夏小婷，鄒 勇，黨瑞華，黃永震，藍賢勇，陳 宏，雷初朝*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌712100；2. 貴州關(guān)嶺自治縣動物疫病預(yù)防控制中心，貴州關(guān)嶺，561300)

[目的]探究關(guān)嶺牛Y染色體遺傳多樣性及父系起源。[方法] 采用PCR擴增、限制性酶切和生物信息學(xué)方法，分析關(guān)嶺牛Y-SNP (USP9Y基因)和2個Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)的遺傳多樣性。[結(jié)果] 發(fā)現(xiàn)32頭關(guān)嶺牛USP9Y基因的PCR產(chǎn)物均為552 bp，其中4頭牛的552 bp片段不能被SspI酶切開，屬于普通牛Y2單倍型組，占0.125，其余28頭牛的PCR產(chǎn)物均可被酶切成兩條帶(215 bp和338 bp)，屬于瘤牛Y3單倍型組，占0.875。2個Y-STRs標(biāo)記INRA189和BM861在關(guān)嶺牛品種均表現(xiàn)多態(tài)性(88/104 bp和156/158 bp)。結(jié)合Y-SNP與Y-STRs的分型結(jié)果，界定關(guān)嶺牛有2種Y染色體單倍型Y2-104-158和Y3-88-156，其Y染色體單倍型多樣度為0.2258±0.0882，表明關(guān)嶺牛父系遺傳多樣性很低。[結(jié)論] 關(guān)嶺牛具有普通牛Y2和瘤牛Y3 兩種父系起源，其中瘤牛占明顯優(yōu)勢。

關(guān)嶺牛；USP9Y；Y-STRs；遺傳多樣性；父系起源

關(guān)嶺牛是我國優(yōu)良的地方黃牛品種之一，產(chǎn)于海拔800-1 500 m的貴州高原，因中心產(chǎn)區(qū)在貴州省關(guān)嶺縣，故按歷史習(xí)慣將其統(tǒng)稱“關(guān)嶺?！薄ｊP(guān)嶺牛作為役肉兼用型地方黃牛品種，以體質(zhì)健壯、肉質(zhì)良好、耐粗飼、適應(yīng)性強而著稱[1]。目前，關(guān)于關(guān)嶺牛品種的遺傳多樣性及遺傳背景的研究較少?；诔Ｈ旧w微衛(wèi)星標(biāo)記，韓旭等[2]對關(guān)嶺牛等11個中外黃牛品種進行群體遺傳學(xué)分析，探究了各品種間的遺傳變異與親緣關(guān)系，表明關(guān)嶺牛與分布在云南省昭通地區(qū)的昭通牛遺傳關(guān)系非常近，應(yīng)聚為一類。在線粒體水平上，劉若余等[3]對22頭關(guān)嶺牛線粒體DNA D-loop區(qū)全序列進行分析表明，關(guān)嶺牛同時受到普通牛和瘤牛的影響，遺傳多樣性豐富。

哺乳動物的Y染色體遵循父系遺傳，其絕大部分為非重組區(qū)，突變率低，是研究動物父系起源和馴化歷史的理想工具。近年來，基于Y染色體單核苷酸多態(tài)性(Y-SNPs)和微衛(wèi)星(Y-STRs)的分子遺傳研究，人們發(fā)現(xiàn)世界上的家牛具有Y1、Y2和Y3三種Y染色體單倍型組，其中Y1和Y2代表普通牛起源，Y3代表瘤牛起源[4，5]，2種分子標(biāo)記的結(jié)合使用能夠更精細地反映家牛Y染色體的起源歷史[6, 7]。Bonfiglio等[5]發(fā)現(xiàn)，通過USP9Y基因內(nèi)含子26上的一個81 bp的插入和一個限制性酶切位點進行瓊脂糖電泳能夠直接對這3種單倍型組進行分型后，不用測序只需PCR和酶切電泳分析就可以鑒別不同的單倍型組，這大大降低了分型成本和工作量。

然而，目前關(guān)于關(guān)嶺牛品種Y染色體遺傳多樣性及父系起源的研究較少。因此，本研究對32頭關(guān)嶺牛Y染色體USP9Y基因和2個Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)進行單倍型分析及父系起源研究，為開展該品種的分子育種和資源保護提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與基因組DNA提取

