杜 興，胡志偉，汪忠鎬，燕 超，吳繼敏

胃蛋白酶檢測在反流性疾病中的研究進展

杜 興，胡志偉，汪忠鎬，燕 超，吳繼敏

反流性疾病包括胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease， GERD)與咽喉反流(laryngopharyngeal reflux， LPR)，其中GERD是最常見的消化道疾病，而LPR是引起嗓音異常的主要原因之一，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，造成巨大的醫(yī)療負擔。而國內(nèi)很多醫(yī)師對反流性疾病認識不足，導致很多患者被誤診誤治。隨著對反流性疾病研究的深入，人們逐漸認識到胃蛋白酶在本病的發(fā)生發(fā)展過程中有重要意義，尤其對于LPR，其可能是導致相關(guān)變病的主要原因。食管外組織或器官胃蛋白酶的檢出為反流性疾病與肺部、耳鼻咽喉等疾病的相關(guān)性提供了直接證據(jù)，為深入探究反流性疾病的病理生理學機制提供了新的研究方向或線索。同時大量研究表明體液胃蛋白酶檢測對診斷反流性疾病具有良好的應用前景，有望取代具有創(chuàng)傷性的診斷手段。

反流性疾??；胃食管反流；咽喉反流；胃蛋白酶

反流性疾病主要包括胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease， GERD)與咽喉反流(laryngopharyngeal reflux， LPR)，是指胃內(nèi)容物反流至食管、咽喉部，甚至氣道、肺、口腔、鼻腔、中耳等部位，造成局部組織的破壞，引起一系列癥狀和體征的總稱[1]。既往認為胃內(nèi)容物中的胃酸(hydrochloric acid， HCL)是引起反流性疾病相關(guān)癥狀與體征的主要因素。現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明，胃內(nèi)容物中的胃蛋白酶在反流性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用?，F(xiàn)復習相關(guān)文獻，對胃蛋白酶檢測在反流性疾病中的應用與進展進行綜述。

1 胃蛋白酶的理化特性與生理作用

胃蛋白酶原(pepsinogen， PG)是胃蛋白酶的無活性前體，主要是由泌酸腺的胃壁主細胞合成和分泌。應用電泳技術(shù)及根據(jù)免疫源性可將PG分為兩大同工酶原，即胃蛋白酶原I(PGI，由胃底腺的主細胞和黏液頸細胞分泌)與胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ，主要來源于全胃腺)，十二指腸上段的Brunner腺、前列腺和胰腺也能產(chǎn)生少量的PGⅡ，PGⅡ占胃黏膜合成PG總量的25%。PG大部分進入胃腔轉(zhuǎn)化為有活性的胃蛋白酶，僅有1%通過胃黏膜毛細血管進入血液循環(huán)并經(jīng)腎臟排出。

在酸性環(huán)境或自我激活作用下，PG分離出1個含有44位氨基酸的多肽后形成有活性的胃蛋白酶[2]。胃蛋白酶不是單一的分子，而是由一些結(jié)構(gòu)類似的同工酶家族組成。Bardhan指出應用高效陰離子交換色譜法可將胃蛋白酶分為1、2、3、5亞型，胃蛋白酶3又可進一步分為胃蛋白酶3A、3B、3C，其中胃蛋白酶3B分子量最大、所占比重最高(70%)[3]。胃蛋白酶只有在酸性環(huán)境中才能發(fā)揮作用。Yufera等[4]發(fā)現(xiàn)人胃蛋白酶在pH 2.0環(huán)境中活性最高，在pH 6.5時呈失活狀態(tài)，但能保持完整的穩(wěn)定狀態(tài)，當pH再次下降時其活性可恢復。

2 質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitors， PPIs)對胃蛋白酶的影響

關(guān)于PPIs對HCL分泌影響的研究報道較多見，但有關(guān)PPIs對胃蛋白酶影響的報道則較少見。一項研究將大劑量奧美拉唑(60 mg每日1次)應用于8例健康志愿者，連續(xù)使用9 d后檢測發(fā)現(xiàn)雖總體HCL分泌量明顯減少，但因胃液分泌量顯著減少，胃蛋白酶的濃度卻顯著升高[5]。高劑量的PPIs或新一代PPIs抑酸效果更強，可使胃蛋白酶處于失活狀態(tài)的時間更長，但仍不能使胃液達到令胃蛋白酶變性的pH水平[6]?？傊?，PPIs對胃蛋白酶的分泌影響不顯著，同時可導致胃蛋白酶濃度的升高，富含高濃度胃蛋白酶的反流液對食管外組織或器官更具損傷性。這些研究發(fā)現(xiàn)為以后研究胃蛋白酶在反流性疾病中的應用價值提供了理論基礎(chǔ)。

