王昕+韓俊艷+王劍峰+楊彩霞

摘要：本文對近年來基因工程實驗課教改進行再探索，設計兩種蛋白質的原核表達純化及活性測定實驗，學生從中任選一種，完成各自實驗后合作完成最終實驗。此改革拓寬了學生的學術視野，鍛煉了學生的自學能力和團隊合作能力。

關鍵詞：基因工程實驗課；教學改革；原核表達純化；活性測定

中圖分類號：G642.0 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2017）08-0265-02

誕生于20世紀70年代初的DNA重組技術是一種獲取、整理、破譯、編輯和表達生物遺傳信息的現(xiàn)代生物技術，它在諸多方面日益顯示出極高的實用價值。目前，作為DNA重組技術產(chǎn)業(yè)化應用的基因工程，正在驅動著人類社會生活方式的重大變革。在這一技術浪潮的推動下，基因工程已成為生物科學、生物工程和生物技術本科生的專業(yè)主干課程之一。與其他生物學專業(yè)課相比基因工程稍有不同，其他生物學專業(yè)課比較注重理論部分而對實驗部分要求不高（如植物生理學、生物化學和分子生物學等），但基因工程卻理論與實驗并重，因此實驗課在本門課程中的地位就更加重要。通過實驗課的鍛煉，我們不但能幫助學生提高動手能力，還能反過來加深對理論課的理解，這有助于加強學生的實踐能力和創(chuàng)新精神。作為一門炙手可熱的前沿科學，近年來基因工程的最新進展可謂日新月異眼花繚亂，在此大背景下基因工程本科教學就必須與時俱進，不斷革新從而跟上時代發(fā)展的腳步。本文在近年來基因工程實驗課改革的基礎上再次創(chuàng)新，設計了兩種蛋白質的原核表達純化及活性測定實驗，通過創(chuàng)新的實驗安排使學生在相同的課時中收獲更多的知識，得到更多的鍛煉。

Lon蛋白酶廣泛地分布于微生物、動植物和人類中，是一種多結構域的、ATP依賴型的蛋白酶，負責降解細胞內(nèi)特殊的調(diào)節(jié)蛋白質、有缺陷的蛋白質和異常蛋白質，與此同時Lon蛋白酶還具有分子伴侶活性。Lon蛋白酶的這種多活性特點為我們的實驗設計提供了較大的空間。綠色熒光蛋白（green fluorescent protein GFP）在藍色波長范圍的光線激發(fā)下會發(fā)出綠色螢光，因此在日常白光照射下GFP即可呈現(xiàn)出綠色。GFP在低PH值條件下變性后會喪失綠色熒光，經(jīng)Lon蛋白酶分子伴侶活性作用后復性又能夠恢復綠色熒光。GFP蛋白的這種可見特性為初學者的實驗操作增加了趣味性。本文設計了這兩種蛋白質的原核表達純化實驗，并根據(jù)它們的特性設計了后續(xù)的活性測定實驗。

一、進一步探索教學改革的目的

當前的大多數(shù)基因工程實驗課教學改革是設計了一個蛋白質的原核表達及純化實驗。這樣的設計不僅較為完整地覆蓋了基因工程的實驗步驟，而且還將原有的分散的支離破碎的實驗安排整合為一個有機的整體。整個實驗可將載體的酶切、連接、載體構建、原核宿主轉化、重組子的鑒定、蛋白質的表達純化等相關實驗有機地整合起來，是一個前后相繼緊密銜接的整體。學生在每個實驗過程中都必須小心謹慎全身心投入，因為每一個實驗的結果都是后一個實驗的初始材料，這就好比一個串聯(lián)電路，一點斷開全盤皆輸。這就要求同學們必須極其專心，直到全部實驗完成，從而使學生產(chǎn)生更加深刻的印象，從而顯著地提升了教學質量。但是經(jīng)過一段時間的教學實踐后，我們又發(fā)現(xiàn)了一些有待改進的地方。（1）已有的實驗改革雖已覆蓋基因工程“切、接、轉、增、檢”的基本實驗步驟，但尚未明確涉及目的蛋白的活性檢測實驗，因此依然存在實驗覆蓋面不夠完整的問題。（2）因為已有的實驗改革只設計了一個蛋白質的原核表達純化，所以無法比較不同蛋白質表達純化過程中存在的不同問題。這樣便限制了學生的學術視野，很可能會誤認為不同蛋白質的原核表達及純化實驗鮮有區(qū)別。（3）實驗中的目的蛋白基本不可見，使初學者感到實驗操作單調(diào)乏味，進而影響了學習興趣。本文針對這些問題進行了教學改革，從而進一步提高了教學質量。