從貴州省關(guān)嶺縣采集32頭關(guān)嶺牛公牛耳組織于-80℃保存?zhèn)溆谩２捎没蚪MDNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成和PCR擴增

1.2.1USP9Y基因的合成、PCR擴增與酶切分析 參照Bonfiglio等[5]發(fā)表的家牛Y染色體USP9Y基因序列合成引物，其中上游引物為5′-AAACCCTTCAAGGTAATAAAACAAAA-3′，下游引物為5′- CACAGCTCCTCAAAACCAGA-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為12.5 μL：上、下游引物各0.25 μL (10 pmol·L-1)，2×Taq MasterMix 6.25 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 5.25 μL。擴增條件為：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸30 s，36個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

用2%的瓊脂糖凝膠對USP9Y基因PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，根據(jù)擴增條帶對單倍型組做出初步分析。再用SspI限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進行酶切。SspI酶切體系為(8 μL)：SspI酶(10 units/μL)0.4 μL(TaKaRa公司)，10×SspI Buffer 0.8 μL，PCR產(chǎn)物2.4 μL，ddH2O 4.4 μL。置于37℃條件下酶切2～3 h后，用1%瓊脂糖凝膠對酶切產(chǎn)物進行電泳檢測，再根據(jù)條帶大小進行單倍型分析和統(tǒng)計。

1.2.2 熒光微衛(wèi)星引物的合成與PCR擴增 參照Edwards等[7]報道的分型方法合成2對熒光Y-STRs引物(INRA189[8]和BM861[9])，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為12.5 μL，其中上、下游引物各0.25 μL (10 pmol·L-1)，2×Taq MasterMix 6.25 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 5.25 μL。擴增條件為：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，Ta℃退火30 s，72℃延伸30 s，36個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。采用2.0%的瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司分型。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

通過單倍型組的判定結(jié)果和2個Y-STRs基因座的定型結(jié)果[7]，利用二者的結(jié)合定義每頭黃牛的Y染色體單倍型(Y-INRA189-BM861)。用ARLEQUIN V3.11[10]軟件計算單倍型頻率和單倍型多樣度(H±SD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)嶺牛USP9Y基因PCR產(chǎn)物多態(tài)性與SspI酶切鑒定

通過對關(guān)嶺牛USP9Y基因的PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，結(jié)果表明：32頭關(guān)嶺牛PCR產(chǎn)物大小均為552 bp，其中4個個體不能被SspI酶切開，有28個個體可以被酶切成215 bp和338 bp兩條帶(圖1)。根據(jù)Bonfiglio等[5]的判定標(biāo)準(zhǔn)：Y1單倍型組(471 bp)能夠直接通過瓊脂糖凝膠電泳與Y2和Y3單倍型組區(qū)分開；利用SspI內(nèi)切酶，Y3單倍型組(552 bp)可被切成215 bp和338 bp兩條帶，而Y2單倍型組(552 bp)不能被切開。因此，可以確定這4頭不能被SspI酶切開的關(guān)嶺牛(552 bp)為普通牛Y2單倍型組，另外28頭能被SspI酶切成兩條帶(215 bp和338 bp)的關(guān)嶺牛為瘤牛Y3單倍型組。

圖1 關(guān)嶺牛USP9Y基因PCR產(chǎn)物酶切多態(tài)性

2.2 關(guān)嶺牛Y-STRs多態(tài)性

利用2個家牛Y-STRs標(biāo)記INRA189和BM861檢測關(guān)嶺牛32頭公牛的Y染色體遺傳多態(tài)性，結(jié)果表明，2個標(biāo)記在32頭關(guān)嶺牛中各檢測到2個等位基因，表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性。在INRA189座位中，關(guān)嶺牛的2個等位基因大小分別為88 bp和104 bp，其中Y2單倍型組對應(yīng)104 bp，Y3單倍型組對應(yīng)88 bp。在BM861座位中檢測到關(guān)嶺牛的2個等位基因大小分別為158 bp和156 bp，其中4頭普通牛檢測出的等位基因大小為158 bp，28頭瘤牛檢測出的等位基因大小為156 bp。