3 胃蛋白酶檢測在GERD中的應用

研究報道胃蛋白酶可存在于反流性疾病患者的食管、咽喉、氣道、口腔、鼻腔、鼻竇、咽鼓管及中耳等部位。胃蛋白酶檢測技術(shù)主要有蛋白印跡、免疫測定技術(shù)。Peptest檢驗是已經(jīng)商業(yè)化的體液或分泌液(如唾液、痰液)胃蛋白酶檢測技術(shù)，由免疫測定技術(shù)改良而成，利用兩種單克隆抗體進行體外檢測，方法簡便，幾分鐘內(nèi)即可得出結(jié)果[7-8]。

目前診斷GERD與LPR的“金標準”分別為食管24 h多通道腔內(nèi)阻抗聯(lián)合pH監(jiān)測(multichannel intraluminal impedance， MⅡ-pH)和24 h雙探針pH監(jiān)測，但二者診斷敏感性低，且具有創(chuàng)傷性，很多患者難以耐受。國內(nèi)學者劉鵬等[9]采用蛋白印跡技術(shù)檢測80例疑似GERD患者的唾液胃蛋白酶，樣本采集時間分別為睡前、癥狀發(fā)作時及晨起時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)53.8%的患者胃蛋白酶陽性，健康對照組均為陰性；以24 h pH監(jiān)測為“金標準”，唾液胃蛋白酶診斷GERD的敏感性和陰性預測值較為理想(89%和95%)，特異性和陽性預測值欠佳(68%和44%)；同時發(fā)現(xiàn)癥狀發(fā)作時胃蛋白酶陽性率最高。毛華等[10]采用乳膠增強免疫比濁法檢測GERD、慢性胃炎患者及健康對照者晨起空腹時唾液PGI、PGⅡ濃度，結(jié)果顯示GERD組PGI濃度高于慢性胃炎組及健康對照組，GerdQ表評分與PGI濃度存在正相關(guān)(r=0.466，P=0.014)；受試者工作特征(ROC)曲線分析顯示，PGI臨界值取2.5 μg/L時，胃蛋白酶診斷GERD的敏感性為70.4%、特異性為71.4%。類似的是，外國學者Saritas等[11]通過檢測58例疑似GERD患者與51例健康對照者唾液胃蛋白酶，發(fā)現(xiàn)兩組胃蛋白酶陽性率差異無統(tǒng)計學意義(22% vs 12%，P=0.25)，但分層分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)胃鏡確診的反流性食管炎患者、經(jīng)食管48 h pH監(jiān)測診斷的GERD患者及僅有GERD癥狀患者的胃蛋白酶陽性率均高于健康對照組；以胃鏡或48 h pH監(jiān)測為診斷標準，胃蛋白酶檢測診斷GERD的陽性預測值、陰性預測值分別為81%、78%，故作者認為胃蛋白酶檢測對GERD具有良好的診斷價值。之后有研究進一步證實，唾液胃蛋白酶檢測可作為診斷GERD的一種無創(chuàng)、簡易、方便的新手段，有望取代目前具有創(chuàng)傷性的胃鏡或pH監(jiān)測診斷方法[12-13]。

Starosta等[14]對96例慢性肺疾病患兒進行肺泡灌洗液胃蛋白酶檢測與食管24 h pH監(jiān)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)68%的患兒食管近端酸反流指數(shù)升高；與食管近端酸反流陰性者相比，陽性者肺泡灌洗液胃蛋白酶濃度更高；同時發(fā)現(xiàn)肺泡灌洗液中中性粒細胞、蛋白羰基和白細胞介素-8(IL-8)水平與食管近端反流事件相關(guān)。據(jù)此作者提出GERD是兒童慢性肺疾病的重要影響因素，肺泡灌洗液胃蛋白酶檢測可作為一種重要的診斷方法。此后有更多研究通過呼吸道分泌物或肺泡灌洗液胃蛋白酶檢測證實，GERD與支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)、慢性咳嗽等肺部疾病的相關(guān)性[13-15]。Timms等[16]研究顯示，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)同時患有GERD的COPD患者呼出氣體冷凝液胃蛋白酶濃度高于不伴有GERD的患者及健康者，指出呼出氣體冷凝液胃蛋白酶檢測可用于篩選伴有GERD的COPD患者[17-18]。

