周丹，劉雪茹，李濤，劉力，譚曉秋，劉玉林

(1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000；2西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所)

小G蛋白R(shí)ab5對(duì)表達(dá)在HEK293細(xì)胞上的大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的影響

周丹1，劉雪茹1，李濤2，劉力1，譚曉秋2，劉玉林1

(1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000；2西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所)

目的 探討小G蛋白R(shí)ab5對(duì)HEK293細(xì)胞大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCa)的影響。方法 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEK293細(xì)胞，隨機(jī)分為Control組、Rab5WT組、Rab5CA組和Rab5DN組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，Control組轉(zhuǎn)染Flag-hSlo1-GFP質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1，Rab5WT組轉(zhuǎn)染Flag-hSlo1-GFP質(zhì)粒和Rab5WT質(zhì)粒，Rab5CA組轉(zhuǎn)染Flag-hSlo1-GFP質(zhì)粒和Rab5CA質(zhì)粒，Rab5DN組轉(zhuǎn)染Flag-hSlo1-GFP質(zhì)粒和Rab5DN質(zhì)粒，每組兩種質(zhì)?？偭繛? μg，按質(zhì)量比1∶1共轉(zhuǎn)染至3.5 mm培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染72 h、熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率在70%以上時(shí)，采用膜片鉗、Western blotting法和流式細(xì)胞術(shù)觀察Rab5對(duì)HEK293細(xì)胞BKCa的作用。結(jié)果 與Control組比較，Rab5WT組、Rab5CA組BKCa全細(xì)胞電流密度明顯增加，而Rab5DN組明顯降低；Rab5WT組、Rab5CA組BKCa膜蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，而Rab5DN組明顯降低(P均<0.05)；Rab5WT組、Rab5CA組Flag+/GFP+明顯增加，而Rab5DN組明顯降低(P均<0.05)。結(jié)論 Rab5能夠明顯增加表達(dá)在HEK293細(xì)胞上的BKCa電流及細(xì)胞膜上的表達(dá)，并可促進(jìn)BKCa向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。

小G蛋白家族；大電導(dǎo)鈣激活鉀通道；蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)；基因轉(zhuǎn)染

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCa)是血管平滑肌細(xì)胞膜上重要的離子通道， 可攜帶70%～80%的外向

電流，在調(diào)節(jié)血管張力和血壓中發(fā)揮重要作用[1]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)， BKCa是眾多舒血管藥物的作用靶點(diǎn)，其功能活動(dòng)異常與高血壓等密切相關(guān)[2,3]。BKCa蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成、高爾基體加工后，需經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜機(jī)制組裝并轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜上，才能發(fā)揮生理功能；因此，細(xì)胞膜上BKCa蛋白的表達(dá)水平及調(diào)控對(duì)其功能的發(fā)揮至關(guān)重要。小G蛋白家族成員Rab在質(zhì)膜內(nèi)側(cè)及多種胞內(nèi)囊泡結(jié)構(gòu)中存在，具有調(diào)節(jié)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和離子通道活動(dòng)等功能。既往研究發(fā)現(xiàn)，Rab蛋白可參與多種離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控過(guò)程[4]。2012年9月～2015年12月，本研究觀察了Rab5對(duì)表達(dá)在HEK293細(xì)胞上BKCa轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 HEK293細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。含人血管平滑肌BKCaα亞單位的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-hSlo1，由本實(shí)驗(yàn)室保存。Flag和GFP雙標(biāo)記hSlo1表達(dá)質(zhì)粒(簡(jiǎn)稱Flag-hSlo1-GFP質(zhì)粒)，含有人Rab5小G蛋白野生型(WT)、顯性負(fù)向型(DN)、持續(xù)激活型(CA)的表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1)，由本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR和定點(diǎn)突變完成，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。EPC-10膜片鉗系統(tǒng)，德國(guó)HEKA公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司。質(zhì)粒提取試劑盒，美國(guó)Omega公司；Lipotamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，美國(guó)Life Science公司；Western blotting凝膠配制試劑，江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；膜蛋白提取試劑盒，美國(guó)Pierce公司；APC標(biāo)記的Flag一抗，日本MBL公司；其余常用試劑購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞置于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞融合至80%時(shí)，隨機(jī)分為Control組、Rab5WT組、Rab5CA組和Rab5DN組，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Control組轉(zhuǎn)染Flag-hSlo1-GFP質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1，Rab5WT組轉(zhuǎn)染Flag-hSlo1-GFP質(zhì)粒和Rab5WT質(zhì)粒，Rab5CA組轉(zhuǎn)染Flag-hSlo1-GFP質(zhì)粒和Rab5CA質(zhì)粒，Rab5DN組轉(zhuǎn)染Flag-hSlo1-GFP質(zhì)粒和Rab5DN質(zhì)粒，每組兩種質(zhì)?？偭繛? μg，按質(zhì)量比1∶1共轉(zhuǎn)染至3.5 mm培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染72 h，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率在70%以上時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 BKCa電流記錄 使用全細(xì)胞膜片鉗記錄BKCa電流，電極阻抗3～5 mΩ。記錄BKCa電流的浴液：NaCl 137.0 mmol/L、KCl 5.9 mmol/L、MgCl21.2 mmol/L、CaCl21.8 mmol/L、HEPES 10.0 mmol/L，使用NaOH將浴液pH調(diào)至7.4；電極液：KCl 128.0 mmol/L，NaCl 12.0 mmol/L，MgCl24.0 mmol/L，HEPES 10.0 mmol/L，EGTA 1.0 mmol/L，使用KOH將電極液pH調(diào)至7.2，根據(jù)文獻(xiàn)[5]加入適量的CaCl2，使細(xì)胞內(nèi)游離Ca濃度為0.1 μmol/L。鉗制電位為-80 mV，刺激方案采用階躍刺激方案：-80～60 mV，時(shí)程400 ms。

