李卓虹+祝朝富+安佰平

摘要：目的 探討靛玉紅（Indirubin）對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、血管形成影響。方法 采用肝癌HepG2細(xì)胞上清誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）成為腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞（tumor-derived endothelial cells，Td-EC），通過(guò)MTT法、細(xì)胞遷徙試驗(yàn)、血管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靛玉紅對(duì)HUVEC與Td-EC增殖、遷移、血管形成的影響。結(jié)果 靛玉紅在體外對(duì)Td-EC有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，并具有時(shí)間和濃度依賴性；一定濃度的靛玉紅能顯著降低Td-EC細(xì)胞遷徙活性和抑制血管的形成，而同樣條件下，靛玉紅對(duì)HUVEC的抑制作用弱于Td-EC。結(jié)論 靛玉紅在體外可特異地抑制Td-EC增殖、遷移、血管形成。

關(guān)鍵詞：靛玉紅；腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞；增殖；遷移；血管形成

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2017）02-0072-04

【Abstract】Objective： To investigate the effect of indirubin on the proliferation， migration and angiogenesis of vascular endothelial cells. Methods： Human umbilical vein endothelial cells （HUVEC） were induced to differentiate into tumor-derived endothelial cells （Td-EC） by HepG2 cell supernatant. MTT assay， cell migration assay and angiogenesis test were used to detect the effect of indirubin on the proliferation， migration and angiogenesis of HUVEC and Td-EC. Results： Indirubin had significant growth inhibitory effect on Td-EC in vitro and time and concentration dependence. Indirubin with certain concentration could significantly reduce the migration of Td-EC cells and inhibit the formation of blood vessels. In the similarity condition， the inhibitory effect of indirubin on HUVEC was weaker than that of Td-EC. Conclusion： Indirubin can specifically inhibit the proliferation， migration and angiogenesis of Td-EC in vitro.

【Key words】indirubin， tumor vascular endothelial cell， proliferation， migration， angiogenesis

腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移依賴于血管生成，血管生成可為腫瘤組織提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，并帶走其代謝產(chǎn)物，因而抗腫瘤血管生成成為目前理想的抗癌治療策略[1]。靛玉紅是從我國(guó)傳統(tǒng)中藥青黛、板藍(lán)根、大青葉中提煉而成，已經(jīng)有大量研究表明靛玉紅具有抑制細(xì)胞周期[2]、殺傷腫瘤細(xì)胞以及抗炎[3]等多種功效。但對(duì)靛玉紅抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生成的機(jī)制尚不清楚，本研究中，我們將探討靛玉紅對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、血管形成影響，以期揭示其對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)及相關(guān)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 Trizol（Ambion公司），抗體（Santa公司），胰蛋白酶（HyClone公司），胎牛血清（Invitrogen公司），Matrix基質(zhì)膠（BD公司），人肝癌HepG2細(xì)胞（四川大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程研究室）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取健康、足月剖宮產(chǎn)胎兒臍帶20-30 cm，以胰酶灌注法分離臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，用含20%胎牛血清、10 ng/L VEGF的PRMI1640 培養(yǎng)傳代，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Ⅷ因子相關(guān)抗原以鑒定HUVEC，人肝癌HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640 液培養(yǎng)至70% 匯合時(shí)，換成無(wú)血清的RPMI1640 液再培養(yǎng)48 h。收集培養(yǎng)上清液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾后，于-80℃保存?zhèn)溆?。取?代HUVEC，用含體積分?jǐn)?shù)50% HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)，匯合至80%時(shí)收集細(xì)胞，即為腫瘤血管血管內(nèi)皮細(xì)胞（Td-EC），并可培養(yǎng)傳代。

1.2.2 RT-PCR 檢測(cè) 以正常HUVEC 為對(duì)照組，提取Td-EC細(xì)胞總RNA。根據(jù)TEM1及TEM8 的cDNA 設(shè)計(jì)引物，并由成都寶信生物工程技術(shù)有限公司合成。用RT-PCR來(lái)檢測(cè)TEM1及TEM8 mRNA的表達(dá)，總RNA用RevertAid First Strand cDNA試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈。TEM1、TEM8和β-actin引物為：TEM1：5-cattatcccaactgcccagc-3（R）和5-ctgatgggtgaggtctggtt5-（F）；TEM8：5-gctgcaccactggaatgaaa-3（R）和5-gtctcctcctggcagaactt5-（F）β-actin：5-cctgcttgctgatccacatc-3（R）和5-cctctatgccaacacagtgc-3（F）用Deam Taq PCR Master Mix（2X）進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件為：95℃，3 min的預(yù)變性；95℃，30 s；68℃，30 s；72℃，1 min；30個(gè)循環(huán)；延伸72℃，10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠電泳成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察并采集圖片。