4 胃蛋白酶檢測在LPR中的應用

LPR也稱食管外反流，是指胃十二指腸內(nèi)容物反流至食管以上高度，到達咽、喉、口腔及氣道等部位，引起一系列癥狀及并發(fā)癥，與眾多耳鼻咽喉疾病及呼吸道疾病相關(guān)[19-21]。目前臨床上用于診斷LPR的手段主要有反流癥狀指數(shù)(RSI)量表、反流檢查計分(RFS)量表和PPIs試驗性治療及LPR監(jiān)測，但效果均不理想。

Knight等[22]采用免疫分析法檢測疑似LPR患者喉部痰液胃蛋白酶，并與24 h雙探針pH監(jiān)測相比較，發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶陽性患者食管與咽喉部檢測液pH顯著低于陰性者，指出胃蛋白酶檢測顯示出理想的診斷價值，診斷敏感性、特異性分別高達100%、89%。李湘平等[23]以RSI量表、RFS量表和PPIs試驗性治療聯(lián)合診斷結(jié)果為診斷標準，發(fā)現(xiàn)LPR組深咳咽喉部唾液胃蛋白酶濃度高于慢性咽喉炎組和健康對照組，胃蛋白酶診斷LPR的敏感性、特異性、漏診率及誤診率分別為93.8%、46.2%、6.2%、53.8%。同時，中國學者Jiang等[24]發(fā)現(xiàn)LPR患者勺狀軟骨間黏膜胃蛋白酶陽性率高于對照組(80.0% vs 14.3%，P<0.01)，診斷LPR的敏感性、特異性分別為100.0%、47.6%，表明喉黏膜胃蛋白酶檢測是診斷LPR的敏感方法。另有研究發(fā)現(xiàn)，LPR患者唾液胃蛋白酶、膽汁酸濃度顯著高于健康對照組(P=0.005，P=0.023)，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)LPR患者RSI、RFS與唾液胃蛋白酶、膽汁酸濃度相關(guān)，據(jù)此作者認為唾液胃蛋白酶結(jié)合膽汁酸檢測可用于LPR的診斷，尤其是膽汁性LPR[25-26]。近兩年研究進一步證實，唾液/痰液胃蛋白酶檢測可作為一種廉價、無創(chuàng)、易于患者接受的LPR診斷方法[27-28]。

Blumin和Johnston[29]通過LPR患兒氣道分泌物與喉部黏膜胃蛋白酶檢測分析發(fā)現(xiàn)，LPR是特發(fā)性聲門下狹窄的重要發(fā)病機制。Krishnan等[30]對118例有呼吸道癥狀和(或)耳鼻喉癥狀的患兒進行喉-支氣管鏡檢查與氣道抽吸物胃蛋白酶檢測，結(jié)果顯示喉-支氣管鏡下有陽性發(fā)現(xiàn)(如喉部水腫、紅腫、喉室閉塞及氣道分泌物增多)與氣道胃蛋白酶表達呈正相關(guān)，并且胃蛋白酶表達與患兒哮喘、肺囊性纖維化病史顯著相關(guān)。Gill等[31]發(fā)現(xiàn)LPR患者喉黏膜上皮細胞胞內(nèi)存在胃蛋白酶，而健康對照組不存在；LPR患者喉黏膜E-鈣黏蛋白、碳酸酐酶Ⅲ(CAⅢ)表達降低或缺失。據(jù)此，作者認為LPR與胃蛋白酶、E-鈣黏蛋白及CAⅢ的表達下調(diào)相關(guān)，E-鈣黏蛋白、CAⅢ表達降低導致喉黏膜防御功能降低，而胃蛋白酶可消化分解喉組織細胞引起損傷。此外，Wang等[32]將聲帶息肉患者的聲帶組織進行免疫組織化學染色，發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶在聲帶息肉組織中的表達較健康對照組明顯升高，提示反流物胃蛋白酶陽性是聲帶息肉發(fā)生的危險因素，同時指出聲帶息肉胃蛋白酶檢測對LPR的診斷價值較RFS、RSI及反流監(jiān)測高。近期來自Luebke等[33]的研究發(fā)現(xiàn)，反流物胃蛋白酶與患兒軟喉癥相關(guān)，但具體發(fā)生機制尚需進一步研究。譚嘉杰等[34]通過研究聲帶白斑及喉癌組織中胃蛋白酶表達，發(fā)現(xiàn)LPR可能參與喉癌的發(fā)生，但胃蛋白酶參與喉黏膜上皮惡變的機制還有待進一步研究。

