于 婷 曲守方 黃 杰*

生長激素定量標記免疫分析試劑盒行業(yè)標準的驗證

于 婷①曲守方①黃 杰①*

目的：制訂生長激素(GH)定量標記免疫分析試劑盒行業(yè)標準，并采用該標準適用的化學發(fā)光標記、時間分辨熒光標記方法進行驗證。方法：選擇GH磁微?；瘜W發(fā)光法、電化學發(fā)光法、化學發(fā)光法和時間分辨熒光分析法試劑盒，按照擬定的行業(yè)標準規(guī)定，對空白限、線性、準確度、精密度、特異性和穩(wěn)定性項目進行驗證。結果：除部分試劑盒的準確度結果不能滿足預期要求的±10%外，其余驗證結果均能滿足擬定行業(yè)標準中的要求。結論：根據驗證情況，將準確度要求調整至±15%，其余項目要求不變，最終確定GH定量標記免疫分析試劑盒行業(yè)標準。該標準的制定，有助于統(tǒng)一GH定量標記免疫分析試劑盒的質量標準，為該類產品的研制、檢驗及上市后的監(jiān)督管理提供依據。

生長激素；試劑盒；行業(yè)標準; 化學發(fā)光；驗證

[First-author’s address]Division of In Vitro Diagnostics for Non-Infectious Diseases, National Institutes for Food and Drug Control; Key Laboratory of Method and Standardization for Quality Control of Biotechnical Products, MOH, Beijing 100050,China.commissioning：multiple institution planning and dosimetry comparisons，a report from AAPM task group 119[J].Med Phys，2009，36(11)：5371-5372.

人體生長激素(growth hormone，GH)是腦垂體前葉含有嗜酸性粒細胞所分泌的肽類激素，由191個氨基酸殘基所構成，分子量為22×103D左右[1-2]。GH的基本功能是刺激機體組織的發(fā)育，促進人體的骨骼、軟骨和組織的生長，GH對中間代謝及能量代謝也有影響[3-5]。臨床研究結果顯示，人體GH缺乏可導致巨人癥和肢端肥大癥等疾病，故GH水平是診斷GH缺乏癥等疾病的重要指標之一[6-10]。

截至2016年3月，國家食品藥品監(jiān)督管理總局網站顯示，我國現(xiàn)有市售且具有醫(yī)療器械注冊證的國產和進口GH檢測試劑盒有近20余家，因無統(tǒng)一的國家標準或行業(yè)標準，由企業(yè)自行編制GH產品技術要求，其結果形成不同廠商的產品技術要求不統(tǒng)一，造成不同臨床實驗室的檢驗結果往往缺乏可比性。為規(guī)范GH試劑盒技術要求，促進產品質量提高，按照國家食品藥品監(jiān)督管理總局2016年醫(yī)療器械標準制修訂計劃，中國食品藥品檢定研究院提出了制定GH定量標記免疫分析試劑盒標準的項目提案。本研究在參考相關資料和廣泛征求意見的基礎上，制定定量測定GH的標記免疫分析試劑盒行業(yè)標準，并對該標準適用的化學發(fā)光標記、時間分辨熒光標記方法進行驗證。

1 資料與方法

1.1 儀器和試劑

(1)AutoLumo A2000全自動化學發(fā)光檢測儀(鄭州安圖生物工程股份有限公司)；DR6608時間分辨熒光免疫分析儀(廣州市達瑞抗體工程技術有限公司)；Access 2全自動免疫分析儀[貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司]；Elecsys 2010全自動免疫分析儀[羅氏診斷產品(上海)有限公司]；Liaison Analyzer化學發(fā)光分析儀[索靈診斷醫(yī)療設備(上海)有限公司]；Immulite2000全自動化學發(fā)光測定儀[西門子醫(yī)學診斷產品(上海)有限公司]。

