分離度均良好；雜質(zhì)A、B、C和二對甲苯磺酸緣生替尼檢測質(zhì)量濃度線性范圍均為0.25～2.0μg/mL（r≥0.999 0），雜質(zhì)A、B、C的定量限分別為0.5、0.5、2.5 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜1.0%；加樣回收率分別為97.9%～102.6%、95.1%～107.7%、95.8%～107.5%，RSD分別為1.4%、4.2%、4.1%（n＝9）。結(jié)論：該方法專屬性好、操作簡便，可用于二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥中有關(guān)物質(zhì)的測定。

二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥；高效液相色譜法；有關(guān)物質(zhì)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，占女性所有惡性腫瘤的23%[1-3]。在我國，乳腺癌發(fā)病率逐年增加，已經(jīng)成為城市女性的頭號癌癥殺手。二甲苯磺酸拉帕替尼是葛蘭素史克公司研發(fā)的一種新型的小分子靶向雙重酪氨酸激酶抑制劑，于2007年3月13日獲美國食品與藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市，與抗癌藥物卡培他濱聯(lián)合用于治療晚期或轉(zhuǎn)移性表皮生長因子受體陽性乳腺癌。近年來，關(guān)于二甲苯磺酸拉帕替尼在其他類型腫瘤方面的研究越來越多，其有望成為一種潛在的多腫瘤靶向治療藥物[4-8]。二對甲苯磺酸緣生替尼是我公司以二甲苯磺酸拉帕替尼為先導(dǎo)化合物自主研發(fā)的新藥。由于本品在合成過程中難免引入合成原料、中間體、副產(chǎn)物等雜質(zhì)，如6-碘喹唑啉-4-酮（雜質(zhì)A）、3-氯-4-［（3-氟苯基）甲氧基］苯胺（雜質(zhì)B）、N-[3-氯-4-（3-氟芐氧基）苯基]-6-碘-4-喹唑啉胺（雜質(zhì)C）等，因此需要建立合適的測定方法以實現(xiàn)對本品中有關(guān)物質(zhì)的控制。本研究依據(jù)2015年版《中國藥典》中藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則的相關(guān)規(guī)定[9]，參考相關(guān)文獻[10-12]，優(yōu)化高效液相色譜（HPLC）條件，建立了測定二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥中有關(guān)物質(zhì)的方法。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括G1329B二極管陣列檢測器、G1316A自動進樣器等（美國Agilent公司）；BP211D型電子分析天平、PB-10型pH計（德國賽多利斯公司）；ZMQS50001型超純水機（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

二對甲苯磺酸緣生替尼對照品（批號：120701，純度：99.8%）和雜質(zhì)A、B、C對照品（批號：120803、120811、120824，純度均為99.5%）及二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥（批號：121001、121002、121003）均由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.01 mol/L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：240 nm；柱溫：40℃；進樣量：10μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白對照溶液 以甲醇-水（50∶50，V/V）作空白對照溶液。

2.2.2 雜質(zhì)對照品溶液 分別取雜質(zhì)A、B、C對照品各約10 mg，精密稱定，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇-乙腈溶液（50∶50，V/V）溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)對照品貯備液。精密量取該貯備液適量，加甲醇-水（50∶50，V/V）制成每1 mL中約含雜質(zhì)A、B、C各1 μg的雜質(zhì)對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 取樣品適量，精密稱定，加甲醇-水（50∶50，V/V）溶解并制成每1 mL中約含二對甲苯磺酸緣生替尼1 mg的供試品溶液。

2.2.4 對照溶液 精密量取“2.2.3”項下供試品溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，加甲醇-水（50∶50，V/V）稀釋至刻度，搖勻，即得對照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性溶液 取二對甲苯磺酸緣生替尼對照品約20 mg，精密稱定，置于20 mL量瓶中，精密加入“2.2.2”項下的雜質(zhì)對照品貯備液0.2 mL，再加甲醇-水（50∶50，V/V）溶解并稀釋制成每1 mL中約含二對甲苯磺酸緣生替尼和雜質(zhì)A、B、C分別為1.10 mg、10.67 μg、10.64 μg、10.19 μg的系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 專屬性試驗