5 胃蛋白酶與慢性鼻-鼻竇炎及分泌性中耳炎的相關(guān)性

近幾年國內(nèi)外學者通過胃蛋白酶檢測對反流性疾病與慢性鼻-鼻竇炎及分泌性中耳炎的相關(guān)性進行了研究。Ozmen等[35]以咽喉pH監(jiān)測為診斷標準，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比慢性鼻竇炎患者存在更高的LPR發(fā)生率(88% vs 55%，P<0.05)，提示LPR可能是慢性鼻竇炎發(fā)生的重要機制，這與Iannella等[36]的結(jié)論相一致。金日群團隊[37]采用ELISA技術(shù)檢測50例慢性鼻竇炎患者鼻腔分泌物胃蛋白酶，根據(jù)RSI量表、RFS量表及PPIs試驗性治療三聯(lián)診斷將患者分為LPR組和非LPR組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPR組胃蛋白酶陽性率高于非LPR組及健康對照組，顯示胃蛋白酶檢測診斷LPR的敏感性高于三聯(lián)診斷法。之后該團隊及胡全福等[38-39]報道鼻腔分泌物胃蛋白酶檢測與咽喉24 h pH監(jiān)測及三聯(lián)診斷法均具有較好的一致性，是一種無創(chuàng)的、可行的LPR診斷方法。O'Reilly等[40]對509例分泌性中耳炎患兒進行研究，發(fā)現(xiàn)20%的患兒中耳滲出液中可檢出胃蛋白酶，其水平顯著高于對照組(20.0% vs 1.4%，P<0.05)。2015年該團隊又報道分泌性中耳炎患兒中耳滲出液胃蛋白酶與IL-8相關(guān)，指出LPR與中耳炎性病變密切相關(guān)，但具體機制需要進一步研究[41]。另外，多位學者證實分泌性中耳炎患兒中耳滲出液胃蛋白酶是反流所致，并非局部血液滲出所致，并可作為診斷分泌性中耳炎患者是否存在LPR的可靠指標[42-44],這一結(jié)論得到Formanek等[45]的進一步證實。

6 其他研究進展

6.1胃蛋白酶與反流性疾病的轉(zhuǎn)化研究 正常人每日可發(fā)生數(shù)十次胃食管反流而不出現(xiàn)食管癥狀，而咽喉部每周出現(xiàn)3次反流即可造成咽喉黏膜的損害并引起咽喉部癥狀，提示LPR的發(fā)生機制與GERD不同。美國學者Johnston及其同事針對胃蛋白酶與LPR的相關(guān)性進行了大量的研究報道。首先Johnston等[46]通過蛋白印跡法分析LPR患者喉黏膜上皮胃蛋白酶表達與應激蛋白(Sep70、Sep53、Hsp70)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，LPR組喉黏膜Sep70表達減少(P=0.027)，Sep53表達有減少趨勢(P=0.056)，且喉黏膜上皮胃蛋白酶存在量與Sep70呈負相關(guān)。豬喉組織培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)單純HCL可導致Sep70和Sep53升高，加入胃蛋白酶后Sep70、Sep53減少或消失。利用動物體外模型，Johnston等[47]發(fā)現(xiàn)激活狀態(tài)的胃蛋白酶可致豬喉部組織CAⅢ、Sep70表達下調(diào)，而失活狀態(tài)的胃蛋白酶、HCL則不能。繼之Johnston等[48]利用人體外組織培養(yǎng)及毒性分析等技術(shù)發(fā)現(xiàn)失活狀態(tài)的胃蛋白酶具有細胞毒性作用，可致線粒體、高爾基體等細胞器損傷，并可改變多種應激基因及毒性基因的表達。在上述研究發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，Johnston等[49-50]發(fā)現(xiàn)并證實滯留在咽喉部的胃蛋白酶可通過受體介導的胞吞作用被攝入細胞內(nèi)。因此，Johnston等[51]指出胃蛋白酶可被再次發(fā)生的酸性反流所激活，或者被胞吞的胃蛋白酶在酸性介質(zhì)(高爾基體pH 5.5)中恢復活性，通過改變應激蛋白的表達引起應激反應等途徑造成細胞破壞，在LPR的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