(2)試劑盒。A試劑盒，人GH檢測試劑盒(磁微?；瘜W發(fā)光法)(鄭州安圖生物工程股份有限公司)；B試劑盒，人GH定量測定試劑盒(時間分辨免疫熒光法) (廣州市達瑞生物技術股份有限公司)；C試劑盒，人GH測定試劑盒(化學發(fā)光法)[貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司]；D試劑盒，人GH檢測試劑盒(電化學發(fā)光法)[羅氏診斷產品(上海)有限公司]；E試劑盒，人GH定量測定試劑盒(化學發(fā)光法)[索靈診斷醫(yī)療設備(上海)有限公司]；F試劑盒，GH測定試劑盒(化學發(fā)光法)[西門子醫(yī)學診斷產品(上海)有限公司]。上述試劑盒均為取得醫(yī)療器械產品注冊證的試劑盒。以上各公司試劑盒與該公司檢測儀器配套使用。

(3)標準品及質控品。①GH國家標準品，批號：150534-9604，1.22 mIU/0.61μg/支，凍干品由中國食品藥品檢定研究院提供；②GH國際標準品，NIBSC批號：98/574，3IU/支，凍干品，由中國食品藥品檢定研究院提供；③GH質控品，批號：1807-0503，3支/套，凍干品，由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 驗證方法

1.2.1 空白限

采用企業(yè)零濃度校準品進行檢測，重復檢測20次，計算信號值的平均值(M)和標準差(standard deviation，SD)，根據零濃度校準品和相鄰校準品之間的濃度-信號值進行兩點直線回歸擬合，得到一次方程，將(M＋2SD)的信號值帶入上述方程中，求出對應的濃度值即為空白限，要求空白限應≤0.5 ng/ ml。

1.2.2 線性

要求制造商給定的線性區(qū)間，下限應≤1 ng/ ml，上限應≥30 ng/ml，相關系數(r)應≥0.9900。將接近線性區(qū)間上限的高值樣本按一定比例稀釋至少5個不同濃度的樣本，其中最低值濃度的樣本應接近線性區(qū)間的下限。每個濃度樣本至少重復測定2次，將測定濃度的均值與理論濃度或稀釋比例用最小二乘法直線擬合，以計算線性的相關系數(r)。

1.2.3 準確度

(1)試劑盒校準品與相應濃度的GH國家(或國際)標準品同時進行分析，用雙對數或其他適當的數學模型擬合，要求兩條劑量-反應曲線不顯著偏離平行，采用t檢驗分析。以GH國家(或國際)標準曲線計算，試劑盒校準品的實測值與標示值的效價比應在0.900～1.100之間。采用各試劑盒專用緩沖體系將GH國家(或國際)標準品配制成與試劑盒校準品相應的濃度點(≥5個濃度點)，每個濃度平行測定≥2次，用雙對數或其他適當的數學模型擬合，計算兩條劑量-反應曲線的斜率，要求兩條曲線不顯著偏離平行(t檢驗)；以GH國家(或國際)標準曲線為對照，計算試劑盒校準品實測值與標示值的效價比，應符合相應要求。

(2)在各試劑盒要求的線性區(qū)間范圍內測定GH國家(或國際)標準品，其結果的相對偏差應在±10.0%范圍內。將GH國家(或國際)標準品配制成高、低濃度樣品(至少2個)后進行測定，每個濃度至少重復2次，取均值后計算相對偏差，結果應符合相應要求。

1.2.4 精密度

分為批內精密度和批間精密度。前者是在試劑盒劑量-反應曲線范圍內，測定2～3個不同濃度的質控品，每個濃度重復10次，要求手工操作試劑盒測定結果的變異系數應≤10.0%，全自動儀器操作試劑盒測定結果的變異系數應≤8.0%；后者采用3個批次試劑盒，在試劑盒劑量-反應曲線范圍內，測定2～3個不同濃度的質控品，測定結果的變異系數(coefficient variation，CV)應≤15.0%。

1.2.5 特異性

特異性用于分析在被測物中若存在與GH結構類似物是否對其檢測有影響的項目。選擇濃度≥2000 mIU/L的泌乳素樣本，平行測定2次，其測定結果應≤0.5 ng/ml。

1.2.6 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性分為效期末穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性兩種。效期末穩(wěn)定性是將試劑盒在規(guī)定條件下保存至有效期末；熱穩(wěn)定性是將試劑盒在37 ℃條件下放置一定時間后進行檢測，其放置時間由各試劑盒設置的效期來決定，各項性能指標是否滿足相應要求，但批間精密度和特異性指標不做要求。