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗 精密量取“2.2”項下空白對照溶液、供試品溶液、系統(tǒng)適用性溶液各10μL注入HPLC儀進樣，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果表明，空白對照對樣品中有關(guān)物質(zhì)測定無干擾，二對甲苯磺酸、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、緣生替尼、雜質(zhì)C的保留時間分別是4.242、15.519、22.335、30.164、43.565 min，主成分峰與各雜質(zhì)峰的分離度良好，各雜質(zhì)峰間的分離度均＞1.5，拖尾因子均在0.9～1.1范圍內(nèi)。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.3.2 強制降解試驗 分別精密稱取樣品約50 mg，共5份，各置于50 mL量瓶中，一份加1 mol/L鹽酸溶液10 mL，在水?。?2℃）中加熱4 h，放冷，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性，加甲醇-水（50∶50，V/V）稀釋至刻度，搖勻，作為酸破壞樣品溶液；一份加1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL，在水?。?2℃）中加熱8 h，放冷，用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至中性，加甲醇-水（50∶50，V/V）稀釋至刻度，搖勻，作為堿破壞樣品溶液；一份加0.3%過氧化氫溶液10 mL，在水?。?2℃）下加熱0.5 h，放冷，加甲醇-水（50∶50，V/V）稀釋至刻度，搖勻，作為氧化破壞樣品溶液；一份加甲醇-水（50∶50，V/V）10 mL，在水?。?2℃）下加熱10 h，放冷，加甲醇-水（50∶50，V/V）稀釋至刻度，搖勻，作為高溫破壞樣品溶液；一份加甲醇-水（50∶50，V/V）溶解并稀釋至刻度，在強光4 500 lx下照射10 d，作為光照破壞樣品溶液。分別精密量取10μL上述5種破壞樣品溶液注入HPLC儀測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果表明，樣品在堿破壞條件下破壞不明顯；在酸、氧化、高溫、光照破壞條件下破壞明顯，且均能檢出雜質(zhì)B；在酸及氧化破壞條件下均檢出雜質(zhì)A。在該色譜條件下，主成分峰與各雜質(zhì)峰、各雜質(zhì)峰之間均可以達(dá)到良好的分離，證明本方法的專屬性良好，適宜進行樣品的有關(guān)物質(zhì)測定。

2.4 線性關(guān)系考察

取雜質(zhì)A、B、C及二對甲苯磺酸緣生替尼對照品各約10 mg，精密稱定，置于同一100 mL量瓶中，加甲醇-水（50∶50，V/V）溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為線性工作貯備液。精密量取上述貯備液適量，分別加甲醇-水（50∶50，V/V）稀釋制成各成分質(zhì)量濃度均約為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL的系列線性工作溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，并以待測成分峰面積（y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得到雜質(zhì)A、B、C及二對甲苯磺酸緣生替尼的回歸方程和線性范圍，并用二對甲苯磺酸緣生替尼與雜質(zhì)A、B、C的回歸方程的斜率相比得校正因子，詳見表2。

表2 回歸方程、線性范圍和校正因子Tab 2 Regression equations，linear range and correction factor

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.4”項下線性工作貯備液適量，加空白對照溶液逐級稀釋至一定質(zhì)量濃度，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，當(dāng)信噪比為10∶1時計算得到雜質(zhì)A、B、C及二對甲苯磺酸緣生替尼的定量限分別為0.5、0.5、2.5、1.0 ng；當(dāng)信噪比為3∶1時計算得到雜質(zhì)A、B、C及二對甲苯磺酸緣生替尼的檢測限分別為0.1、0.1、0.1、0.2 ng。

2.6 精密度試驗

取“2.4”項下雜質(zhì)A、B、C及二對甲苯磺酸緣生替尼質(zhì)量濃度分別為1.0μg/mL的線性工作溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)A、B、C及緣生替尼峰面積的RSD分別為0.2%、0.3%、0.3%、0.1%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密稱取樣品（批號：121001）適量，分別按“2.2.2”和“2.2.3”項下方法制備供試品溶液和對照溶液。取上述兩種溶液各適量，分別于室溫放置0、2、4、6、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，對照溶液緣生替尼峰面積的RSD＝0.5%（n＝6），未知最大單個雜質(zhì)及雜質(zhì)總和峰面積的RSD均為0.1%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

精密稱取樣品（批號：121001）適量，分別按“2.2.2”和“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液和6份對照溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，未知最大單個雜質(zhì)及雜質(zhì)總和峰面積的RSD分別為0.1%和0.2%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取樣品（批號：121001）約10 mg，共9份，每3份分別加入約相當(dāng)于二對甲苯磺酸緣生替尼量的0.05%、0.10%、0.15%的雜質(zhì)A、B、C對照品，分別按“2.2.3”和“2.2.2”項下方法制備供試品溶液和雜質(zhì)對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.10 樣品有關(guān)物質(zhì)測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”和“2.2.3”項下方法制備供試品溶液和對照溶液。精密量取對照溶液10 μL注入HPLC儀中，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的20%～25%；再精密量取上述兩種溶液各10μL，分別注入HPLC儀進樣測定，記錄峰面積，并以1%自身對照法計算樣品中有關(guān)物質(zhì)的含量，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

因二對甲苯磺酸緣生替尼在240 nm波長處有最大吸收，且已知雜質(zhì)A、B、C和強制降解產(chǎn)生的未知雜質(zhì)均在240 nm波長處有較大吸收，綜合考慮選擇240 nm作為本方法的檢測波長。

