范國權(quán) 陳向偉

030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)微生物與免疫教研室

流感病毒的季節(jié)性流行或大流行在人群中造成不同程度的死亡，也給養(yǎng)禽業(yè)及國際貿(mào)易造成巨大的損失。更為嚴(yán)重的是，近年來隨著禽類流感的不斷爆發(fā)，其突破宿主的種屬屏障，感染包括人類在內(nèi)的多種哺乳動物，對人類的公共衛(wèi)生安全造成嚴(yán)重的威脅[1-4]。禽流感在活禽市場和家禽屠宰加工廠檢出率非常高，大大增加了人們與其接觸的機(jī)會[5]。2013年3月底在上海和安徽兩地發(fā)現(xiàn)了H7N9型禽流感感染人病例，這些病例主要表現(xiàn)為典型的病毒性肺炎，部分病例可迅速發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征并死亡[6]。之后疫情擴(kuò)散更廣泛，患者年齡出現(xiàn)了年輕化，病毒致病性也發(fā)生了變化[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染后可以造成機(jī)體的免疫病理損傷，血管內(nèi)皮細(xì)胞在病毒感染激活固有免疫階段起到非常重要作用[8]。本研究用H3N2、H9N2流感病毒的重組HA蛋白和滅活H9N2病毒分別接種內(nèi)皮細(xì)胞，解析其在宿主細(xì)胞固有免疫應(yīng)答中的作用，將為了解其他亞型病毒的致病機(jī)制提供一些參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料甲型流感H9N2(A/Chicken/Hong Kong/G9/97)重組血凝素(Hemagglutinin，HA)蛋白，甲型流感H3N2(A/X-31)血凝素HA蛋白購自Sino Biological Inc.。禽流感(H9亞型)滅活病毒(SD696株)購自乾元浩生物股份有限公司。IFN-β ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。HUVECs，由實(shí)驗(yàn)室保存，按常規(guī)方法進(jìn)行復(fù)蘇、傳代，實(shí)驗(yàn)用3～5代細(xì)胞。

1.2實(shí)驗(yàn)分組HA實(shí)驗(yàn)組按5 μg/ml劑量接種H3和H9亞型病毒HA于HUVECs，滅活病毒組按103EID50滅活A(yù)/Chicken/Shandong/6/96(H9N2)ml-1接種HUVECs，陰性對照組按正常細(xì)胞培養(yǎng)，所有組在37 ℃吸附1 h，棄上清液，洗滌后，每孔加入DMEM細(xì)胞維持培養(yǎng)基(含0.2% BSA)。在接種后24 h和36 h分別收集細(xì)胞懸液，并在接種24 h時間點(diǎn)，用冷PBS洗滌細(xì)胞3次，收集細(xì)胞，待提取總RNA。

1.3實(shí)時定量PCR檢測細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量

1.3.1 細(xì)胞總RNA提?。毫装寮尤? ml Trizol溶液，用移液器吹打至絲狀物消失，使細(xì)胞充分裂解，分別轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管中，用氯仿-異丙醇-乙醇方法提取細(xì)胞總RNA，純化后的細(xì)胞總RNA在波長為260/280 nm檢測RNA的質(zhì)量。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自TaKaRa公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。提取總RNA 1 μg，合成cDNA，所得cDNA于-4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 實(shí)時定量PCR(Real-Time PCR)反應(yīng)：使用熒光定量試劑盒(購自ABI公司)，以ACTB為內(nèi)部參照，用相對定量方法計(jì)算mRNA量。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，序列和擴(kuò)增片段長度見表1。

表1 目的基因引物信息

配制反應(yīng)體系，25 μl體系包括SybrGreen qPCR Master Mix(2×) 12.5 μl，引物F(10 μmol/L) 0.5 μl，引物R(10 μmol/L) 0.5 μl，ddH2O 9.5 μl，cDNA模板 2 μl。將上述混合物混勻離心后按照下列反應(yīng)程序下于ABI 7500型熒光定量PCR儀檢測系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng)：預(yù)變性95℃ 10 min；PCR反應(yīng)，變性95℃ 15 s，退火/延伸60℃ 1 min，40個循環(huán)；對溶解曲線進(jìn)行分析。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)2-ΔΔCT相對定量方法對基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的檢測用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測樣本中干擾素IFN-β的含量，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程式，將檢測樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品的檢測濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，得到樣品的實(shí)際濃度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所用檢測方法為學(xué)生t檢驗(yàn)或單向方差分析(One-way analysis of variance，ANOVA)。各實(shí)驗(yàn)組分別與對照組比較時(相對定量PCR基因mRNA相對表達(dá)值)，使用學(xué)生t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)各分組相互比較時(干擾素IFN-β蛋白表達(dá)量)，使用ANOVA方法分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算使用美國的微軟Excel軟件處理。