1.2.3 細(xì)胞增殖能力測(cè)定 采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC、Td-EC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104 cells/mL接種于96孔培養(yǎng)板，200 μL/孔。以0、5、10 μmol/L濃度靛玉紅處理細(xì)胞。置37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在24、48、72 h后，加入MTT（5 mg/mL）20 μl/孔繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄原培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl/孔，室溫輕度振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm的OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力測(cè)定 采用劃痕法測(cè)定腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力。將HUVEC及Td-EC細(xì)胞接種于6孔板，以0、5、10 μmol/L濃度靛玉紅處理細(xì)胞。待細(xì)胞融合后劃痕，48 h后，用導(dǎo)倒置顯微鏡觀察、拍照，測(cè)量劃痕距離。

1.2.5 血管形成實(shí)驗(yàn) 在24孔板中加入matrigel膠（按1：2比例與無(wú)血清培養(yǎng)基混合），置37℃凝固后，將HUVEC、Td-EC細(xì)胞以1.5×105 cells/mL接種于24孔板中，每4 h觀察1次管腔形成情況，12 h終止培養(yǎng)。繼續(xù)加入5 μmol/L靛玉紅的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后觀察、計(jì)數(shù)。

1.2.6 體外侵襲能力實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)采用Transwell 小室法。Transwell小室的上室膜鋪ECM 凝膠。下室加10% FBS 的培養(yǎng)液500 μl/室，上室接種無(wú)血清培養(yǎng)基過(guò)夜的HUVEC、Td-EC細(xì)胞，1×105cells/孔（200 μl），每組設(shè)3個(gè)平行孔，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后取出小室固定細(xì)胞，用上述方法染色計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS21.0中進(jìn)行，計(jì)量資料用（x±s）表示；各組組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 HUVEC的鑒定 HUVEC具有純度高、活性好，可在體外培養(yǎng)并可傳代七代以上的特性。培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記（CD31、CD45、CD62、vWF）和對(duì)低密度脂蛋白（LDL）的吞噬功能檢測(cè)細(xì)胞純度[4-5]，用碘化丙錠（PI）檢測(cè)細(xì)胞活性，細(xì)胞純度和活性分別達(dá)到95%以上。結(jié)果見下表1、圖1。

2.2 腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)生成及鑒定 RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳顯示：從Td-EC 中能擴(kuò)增出約290 bp 及460 bp 的條帶（圖2），說(shuō)明HUVEC 經(jīng)HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)后，細(xì)胞表達(dá)TEM1 和TEM8，這是腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特有的表達(dá)抗原，故誘導(dǎo)細(xì)胞具備了腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的特性（見圖2）。

2.3 靛玉紅對(duì)Td-EC細(xì)胞增殖的影響 靛玉紅處理24 h 后，HUVEC、Td-EC細(xì)胞增殖能力均明顯受到抑制，并與時(shí)間及劑量成正相關(guān)，與對(duì)照組正常HUVEC、Td-EC 細(xì)胞相比，差異有顯著性，并具有時(shí)間和濃度依賴性（P<0.05）；而靛玉紅對(duì)HUVEC 細(xì)胞增殖能力抑制作用弱于Td-EC，對(duì)照組正常Td-EC細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于HUVEC細(xì)胞（見圖3）。

2.4 靛玉紅對(duì)Td-EC細(xì)胞遷移能力的影響 靛玉紅處理48 h 后，HUVEC、Td-EC細(xì)胞遷移能力均明顯受到抑制，并與劑量成正相關(guān)，與對(duì)照組正常HUVEC、Td-EC 細(xì)胞相比，差異有顯著性，并具有濃度依賴性；靛玉紅對(duì)Td-EC細(xì)胞遷移能力抑制作用明顯強(qiáng)于HUVEC細(xì)胞（見圖4）。

2.5 靛玉紅對(duì)Td-EC細(xì)胞血管形成的影響 HUVEC是國(guó)內(nèi)外建立體外血管生成模型的常用細(xì)胞，利用其在膠原組織上的爬行、融合形成小管樣結(jié)構(gòu)來(lái)觀察研究藥物對(duì)小管形成的影響是經(jīng)典研究方法[6]。靛玉紅處理前，Td-EC細(xì)胞管腔形成能力明顯強(qiáng)于HUVEC（P<0.05），表明Td-EC細(xì)胞較正常HUVEC具有更強(qiáng)的血管形成能力。靛玉紅處理后，Td-EC細(xì)胞管腔形成能力明顯受到抑制（P<0.05），與HUVEC細(xì)胞相比，靛玉紅對(duì)Td-EC細(xì)胞血管形成能力抑制效果更明顯（P<0.05）（見圖5、表2）。