Bulmer等[52]報道不同部位的喉黏膜對胃蛋白酶、HCL有不同程度的耐受性，其中聲門下黏膜最為敏感，且胃蛋白酶與HCL對喉黏膜的損害具有協(xié)同作用。Bathoorn等[53]將人支氣管上皮細胞暴露于胃蛋白酶、HCL溶液中，通過分析細胞增殖和細胞因子表達發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶對細胞的毒性和炎性作用呈濃度依賴性和pH依賴性，即胃蛋白酶濃度越高、pH越低，有害作用越顯著。

Adhami等[54]利用犬動物模型探究胃反流物(胃蛋白酶、HCL)與十二指腸反流物(膽汁酸、胰蛋白酶)對喉黏膜的有害作用，結(jié)果顯示酸性反流中胃蛋白酶是造成喉部組織損傷的主要因素，十二指腸反流物并無顯著的有害作用。另外，Ali等[55]報道膽汁酸(包括結(jié)合膽汁酸與未結(jié)合膽汁酸)對胃蛋白酶活性無影響。而Develoglu等[56]報道稱胃蛋白酶、膽汁酸均可致中耳黏膜發(fā)生炎性反應和上皮化生改變，尤其膽汁酸的作用最為明顯。

6.2胃蛋白酶檢測在胃食管反流誤吸診斷中的應用 氣道分泌物或肺泡灌洗液中胃蛋白酶的檢出為GERD相關(guān)性肺疾病的診斷提供直接證據(jù)。Savarino等[57]研究發(fā)現(xiàn)，特發(fā)性肺纖維化患者肺泡灌洗液胃蛋白酶、膽汁酸濃度均高于間質(zhì)性肺疾病患者和健康對照組，同時24 h MⅡ-pH監(jiān)測發(fā)現(xiàn)特發(fā)性肺纖維化患者異常酸暴露比例也高于間質(zhì)性肺疾病患者和健康對照組，提示特發(fā)性肺纖維化與胃食管反流誤吸密切相關(guān)。近幾年有研究發(fā)現(xiàn)，與葡萄糖檢測方法相比，胃蛋白酶檢測對診斷胃食管反流誤吸具有更高的敏感性[58-61]。

7 小結(jié)

HCL、胃蛋白酶及膽汁酸的協(xié)同作用是造成食管病變與GERD癥狀(如反酸、胃灼熱)的主要因素，其中HCL是關(guān)鍵因素；而LPR的主要致病因素是胃蛋白酶[62]。大量研究顯示胃蛋白酶檢測對GERD、LPR等反流性疾病具有較好的診斷價值，但不同研究之間取樣時機、檢測方法及“金標準”的選擇不盡相同，研究結(jié)果參差不齊，尚需進一步規(guī)范化；在治療方面的應用價值尚無研究報道。另外，食管外器官或組織胃蛋白酶的檢出為反流性疾病與肺部疾病、耳鼻喉科疾病的相關(guān)性提供了直接證據(jù)或線索。加強對胃蛋白酶在反流性疾病中作用的認識，有利于加深臨床醫(yī)師對反流性疾病發(fā)生機制的理解及新靶向藥物的研發(fā)。

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首都臨床特色應用研究資助項目(Z141107002514109)

100053 北京，火箭軍總醫(yī)院胃食管反流病科

吳繼敏，E-mail:zhonggaowang@126.com

R573.9

A

1002-3429(2017)10-0107-06

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.10.035

2017-02-23 修回時間：2017-05-10)