2 結(jié)果

2.1流感病毒HA接種HUVEC后IFNB1、CCL5、IFITM3mRNA的表達(dá)H3和H9亞型流感病毒重組HA蛋白接種HUVEC后24 h，H3組和H9組的IFNB1、CCL5、IFITM3的mRNA相對表達(dá)量與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(IFNB1，P=0.051、0.127；CCL5，P=0.314、0.429；IFITM3，P=0.530、0.269，t檢驗(yàn))；滅活病毒(Viral particle)組CCL5和IFITM3與對照組比較相對表達(dá)量顯著增加(P=0.022、0.047，t檢驗(yàn))，IFNB1與對照組比較相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.061，t檢驗(yàn))，見圖1，檢測數(shù)據(jù)見表2。提示流感病毒重組HA蛋白單獨(dú)作用內(nèi)皮細(xì)胞，不能有效激活內(nèi)皮細(xì)胞固有免疫；而滅活病毒能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞干擾素誘導(dǎo)基因的高表達(dá)。

注：Control代表對照組，Viral Particle代表滅活H9N2病毒，H3代表H3亞型流感病毒血凝素重組蛋白，H9代表H9亞型流感病毒血凝素重組蛋白。圖1 流感病毒重組HA蛋白接種HUVEC 24 h后IFNB1、CCL5和IFITM3 mRNA的表達(dá)量Note: Control as a negative control group, Viral particle as an inactived influenza virus particle, H3 as recombinant HA proteins of H3N2, H9 as recombinant HA proteins of H9N2.Fig.1 The expression of IFNB1, CCL5 and IFITM3 mRNA 24 h after innoculation of recombinant hemagglutinin proteins of influenza virus

基因?qū)φ战M滅活病毒組H3重組血凝素組H9重組血凝素組GeneControlViralparticleH3H9IFNB11 000±0 0161 523±0 2351 450±0 1841 723±0 496CCL51 067±0 15814 401±3 487?1 366±0 3871 434±0 642IFITM31 012±0 1804 091±1 234?1 207±0 4351 387±0 432

注：與對照組相比，*P<0.05

Notes：Compared with Control Group,*P<0.05

2.2流感病毒重組HA蛋白接種HUVEC后IFN-β表達(dá)量對照組、滅活病毒組、H3重組血凝素組和H9重組血凝素組的IFN-β蛋白表達(dá)量分別為12 h時間點(diǎn)(19.382±2.588，17.199±3.850，17.942±1.617，18.302±2.658)，24 h時間點(diǎn)(20.627±4.094，18.518±1.714，19.232±1.883，18.306±2.595)。各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.871，ANOVA檢驗(yàn))，見圖2，提示流感病毒HA蛋白及H9N2滅活病毒顆粒均不能有效刺激內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)I型干擾素IFN-β。

注：Control代表對照組，Viral Particle代表滅活H9N2病毒，H3代表H3亞型流感病毒血凝素重組蛋白，H9代表H9亞型流感病毒血凝素重組蛋白。圖2 流感病毒重組HA蛋白接種HUVEC后IFN-β表達(dá)量Note: Control as a negative control group, Viral particle as an inactived influenza virus particle, H3 as recombinant HA proteins of H3N2, H9 as recombinant HA proteins of H9N2.Fig.2 IFN-β levels of recombinant hemagglutinin proteins of influenza virus group

