倪文麗 王寶俊 田 甜 張 繼 馬 樂 王琳琳＊ 任愛國

1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)系，北京大學(xué)生育健康研究所，衛(wèi)生部生育健康重點實驗室（100191）；

2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院

已婚夫婦中不孕不育癥患病率約為15%［1］。在不孕不育癥病因中，至少50%與男性因素有關(guān)［2］。男性不育的病因和機制十分復(fù)雜，個體差異較大，臨床上絕大多數(shù)男性不育的病因尚不清楚。長期以來，精液常規(guī)分析是評價男性生育力的主要指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)，氧化損傷造成的精子結(jié)構(gòu)和功能的改變可對精子質(zhì)量產(chǎn)生影響［3］。以往研究多探討精子DNA氧化損傷與精液參數(shù)關(guān)聯(lián)性，提示DNA氧化損傷可降低精液質(zhì)量［4－6］，但目前國內(nèi)尚未見蛋白質(zhì)氧化損傷、脂質(zhì)氧化損傷與精液參數(shù)的相關(guān)性研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象

研究對象來自于2014年12月－2015年8月期間因不育就診北京婦產(chǎn)醫(yī)院的男性。研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)：夫婦婚后同居1年以上未用避孕措施而未能使妻子受孕或生育，年齡21～49歲的成年男性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①性功能障礙（如勃起功能障礙、射精功能障礙）；②有泌尿生殖系統(tǒng)疾病史（雙側(cè)隱睪、輸精管切除）；③現(xiàn)有急性泌尿生殖系統(tǒng)感染；④有生育能力異常家族遺傳病；⑤曾經(jīng)或正在接受激素治療；⑥已明確診斷不孕不育原因為女方因素所致。篩查119例，由于部分樣本采集不全，共納入96名研究對象。由經(jīng)過培訓(xùn)的調(diào)查員采用結(jié)構(gòu)式調(diào)查表，對研究對象進行面對面詢問調(diào)查。問卷調(diào)查信息包括年齡、文化程度、身高、體重、吸煙情況、飲酒情況等。本研究已經(jīng)通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象已全部簽署知情同意書。

1.2 精液樣本的采集

受試者按照要求禁欲2～7d后，在醫(yī)院通過手淫法留取全部精液。采集后的精液樣本置于37℃水浴箱中，觀察其液化情況，待精液液化后，記錄液化時間，充分混勻后隨即對精液進行常規(guī)分析。將剩余精液進行4℃3000g離心15min后，取上清（精漿），－20℃冷凍保存。

1.3 精液常規(guī)分析

嚴(yán)格執(zhí)行WHO《人類精液和精子－宮頸黏液相互作用實驗室檢驗手冊》（第五版）操作要求，采用計算機輔助精子分析系統(tǒng)（北京偉力公司W(wǎng)LJY9000）進行精液常規(guī)分析。各指標(biāo)正常參考范圍為：精子濃度≥15×106／ml，前向運動精子率≥32%，畸形精子率＜4%。分別根據(jù)各精液指標(biāo)是否在正常范圍內(nèi)，將研究對象分為正常組和異常組，再對氧化損傷指標(biāo)進行分析。

1.4 蛋白質(zhì)及脂質(zhì)氧化損傷指標(biāo)的檢測

蛋白質(zhì)氧化損傷程度以羰基衍生物（PC）水平表示，脂質(zhì)氧化損傷程度以8－異前列腺素F2α（8－iso－PGF2α）水平表示。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測精漿中 PC水平、8－iso－PGF2α水平。ELISA試劑盒來自于Cell Biolabs公司，試劑盒貨號分別為STA－310、STA－337。所有檢測方法均嚴(yán)格按試劑盒說明進行操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 20.0軟件，計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用t檢驗進行各組PC水平、8－iso－PGF2α水平比較。計數(shù)資料以%表示，使用χ2檢驗或Fisher檢驗進行各組一般人口學(xué)特征比較。使用Pearson檢驗分析PC、8－iso－PGF2α與各精液參數(shù)的相關(guān)性。使用多重線性回歸控制年齡、文化程度、BMI、吸煙、飲酒等混雜因素后，分析8－iso－PGF2α對精子濃度影響，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般特征

96名研究對象年齡為（31.2±5.1）歲，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（26.4±5.0）kg／m2。各精液指標(biāo)正常組和異常組的人口學(xué)特征無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

2.2 各組蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化損傷指標(biāo)比較

異常組8－iso－PGF2α水平高于正常組（P＜0.05），其它各指標(biāo)比較兩組無差異（P＞0.05）。見表2。

表1 各精液指標(biāo)正常組和異常組人口學(xué)特征比較［例（%）］

表2 兩組氧化損傷指標(biāo)檢測比較（珚x±s）

2.3 蛋白質(zhì)、脂質(zhì)氧化指標(biāo)與精液參數(shù)相關(guān)性分析

使用Pearson相關(guān)分析，在控制了年齡、BMI、文化程度、吸煙、飲酒等因素后，8－iso－PGF2α水平與精子濃度負相關(guān)（r＝－0.254，P＝0.018），與前向運動精子率及畸形精子率無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)；PC水平與各精液參數(shù)無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。見表3。