1.4 BKCa膜蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用生物素化方法提取細(xì)胞膜蛋白，分離、純化，Western blotting法檢測(cè)。所有操作步驟嚴(yán)格按照Pierce? Cell Surface Protein Isolation Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行[5]。主要步驟：①生物素化：收集待處理細(xì)胞，加入冰預(yù)冷的PBS溶液輕輕洗滌2次；加入冰預(yù)冷的生物素化溶液，4 ℃輕輕搖晃混勻，孵育30 min；生物素化標(biāo)記結(jié)束，加入終止液終止反應(yīng)。將細(xì)胞收集到離心管中，用冰預(yù)冷的TBS溶液洗滌細(xì)胞，3 000 r/min離心5 min，沉淀細(xì)胞；②細(xì)胞裂解：使用含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上30 min裂解細(xì)胞，4 ℃ 10 000 g離心2 min，收集上清；③分離生物素化標(biāo)記的膜蛋白：將NeutrAvidin瓊脂糖珠子置于收集的上清中，加入蛋白裂解液，室溫振蕩，孵育60 min，1 000 g離心1 min，棄掉上清，wash buffer洗滌；④蛋白洗脫：將蛋白樣品加入50 mmol/L DTT的SDS-PAGE 1×上樣緩沖液，室溫?fù)u晃混勻，孵育60 min，1 000 g離心2 min，收集上清蛋白樣品(即膜蛋白)，采用Western blotting法檢測(cè)[5]。具體步驟：SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，4 ℃一抗(rabbit anti-hslo1 antibody，1∶1 000)孵育過(guò)夜，二抗(HRP tagged anti-rabbit antibody，1∶2 500)室溫孵育1 h，ECL顯影，采用Bio-Lab成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，所得圖像采用Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.5 BKCa蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集Control組、Rab5WT組、Rab5CA組和Rab5DN組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，加入APC標(biāo)記Flag一抗的熒光抗體(1∶400)，4 ℃孵育2 h。然后加入100 μL冰預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，200目銅網(wǎng)過(guò)濾。另設(shè)置陰性對(duì)照(未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞)。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，通過(guò)計(jì)算得到Flag陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比值，以此反映BKCa蛋白由細(xì)胞膜向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。

2 結(jié)果

2.1 Rab5對(duì)BKCa電流的影響 與Control組比較，Rab5WT組、Rab5CA組BKCa電流明顯增加，而Rab5DN組明顯降低。結(jié)果見(jiàn)圖1、表1。

注：全細(xì)胞構(gòu)型下，膜電位(Vm)去極化到+60 mV時(shí)Rab5對(duì)BKCa全細(xì)胞電流的原始記錄。

圖1 Rab5對(duì)表達(dá)在HEK293細(xì)胞上的BKCa全細(xì)胞電流的影響

注：與Control組比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.2 Rab5對(duì)BKCa膜蛋白表達(dá)的影響 以Control組BKCa膜蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1，Rab5WT組、Rab5CA組、Rab5DN組BKCa膜蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.24±0.08、1.42±0.13、0.73±0.11。與Control組比較，Rab5WT組、Rab5CA組BKCa膜蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，而Rab5DN組BKCa膜蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P均<0.05)。