二、教學改革內(nèi)容

本實驗改革設計了Lon蛋白酶和GFP兩種蛋白質的原核表達純化實驗，學生經(jīng)分組后可任意選取一種蛋白質進行表達純化，然后各自進行Lon蛋白酶的蛋白酶活性測定實驗和GFP變性實驗。完成各自全部實驗后，表達純化不同蛋白質的實驗小組使用各自產(chǎn)物，以合作的方式完成以GFP為底物測定Lon蛋白酶分子伴侶活性的實驗。

具體實驗內(nèi)容如下：（1）使用限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切中間載體上的目的基因片段和表達載體，然后進行膠回收；（2）使用T4 DNA連接酶將目的基因片段連接到表達載體上；（3）感受態(tài)制備和轉化；（4）重組子篩選；（5）重組蛋白的表達和純化；（6）測定Lon蛋白酶的蛋白酶活性或進行GFP蛋白失活實驗；（7）以GFP蛋白為底物測定Lon蛋白酶的分子伴侶活性；

（8）討論各自實驗過程中的心得體會；（9）撰寫實驗論文。在第8部分討論環(huán)節(jié)中，要求學生充分交流不同蛋白質表達純化過程中遇到的問題以及解決方式。然后在撰寫實驗論文中將兩種蛋白質的表達過程進行比較，分析每種蛋白質表達純化過程中的難點。整個實驗出自本人的科研課題，因此整個流程非常成熟可靠性很高，便于初學者掌握基因工程實驗的基本知識和流程。

三、教學改革總結

本文設計了兩種蛋白質的原核表達純化實驗，兩者雖然技術路線相同，但是又有各自特有的有待解決的技術問題。通過教師的介紹和引導，每個學生實驗小組自主選擇實驗課題，完成各自實驗后再使用各自產(chǎn)物合作完成最終實驗。

總體來說本實驗設計解決了以下幾點教學問題：（1）通過取消重復實驗拓寬了實驗課覆蓋面：我們將與分子生物學重復的實驗（目的基因獲取相關實驗，即總DNA提取和PCR等實驗）取消，直接向學生提供目的基因片段。這樣既避免了實驗重復，又為新增的目的蛋白活性檢測實驗節(jié)省了必要的課時。（2）通過二選一的方式為實驗課擴容：如果要求學生同時表達純化兩種蛋白質，則工作量過大難以實現(xiàn)。所以我們要求學生自主決定任選其一，然后相互交流討論各自實驗過程中的心得體會。這種選擇性設計會促使學生主動思考問題，同時也無形中擴大了實驗課容量拓寬了學生的學術視野，討論環(huán)節(jié)的設置還會鍛煉學生的學術交流能力。（3）增加實驗趣味性：GFP是一種肉眼可見的蛋白質，在其表達純化過程中會伴有綠色出現(xiàn)。Lon蛋白酶雖肉眼不可見，但在其活性測定過程中依然會出現(xiàn)肉眼可見的底物顏色變化。這樣便使基因工程實驗初學者的操作變得有趣起來，從而激發(fā)了學生的學習興趣。（4）培養(yǎng)學生的團隊合作能力：表達純化不同蛋白質的實驗小組，最終要拿著各自的產(chǎn)物共同完成最終的實驗。這樣的設計使學生認識到團隊合作的重要性，因為沒有其他小組純化的蛋白質任何小組都無法獨立完成所有實驗。

這種新穎的實驗設計充分調(diào)動了學生的學習積極性，鍛煉了學生的獨立思考能力和團隊合作能力，使學生由傳統(tǒng)教學中的被動接受者變成了主動的探索者、積極的討論者和負責的合作者。通過教學實踐，我們發(fā)現(xiàn)此教學設計取得了良好的教學效果，獲得了學生的支持和好評。

參考文獻：

[1]Barakat S，Pearce D A，Sherman F，et al.Maize contains a Lon protease gene that can partially complement a yeast pim1-deletion mutant[J].Plant Mol Biol，1998（37）：141-154.

[2]Mi L，F(xiàn)atima R，Edward E M，et al.M aurizi and Alexander W.Crystal structure of the N-terminal domain of E.coli Lon protease. ProteinScience[J]，2007，28（2）：2895-2900.

[3]王文鋒，穆靈敏，張采宏，等.生物技術專業(yè)基因工程大實驗的探索和優(yōu)化[J].生物技術世界，2016，（3）：254.

[4]范亞軍，盛彥敏，章有知.基因工程實驗教學改革與實踐[J].時代教育，2016，（7）：219.

[5]朱旭芬，趙小立，丁鳴.“基因工程實驗”精品課程建設的探索與思考[J].中國大學教育，2011，（8）：54-55.

[6]王昕，劉曉晴.嗜熱菌Lon蛋白酶的功能分析[J].首都師范大學學報（自然科學版），2009，（5）：35-39.