3 討論

近年來流感病毒的暴發(fā)越來越頻繁，比如2009年暴發(fā)于北美洲的甲型H1N1流感，2013年在上海、江蘇等地爆發(fā)的甲型H7N9流感，以及2017年中國香港暴發(fā)甲型H3N2流感。流感病毒的表面血凝素抗原和神經(jīng)氨酸酶不斷的變異，人群對其無免疫力，容易形成流行，不同亞型病毒之間還可以交換某些基因片段發(fā)生基因重排，出現(xiàn)具有新的生物學(xué)特征的病毒，這給抗流感病毒藥物和疫苗的研制提出很大的挑戰(zhàn)。流感病毒感染機(jī)體早期，機(jī)體依靠先天免疫機(jī)制發(fā)揮防御作用，上皮細(xì)胞構(gòu)成抗感染的自然免疫屏障；病毒感染引起肺泡上皮細(xì)胞壞死、脫落，進(jìn)而病毒可作用于肺部血管內(nèi)皮細(xì)胞。已有研究表明流感病毒可直接感染內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞在病毒感染后固有免疫應(yīng)答過程中起重要作用[9]。

本研究使用滅活流感病毒模擬早期病毒與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，并單獨(dú)使用流感病毒囊膜表面最豐富的抗原HA蛋白刺激內(nèi)皮細(xì)胞，監(jiān)測病毒顆粒和病毒蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)采用熒光實(shí)時定量PCR法檢測了固有免疫中干擾素(IFNB1)和干擾素誘導(dǎo)基因(CCL5和IFITM3)的表達(dá)情況，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測了干擾素(IFNβ1)蛋白表達(dá)水平。IFN-β屬于I型干擾素，是機(jī)體細(xì)胞抵抗病毒感染的第一道防線，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生CCL5[10]和IFITM3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用不同亞型(H3和H9)HA蛋白不能有效激活內(nèi)皮細(xì)胞固有免疫應(yīng)答(IFNB1、CCL5和IFITM3)，而病毒滅活顆粒可以有效激活干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)(CCL5和IFITM3)，說明啟動內(nèi)皮細(xì)胞固有免疫系統(tǒng)，需要完整的病毒顆粒參與，但無論是HA蛋白還是病毒顆粒在作用于內(nèi)皮細(xì)胞在12 h和24 h時間點(diǎn)，沒有有效引起I型干擾素IFN-β的高表達(dá)，推測內(nèi)皮細(xì)胞干擾素誘導(dǎo)蛋白基因的高表達(dá)可能存在不依賴于I型干擾素的誘導(dǎo)通路，內(nèi)皮細(xì)胞模式識別系統(tǒng)是在胞內(nèi)進(jìn)行識別，并且不依賴流感病毒復(fù)制。在內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，有研究者發(fā)現(xiàn)H3亞型重組HA蛋白接種肺內(nèi)皮細(xì)胞不能促進(jìn)血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞(重組HA蛋白不能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附相應(yīng)基因高表達(dá))，而滅活H3亞型病毒顆粒能促進(jìn)血小板黏附內(nèi)皮細(xì)胞[11]，提示流感病毒誘導(dǎo)某些基因高表達(dá)也需要完整病毒顆粒刺激細(xì)胞。已有研究發(fā)現(xiàn)流感病毒重組蛋白HA(H1和H5亞型)能誘導(dǎo)小鼠髓性樹突狀細(xì)胞表達(dá)炎性細(xì)胞因子，并且不同亞型HA蛋白誘導(dǎo)效果沒有顯著差別[12]。這說明不同類型細(xì)胞對流感病毒HA蛋白的應(yīng)答反應(yīng)因細(xì)胞不同而具有很大的差異。而本研究中發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用重組HA蛋白不能有效激活內(nèi)皮細(xì)胞固有免疫應(yīng)答，需要完整病毒顆粒刺激內(nèi)皮細(xì)胞激活免疫反應(yīng)。

本研究初步從細(xì)胞水平探討流感病毒重組HA蛋白及滅活病毒顆粒對內(nèi)皮細(xì)胞的影響，并對可能存在的固有免疫反應(yīng)進(jìn)行了初步探討。已有的研究發(fā)現(xiàn)不同類型的細(xì)胞需通過不同的信號通路啟動相應(yīng)的免疫應(yīng)答，但流感病毒顆粒如何激活干擾素誘導(dǎo)蛋白尚需今后深入研究。

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