2.3 Rab5對(duì)BKCa蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ圖1。未轉(zhuǎn)染BKCa的HEK293細(xì)胞主要集中在第三象限，而Flag和GFP雙陰性、轉(zhuǎn)染BKCa(Flag-hSlo-GFP雙標(biāo)記)的HEK293細(xì)胞則分布在第一、三、四象限。其中第一象限為Flag和GFP雙陽(yáng)性細(xì)胞，即能夠檢測(cè)到BKCa蛋白在細(xì)胞膜上表達(dá)的細(xì)胞；第四象限為GFP陽(yáng)性、Flag陰性細(xì)胞，即雖然轉(zhuǎn)染BKCa通道，但由于大多數(shù)通道表達(dá)主要集中在細(xì)胞內(nèi)，未被Flag抗體檢測(cè)到。因此，分析Flag陽(yáng)性與GFP陽(yáng)性細(xì)胞的比值(即第一象限與第一、四象限之和的比值)，可反映BKCa蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。Control組、Rab5WT組、Rab5CA組、Rab5DN組Flag+/GFP+分別為42.37±4.86、53.74±5.48、62.83±4.93、31.47±4.71。與Control組比較，Rab5WT組、Rab5CA組Flag+/GFP+均明顯增加，而Rab5DN組明顯降低(P<均0.05)。

3 討論

BKCa在多種組織細(xì)胞中均有表達(dá)，在血管平滑肌細(xì)胞上分布極為豐富。在血管平滑肌細(xì)胞上，BKCa激活可引起細(xì)胞膜超極化，通過(guò)抑制L型鈣通道而舒張血管[6,7]。BKCa同時(shí)還可偶聯(lián)胞內(nèi)鈣和膜電位，在調(diào)控血管平滑肌功能中發(fā)揮重要作用。膜離子通道的功能很大程度上依賴于其在細(xì)胞膜上的表達(dá)豐度。有研究證實(shí)，多種心血管系統(tǒng)疾病與細(xì)胞膜離子通道的表達(dá)豐度改變密切相關(guān)；而離子通道在細(xì)胞膜上的表達(dá)一方面取決于通道蛋白通過(guò)靶向運(yùn)輸機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜的數(shù)量，另一方面又受到膜上蛋白內(nèi)吞循環(huán)途徑的調(diào)控。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者細(xì)胞膜BKCa轉(zhuǎn)運(yùn)功能存在異常[2,8]。但目前對(duì)血管平滑肌細(xì)胞上BKCa功能的調(diào)控，尤其是通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制尚不完全清楚。故闡明BKCa在血管平滑肌功能調(diào)控中的作用具有重要意義，且對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控還有可能成為臨床心血管疾病治療的靶點(diǎn)[9～11]。