2.6 靛玉紅對(duì)Td-EC細(xì)胞體外侵襲能力的影響 HUVEC在靛玉紅處理前后細(xì)胞遷徙數(shù)無(wú)顯著性差異（P>0.05）；而Td-EC細(xì)胞經(jīng)靛玉紅處理后其遷徙數(shù)明顯減少（P<0.05）；未經(jīng)靛玉紅處理Td-EC細(xì)胞遷徙數(shù)明顯多于HUVEC細(xì)胞（P<0.05）。表明Td-EC 細(xì)胞較正常內(nèi)皮細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷徙能力，利于腫瘤的生長(zhǎng)，而對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞的影響較小。（見圖6）

3 結(jié)論

靛玉紅為吲哚類化合物，存在于靛藍(lán)、多種腹足綱軟體動(dòng)物、健康和患病人群的尿液，及各種野生型或重組細(xì)菌中[7]，靛玉紅最早被我國(guó)用于臨床治療慢性粒細(xì)胞白血病。近些年隨著研究的深入，靛玉紅及其衍生物不斷地被發(fā)掘，在抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫[3，8，9]等方面均有顯著的療效。血管內(nèi)皮細(xì)胞是指襯于心、血管和淋巴管內(nèi)表面的單層扁平上皮，它形成血管的內(nèi)壁。血管內(nèi)皮細(xì)胞具有吞噬異物、細(xì)菌、壞死和衰老組織的作用，還參與集體免疫活動(dòng)。感染、炎癥情況下，內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)活化、釋放細(xì)胞因子、促血小板凝集等參與病理變化，其自身還可以發(fā)生凋亡或通過(guò)增殖而自我修復(fù)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，需伴隨血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖和血管新生[10]。

本研究證明靛玉紅在體外對(duì)Td-EC在增殖、遷移、血管形成以及侵襲能力均具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，并具有時(shí)間和濃度依賴性；一定濃度的靛玉紅能顯著降低Td-EC細(xì)胞遷徙活性和抑制血管的形成，而同樣條件下，靛玉紅對(duì)HUVEC的抑制作用弱于Td-EC，說(shuō)明相對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞靛玉紅影響更加明顯。由于體外腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞模型仍存在一定局限性，靛玉紅對(duì)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用有待于動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí)，從而有利于新型抑制腫瘤血管內(nèi)皮生長(zhǎng)藥物的開發(fā)。

參考文獻(xiàn)：

[1]唐月汀，焦曉陽(yáng).血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C惡性腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用與臨床研究[J].汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，25（3）：176-178.

[2]Carassou P，Meijer L，Le Moulec S，et al.Cell cycle and molecular targets：CDK inhibition.Bull Cancer，2012，99（2）：163-171.

[3]Eisenbrand G，Hippe F，Jakobs S，et al.Molecular mechanisms of indirubin and its derivatives：Novel anticancer molecules with their origin in traditional Chinese phytomedicine.J Cancer Res Clin Oncol，2004，130（11）：627-635.

[4]Piebe M，Paulsen F，Jalnke T，et al.Mechanical brushcatheter abrasion method for the isclation and crlture of human conbilical veir endothelial cells.First in vitro results，2001，173（10）：955-958.

[5]秦明春，王若光，秦莉花，等.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27（4）：12-15.

[6]Vailhe B，Vittet D，F(xiàn)eige JJ.In v itrom odels of vascu logenesis and angiogenesis.Lab Invest，2001，81（4）：439 – 452.

[7]Polychronopoulos P，Magiatis P，Skaltsounis A L，et al.Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases[J].J Med Chem，2004，47：935-946.

[8]王通，曾耀英，肇靜嫻，等.靛藍(lán)和靛玉紅對(duì)小鼠T細(xì)胞活化與增殖的影響[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005（5）：444-447.

[9]吳琦瑋，葛忠良，高月，等.靛玉紅對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用的研究及相關(guān)機(jī)制探討[J].天津中醫(yī)藥，2008，25（1）：55-56.

[10]Toya SP，Malik AB.Role of endothelial injury in disease mechanisms and contribution of progenitor cells in mediating endothelial repair[J].Immunobiology，2012，217（5）：569-580.

（收稿日期：2016-10-26）