2 結果

定量測定GH的標記免疫分析試劑盒驗證空白限、線性、準確度、精密度、特異性及穩(wěn)定性結果。

(1)對A、B、C、D和E共5家試劑盒的驗證結果顯示，空白限均小于擬定行業(yè)標準的要求(0.5 ng/ ml)；劑量-反應曲線相關系數(r)也均大于擬定行業(yè)標準的要求(0.9900)，表明在試劑盒線性范圍內，量效關系反應良好；批內和批間精密度項目中，除進口試劑盒短期內無法提供3批次試劑未做驗證外，其余結果均符合要求，包括手工法試劑盒，變異系數均＜10.0%，表明各試劑盒測定同一樣本的重現(xiàn)性較好。在特異性項目中，所有試劑盒在測定濃度水平為2000 mIU/L的泌乳素(prolactin，PRL)時，測定結果均低于擬定行業(yè)標準的要求(0.5 ng/ml)，表明該濃度下的PRL不影響GH的測定，見表1。

表1 GH定量標記免疫分析試劑盒3個濃度水平的驗證結果

(2)對于具有注冊證，為我國GH主流且銷售量較大的進口和國產試劑盒，不限于參與本次行業(yè)標準驗證的試劑盒。驗證數據顯示，除1個國產試劑盒下限不滿足要求外，其余試劑盒均能滿足擬定行業(yè)標準線性范圍(下限應≤1 ng/ml，上限應≥30 ng/ml)的要求，見表2。

表2 部分試劑盒的線性范圍(ng/ml)

(3)在穩(wěn)定性實驗中，選擇2家國產試劑盒分別進行了熱穩(wěn)定性和效期末穩(wěn)定性的檢測，空白限、相關系數和批內精密度也均滿足擬定行業(yè)標準的要求，其結果見表3。

表3 GH試劑盒穩(wěn)定性驗證結果

(4)準確性項目是GH行業(yè)標準中關鍵性指標之一。行業(yè)標準中提供了兩種驗證方法，國產試劑盒多采用前者方法，進口試劑盒多采用后者方法。驗證結果表明，國產試劑盒結果令人滿意。平行性檢驗中，t值均＜t0.05，P＞0.05，兩條劑量-反應曲線不顯著偏離平行；以GH國家標準品為對照品，試劑盒內校準品的實測值與標示值的效價比均在擬定行業(yè)標準要求的0.900～1.100范圍內，表明量值傳遞基本準確；而進口試劑盒結果差強人意，參加驗證的4個進口試劑盒均不能滿足相對偏差應在±10.0%范圍內的要求。國產試劑準確性結果見表4，進口試劑準確性結果見表5。

表4 國產試劑準確性檢驗結果

3 討論

生長激素定量標記免疫分析試劑盒行業(yè)標準中規(guī)定的線性，反映了試劑盒規(guī)定范圍內的量效關系，良好的劑量-反應曲線線性是建立定量標記免疫分析的基礎。批內和批間精密度是考察試劑盒對同一樣本重復測定時能否得到相同結果的指標。特異性反映了試劑盒對于結構類似物抗干擾的能力。穩(wěn)定性對產品效期末穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性的性能都做了明確規(guī)定[11-12]。本驗證試驗中，選擇了電化學發(fā)光法、化學發(fā)光法、磁微?；瘜W發(fā)光法以及時間分辨熒光法等多種不同標記方法，且具有代表性的國產或進口試劑盒進行驗證。驗證項目包括：空白限、線性、準確度、精密度、特異性及穩(wěn)定性。參與驗證的試劑盒均通過了除準確度項目外的技術指標。

準確度項目是行業(yè)標準關鍵技術指標之一。本研究驗證采用了不同來源的國家和(或)國際標準品。一項來源為垂體源國家標準品(150534-9604，1.22 mIU/0.61 μg/支)，可溯源至人體GH國際標準品(66/217)，但該國際標準品已被GH國際垂體源標準品(80/505，4.4IU/1.735 mg/支)所取代，這兩種標準品單位換算關系為：國家標準品中1 ng=2 μIU，現(xiàn)行國際垂體源標準品中1 ng=2.6 μIU；另一項來源為重組國際標準品(98/574，1.95 mg/5.8 IU/支)，單位換算關系為：1 ng=3 μIU。由于不同的質量單位與國際單位之間的轉換因子不一致，因此國家標準品和國際垂體源標準品之間，或者兩個國際標準品之間，單位無法進行統(tǒng)一。即此單位“ng、 IU”并非是統(tǒng)一的“ng、IU”。