小G蛋白因其分子量只有20～40 kD而得名，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Rab蛋白超過(guò)60種。Rab在細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞器中表達(dá)，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和細(xì)胞膜，從而參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。Rab調(diào)節(jié)大部分胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)事件，在囊泡的定向運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。不同的Rab蛋白可能在不同的離子通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中作用不同；而同一Rab蛋白對(duì)不同離子通道的調(diào)控作用亦可能不同[4,12]。如離子通道CFTR從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)是一種不依賴Rab1/2，而是依賴COPⅡ的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)方式[13]；而Kv4.2/KChIP1從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)則是依賴Rab1和COPⅠ，而不依賴COPⅡ的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑[14]。Rab5作為在囊泡上表達(dá)十分豐富的小G蛋白，調(diào)控一些離子通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，包括通道蛋白經(jīng)囊泡由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜的過(guò)程以及轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上的通道蛋白內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的過(guò)程。既往研究發(fā)現(xiàn)，Rab5參與CFTR、GluT4、KCNQ1/KCNE1通道的內(nèi)吞作用；而對(duì)于Kv1.5通道的內(nèi)吞作用結(jié)果并不一致。McEwen等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Kv1.5通道內(nèi)吞與Rab5有關(guān)，通過(guò)采用表達(dá)Rab5顯性負(fù)性(DN)的質(zhì)粒，可明顯抑制通道內(nèi)吞而增加在細(xì)胞膜上的表達(dá)。但也有研究認(rèn)為，Kv1.5的內(nèi)化過(guò)程并不需要Rab5參與，而是以一種不依賴Rab5的含小窩蛋白的脂筏轉(zhuǎn)運(yùn)方式[16]。Sokolowski等[17]研究發(fā)現(xiàn)，小G蛋白R(shí)ab11b可與耳蝸細(xì)胞的BKCa共定位，使用Rab11b的siRNA可明顯減少BKCa在細(xì)胞膜上的表達(dá)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Rab11b通過(guò)晚期包涵體發(fā)揮促進(jìn)BKCa在細(xì)胞膜上表達(dá)的作用。但目前關(guān)于Rab5對(duì)BKCa蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究在BKCa的胞外S1～S2環(huán)插入了Flag標(biāo)簽，利用Flag的熒光一抗檢測(cè)BKCa蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)水平，而在BKCa的胞內(nèi)C端連接有GFP，其熒光強(qiáng)度能反映BKCa蛋白在細(xì)胞上整體的表達(dá)水平。李濤等[18]研究表明，F(xiàn)lag和GFP標(biāo)簽并不影響B(tài)KCa電流和在細(xì)胞膜上的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，與Control組比較，Rab5WT組、Rab5CA組BKCa電流明顯增加，而Rab5DN組明顯降低；與Control組比較，Rab5WT組、Rab5CA組BKCa膜蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，而Rab5DN組明顯降低；與Control組比較，Rab5WT組、Rab5CA組Flag+/GFP+明顯增加，而Rab5DN組明顯降低。這些結(jié)果均提示Rab5WT或Rab5CA促進(jìn)了BKCa蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)。

綜上所述，Rab5可促進(jìn)BKCa蛋白由細(xì)胞質(zhì)向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，從而增加BKCa蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)豐度。Rab蛋白是一個(gè)大家族，但本研究?jī)H關(guān)注了Rab5對(duì)BKCa蛋白的調(diào)控過(guò)程，其他Rab蛋白對(duì)于BKCa蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控及其對(duì)BKCa的功能調(diào)控尚需進(jìn)一步研究。

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Effect of Rab5 on large-conductance Ca2+-actived K+channels (BKca) expressed in HEK293 Cells

ZHOUDan1,LIUXueru,LITao,LIULi,TANXiaoqiu,LIUYulin

(1TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To investigate the effect of Rab5 on large-conductance Ca2+-activated K+channels (BKCachannels) expressed in HEK293 cells. Methods HEK293 cells in the logarithmic phase were randomly divided to four groups: the control group, Rab5WT group, Rab5CA group and Rab5DN group. HEK293 cells were transfected with Flag-hSlo-GFP plasmid in each group and with pcDNA3.1 for control group, Rab5WT for Rab5WT group, Rab5CA for Rab5CA group and Rab5DN for Rab5DN group, respectively. Total 4 μg plasmid with 1∶1 to each plasmid was transfected into 3.5 mm dish. Transfection rate was observed under fluorescence microscopy and the effect of Rab5 on BKCachannels was detected by patch clamp technique, Western blotting and flow cytometry when the trasfection rate was above 70%. Results Compared with the control group, Rab5 WT and Rab5 CA significantly increased BKCamacroscopic currents, while BKCacurrents were decreased in the Rab5DN group. Rab5 WT and Rab5 CA increased the expression of membranous BKCaprotein in HEK293 cells, while Rab5DN decreased the expression (allP<0.05). Rab5 WT and Rab5 CA increased the Flag+/GFP+ratio (allP<0.05), while Rab5DN decreased the ratio (P<0.05). Conclusion Rab5 significantly increases BKCacurrents and channel expression on cell surface and may promote the transport process of BKCacurrents to cell membrane in HEK293 cells.

small G protein family; large-conductance Ca2+-activated K+channels; protein transport; gene transfection

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31300948)。

周丹(1981-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槁樽韺W(xué)。E-mail： dyzhoudan@163.com

劉玉林(1968-)，男，副教授，研究方向?yàn)槁樽韺W(xué)。E-mail： anesthesia2000@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.006

R331.3+6

A

1002-266X(2017)08-0021-04

2016-09-06)