2.3 關(guān)嶺牛單倍型頻率和單倍型多樣度

參考Edwards等[7]報道的Y-SNPs標(biāo)記與Y-STRs標(biāo)記結(jié)合的單倍型分型方法，對32頭關(guān)嶺牛的單倍型進行分析(Y-INRA189-BM861)，共確定了2種單倍型，其中4頭牛為普通牛Y2單倍型(Y2-104-158)，28頭牛為瘤牛Y3單倍型(Y3-88-156)，Y2和Y3單倍型頻率分別為0.125和0.875，關(guān)嶺牛Y染色體單倍型多樣度為0.2258±0.0882。

3 討論

Y染色體分子遺傳多態(tài)性是追溯動物起源、馴化歷史和遷徙路線的重要工具，通過對Y-SNPs與Y-STRs 2種分子標(biāo)記的結(jié)合分析，能更完整、更精細地反映動物的Y染色體單倍型多樣度和父系起源。近年來，國內(nèi)外越來越多的研究已經(jīng)將二者結(jié)合起來分析黃牛群體的Y染色體單倍型結(jié)構(gòu)和父系起源歷史[7, 11]，然而迄今為止，尚未見對關(guān)嶺牛這一優(yōu)良中國地方黃牛品種分子水平上的父系遺傳多樣性及起源的報道。

家牛有3種Y染色體單倍型組，分別是普通牛Y1和Y2單倍型組，瘤牛Y3單倍型組[4-7]。在世界現(xiàn)存的普通牛種中，Y1單倍型組在歐亞大陸北部分布廣泛，Y2單倍型組主要集中于中東和歐洲南部[4]，而中國黃牛除少數(shù)品種含Y1單倍型組外[11，12]，大部分是Y2和Y3兩種單倍型組[11]。本研究采用Bonfiglio等[5]發(fā)展的Y染色體USP9Y基因多態(tài)性檢測技術(shù)，對32頭關(guān)嶺牛公牛進行了單倍型組分析，該方法與傳統(tǒng)Y-SNPs測序分析相比快速有效，能顯著降低分型成本。結(jié)果表明，4頭關(guān)嶺牛為普通牛Y2單倍型組，28頭為瘤牛Y3單倍型組，說明關(guān)嶺牛有普通牛(Y2)和瘤牛(Y3)兩大父系起源，且瘤牛血統(tǒng)占優(yōu)勢。同時，本研究還采用Edwards等[7]報道的Y-SNPs標(biāo)記與Y-STRs標(biāo)記結(jié)合的單倍型分型方法(Y-INRA189-BM861)，共定義出關(guān)嶺牛的2種Y染色體單倍型，其中Y3-88-156瘤牛單倍型明顯占優(yōu)勢(0.875)，這與Li等[11]對中國部分黃牛品種的研究結(jié)果一致，說明關(guān)嶺牛具有與中國南部黃牛品種相似的父系遺傳組成，即以Y3-88-156瘤牛單倍型為主。另外，也與劉若余等[3]基于線粒體DNA D-loop區(qū)對關(guān)嶺牛母系起源的研究結(jié)果相吻合。

單倍型多樣度是衡量一個群體變異程度的重要指標(biāo)，單倍型多樣度高的群體說明其遺傳多樣性高，遺傳資源豐富。值得注意的是，Edwards等[7]報道的138個國外牛品種的單倍型多樣度平均值為0.422±0.3，Li等[11]公布的中國16個黃牛品種的單倍型多樣度平均值為0.6831±0.0134，均大于本研究中32頭關(guān)嶺牛的單倍型多樣度(0.2258±0.0882)，這表明關(guān)嶺牛Y染色體單倍型多樣度和分子遺傳多樣性較低，這可能與采樣地區(qū)的公牛有效群體較小有關(guān)。據(jù)2011年《中國畜禽遺傳資源志—牛志》[2]記載，關(guān)嶺?；静扇”窘环绞竭M行純種繁殖，尚未建立關(guān)嶺牛保護區(qū)和保種場。近年來，為了提高關(guān)嶺牛的生產(chǎn)性能，引入了國外西門塔爾、利木贊、安格斯等肉牛品種凍精進行雜交改良，忽視了品種資源的保護，加之農(nóng)戶對種質(zhì)資源保護的意識淡薄，近親繁殖現(xiàn)象很普遍，導(dǎo)致關(guān)嶺牛的優(yōu)良性狀正逐漸退化[13]。因此，必須加大對關(guān)嶺牛保種的力度，建立健全的保種體系，從而使這一優(yōu)良地方黃牛品種資源得到更有效的保護和利用。

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