國產試劑多溯源至國家標準品，而絕大部分試劑尤其是進口試劑，均溯源至重組GH國際標準品。因此對于此項目的驗證，必須分別采用相對應的標準品來進行分析才有意義。然而，即便考慮了溯源性的不一致情況，除2個國產試劑準確度結果滿足要求外，進口試劑均不滿足要求，在7次實驗中僅有4次滿足相對偏差在±15.0%范圍內，其余3次均在±20.0%范圍內。考慮到以上實際檢測結果，若按照原定要求準確度定為±10.0%，則大部分試劑無法滿足要求，致使其技術指標無可操作性，因此考慮將準確度指標范圍放寬至±15.0%，將促使進口企業(yè)積極找出偏差原因，改進產品質量，最終將有助于促進各結果的可比性。

表5 進口試劑準確性檢驗結果

GH現(xiàn)行國家標準品即將面臨換批，新批次國家標準品將溯源至重組國際標準品98/574，是根據NIBSC的建議而制定。為了促進GH分析的結果一致化，NIBSC建議均以98/574對各免疫分析系統(tǒng)進行校正，并以μg/L作為單位[13-14]。因此，換批之后的國家標準品上市后，國產試劑需要重新校準溯源系統(tǒng)，這需要一定時間轉換，期間可能會出現(xiàn)一些問題，因此準確度技術指標定為±15.0%范圍內，更具有合理性和實際操作性。GH定量標記免疫分析行業(yè)標準中各項技術指標制定科學合理、易于操作。該標準的制定，將有助于統(tǒng)一GH定量標記免疫分析試劑盒的技術要求，為該類產品的研制、檢驗及上市后的監(jiān)管工作提供依據。

4 結語

近年來，我國體外診斷試劑發(fā)展勢頭迅猛，在疾病檢測、預防及療效監(jiān)測等領域的作用越來越大，對診斷試劑行業(yè)標準的需求越來越多。國家食品藥品監(jiān)督管理總局有關部門正在加緊進行相關標準的制修訂工作，在監(jiān)管、審評及檢驗等各部門及各企業(yè)的共同努力下，必將促進體外診斷試劑行業(yè)更加健康和規(guī)范地發(fā)展，為人民用械安全提供更好的保障[15]。

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The verification of industry standard for growth hormone quantitative labeling immunoassay kit/

YU Ting, QU Shou-fang, HUANG Jie//China Medical Equipment,2017,14(2):18-22.

Objective:To establish the industry standard for growth hormone quantitative labelling immunoassay kit, and to validate it by chemiluminescence labeling and time-resolved fluorescence labeling method which are suitable for the standard.Methods:Different assay method kits, including magnetic particle chemiluminescent assay, electrochemiluminescence assay, chemiluminescence assay and time-resolved fluorescent assay, were used to verified the blank limitation, linearity, accuracy, precision, specificity and stability in accordance with protocol industry standard.Results:Other verification results could meet requirements of the protocol industry standard besides accuracy in part of kits couldn't achieve to anticipative remand (relative deviation couldn't be more than ±10%).Conclusion:According to the verification results, the accuracy requirements was adjusted to ±15%. The other items of industry standard were maintained. The industry standard for growth hormone quantitative labeling immunoassay kit is ultimately established. The standard would contribute to unity quality standard of growth hormone quantitative labeling immunoassay kit, and provide the basis for the supervision and administration of its production, examination, circulation, clinical application and other areas.

Growth hormone; Reagent kit; Industry standard; Chemiluminescence; Verification

1672-8270(2017)02-0018-05

R446.62

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.02.006

2016-10-12

①中國食品藥品檢定研究院非傳染病診斷試劑室 衛(wèi)生部生物技術產品檢定方法及其標準化重點實驗室 北京 100050

*通訊作者：jhuang5522@126.com

于婷,女,(1978- ),博士，副研究員。中國食品藥品檢定研究院非傳染病診斷試劑室、衛(wèi)生部生物技術產品檢定方法及其標準化重點實驗室，從事體外診斷試劑的檢定、行業(yè)標準制修訂及標準物質研制工作。