2.4 8－iso－PGF2α水平和精子濃度多重線性回歸分析

對以上相關(guān)分析中P＜0.05的變量進一步行多重線性回歸分析。以精子濃度為因變量，以8－iso－PGF2α水平、年齡、文化程度、BMI、吸煙及飲酒為自變量，進行多重線性回歸分析。變量篩選方法為Enter法。在調(diào)整了年齡、BMI、文化程度、吸煙、飲酒后結(jié)果顯示，8－iso－PGF2α水平每增加1ng／ml，精子濃度平均減少7×104個／ml（P＜0.05）。

表3 精液參數(shù)與氧化損傷指標(biāo)相關(guān)性分析

3 討論

本研究在96例研究對象中探討了蛋白質(zhì)氧化損傷、脂質(zhì)氧化損傷與精液參數(shù)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)精子濃度的降低可能與脂質(zhì)氧化損傷有關(guān)。提示對少精子癥及無精子癥患者進行脂質(zhì)氧化損傷檢測可能有助于發(fā)現(xiàn)其致病原因。

本研究發(fā)現(xiàn)8－iso－PGF2α在精子濃度異常組的水平高于正常組，隨著8－iso－PGF2α水平的增加，精子濃度降低，結(jié)果與以往文獻報道類似，Khosrow－beygi等［7］在來自伊朗的46例精液參數(shù)異常者和16例健康者中，發(fā)現(xiàn)精液參數(shù)異常者8－iso－PGF2α水平高于健康者，8－iso－PGF2α水平與精子濃度、總運動精子率負相關(guān)。本研究與上述研究結(jié)果類似，相關(guān)系數(shù)都不高，可能由于樣本量少或一些混雜因素的影響。本研究在96例研究對象中未發(fā)現(xiàn)8－iso－PGF2α與前向運動精子率及畸形精子率有相關(guān)性，文獻檢索未發(fā)現(xiàn)此類研究報道，而多以丙二醛作為脂質(zhì)氧化損傷指標(biāo)的研究，如Singh等［8］研究來自印度的48例精液參數(shù)正常不育者和100例精液參數(shù)異常不育者中，發(fā)現(xiàn)精液參數(shù)異常組丙二醛水平高于正常組，精漿中丙二醛水平與精子濃度、前向運動精子率、精子正常形態(tài)率呈負相關(guān)。Ni等［9］研究來自中國的88例精索靜脈曲張不育者和25例健康者中，發(fā)現(xiàn)丙二醛與精子濃度、總運動精子率、前向運動精子率負相關(guān)，但與畸形精子率無相關(guān)性。8－iso－PGF2α是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的特異性產(chǎn)物，不受飲食中脂質(zhì)含量影響，具有很強的生物學(xué)活性，目前被認(rèn)為是反映脂質(zhì)過氧化損傷的最好指標(biāo)［10］。

本研究未發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)氧化損傷與精子濃度、前向運動精子率、畸形精子率的相關(guān)性。目前尚未發(fā)現(xiàn)文獻中相關(guān)報道。后續(xù)研究中需擴大樣本量進一步驗證蛋白質(zhì)氧化損傷與精液參數(shù)的相關(guān)性。

PC、8－iso－PGF2α目前是評價蛋白質(zhì)氧化損傷、脂質(zhì)氧化損傷使用最多的指標(biāo)［10－11］。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白質(zhì)硫醇基過氧化，會使精子的功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使精子更容易受到損傷。蛋白質(zhì)氧化損傷還影響蛋白的磷酸化、糖基化及ATP的生成，從而關(guān)聯(lián)到精子的授精能力［3，12］。精子膜中含有大量的不飽和脂肪酸，極易發(fā)生脂質(zhì)氧化損傷，造成精子膜的流動性、通透性和液態(tài)性發(fā)生改變，引起精子的完整性、運動性和功能等發(fā)生不可逆的損傷［3，12］，進而可能導(dǎo)致精子濃度的降低。

現(xiàn)階段評估男性生育能力的手段主要是傳統(tǒng)的精液常規(guī)分析。但常規(guī)精液參數(shù)分析只是從形態(tài)和數(shù)量方面進行分析，而對精子功能和受精能力方面提供的信息有限，不能對男性不育的原因提供精確的診斷［4］。Agarwal等［13］研究建議對于不明原因的不育癥患者可進行活性氧的檢測，對男性生育力進行一定程度的評價。本研究發(fā)現(xiàn)8－iso－PGF2α在精子濃度異常組的水平高于正常組，提示對于少精子癥及無精子癥患者，進行脂質(zhì)氧化損傷檢測可能有助于發(fā)現(xiàn)其致病因素，為臨床診斷和開展新的治療策略提供幫助。

本研究初步探討了脂質(zhì)氧化損傷、蛋白質(zhì)氧化損傷與精液參數(shù)的關(guān)系，提示脂質(zhì)氧化損傷可能與精子濃度降低有關(guān)。后續(xù)研究應(yīng)擴大樣本量，進一步驗證生物大分子氧化損傷對男性生育力的影響，并進行機制的深入探討。

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