3.2 色譜柱的選擇

通過對4個生產(chǎn)廠家的5根色譜柱進行考察——色譜柱1：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、色譜柱2：Waters Symmetry Shield RP18 C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）、色譜柱3：Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、色譜柱4：Welch Polar C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、色譜柱5：Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），結(jié)果表明，采用Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）對破壞樣品溶液的分離度最佳，所以最終選擇該色譜柱進行試驗。

3.3 流動相的選擇

流動相采用甲醇-水或乙腈-水時，二對甲苯磺酸和緣生替尼均峰形差，因此考察了磷酸鉀鹽、磷酸銨鹽和乙酸銨鹽改善峰形。結(jié)果，3種無機鹽均能有效改善峰形，考慮到乙酸銨為揮發(fā)性無機鹽，對儀器系統(tǒng)的損害小，所以確定選擇乙酸銨。通過考察發(fā)現(xiàn)，乙酸銨在0.01 mol/L濃度下，強制降解試驗各破壞樣品的各色譜峰均可達(dá)到有效分離，所以乙酸銨濃度確定為0.01 mol/L。而以甲醇作為有機相時緣生替尼的色譜峰形較使用乙腈時好，所以有機相確定選擇甲醇。另外，采用等度洗脫時，二對甲苯磺酸色譜峰與強制降解產(chǎn)生的雜質(zhì)峰難以分開，因此最終選擇甲醇-0.01 mol/L乙酸銨溶液為流動相梯度洗脫。

3.4 方法耐用性考察

在其他色譜條件不變情況下，當(dāng)分別選擇柱溫變化±5℃、流速變化±0.2 mL/min、流動相中甲醇比例變化±5%、流動相中乙酸銨溶液濃度變化±50%時，考察緣生替尼峰與各雜質(zhì)峰的分離情況，以驗證方法的耐用性。結(jié)果表明，上述各種條件下緣生替尼峰與各雜質(zhì)峰、各雜質(zhì)峰之間的分離度均符合規(guī)定，表明本方法耐用性良好。

3.5 強制降解試驗的物料平衡考察

在強制降解試驗中，酸、堿、氧化、高溫、光照破壞試驗的樣品物料平衡值均在95%～105%范圍內(nèi)，表明該色譜條件可以準(zhǔn)確地測定樣品中的有關(guān)物質(zhì)。

3.6 有關(guān)物質(zhì)限度的確定

本試驗采用1%自身對照法測定有關(guān)物質(zhì)，因在強制降解試驗中，酸、氧化、高溫及光照破壞條件下均能使樣品降解出雜質(zhì)B，且3批樣品中未知最大單個雜質(zhì)的量均在0.1%以下，雜質(zhì)總量均在0.3%以下。其限度暫定為：除溶劑和二對甲苯磺酸峰外，雜質(zhì)B峰面積不得大于對照溶液主峰面積的0.1倍（即0.1%），其他單個雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液主峰面積的0.2倍（即0.2%），各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的1.0倍（即1.0%）。

綜上所述，本方法專屬性好、操作簡便，可用于二對甲苯磺酸緣生替尼原料藥中有關(guān)物質(zhì)的測定。

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（編輯：周 箐）

Determination of Related Substances in Yunsintinib Ditosylate Active Pharmaceutical Ingredients by HPLC

ZHONG Yan，LI Jiachun，LI Yingguang，WANG Zhenzhong，HUANG Wenzhe，XIAO Wei（Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.，Ltd.，Jiangsu Lianyungang 222001，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of related substances in yunsintinib ditosylate active pharmaceutical ingredient.METHODS：HPLC was performed on the column of Waters Symmetry C18with mobile phase of methanol-0.01 mol/L ammonium acetate solution（gradient elution），flow rate was 1.0 mL/min，the detection wavelength was 240 nm，column temperature was 40℃，and injection volume was 10μL.RESULTS：Under the chromatographic conditions，the main peaks and each impurity peak were well separated；The linear range of impurity A，B，C and yunsintinib ditosylaie were 0.25-2.0 μg/mL（r≥0.999 0）；the quantification limits of impurity A，B and C were 0.5，0.5 and 2.5 ng，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 1.0%；recoveries were 97.9%-102.6%（RSD＝1.4%，n＝9），95.1%-107.7%（RSD＝4.2%，n＝9），95.8%-107.5%（RSD＝4.1%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：The method is specific and simple，and can be used for the determination of related substances in yunsintinib ditosylate active pharmaceutical ingredients.

Yunsintinib ditosylate active pharmaceutincal ingredients；HPLC；Related substances

R927

A

1001-0408（2017）03-0412-04

2016-02-03

2016-12-14）

＊高級工程師。研究方向：藥物分析。E-mail：zy521-521@126. com

#通信作者：高級工程師，博士。研究方向：創(chuàng)新藥物的研發(fā)。電話：0518-81152337。E-mail：wzhzh-nj@163.net

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.35