趙紅領(lǐng)， 李 磊， 苗 成， 楊 慧， 常文廣

丹參酮ⅡA對(duì)腦出血大鼠腦組織HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響

趙紅領(lǐng)， 李 磊， 苗 成， 楊 慧， 常文廣

目的 探討丹參酮ⅡA對(duì)腦出血大鼠的干預(yù)作用以及對(duì)HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響。方法 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦出血組、丹參酮ⅡA干預(yù)I組和II組，除假手術(shù)組外，其余大鼠均通過(guò)注射膠原酶的方法建立腦出血模型，丹參酮IIA干預(yù)Ⅰ組和Ⅱ組分別腹腔注射丹參酮IIA30 mg/kg，每天一次和30 mg/kg，每天兩次，共給藥15 d。給藥完成后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，稱(chēng)重法計(jì)算腦組織的含水量，免疫組化法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腦組織中HIF-1α和VEGF的蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)。結(jié)果 與腦出血組相比，丹參酮IIA干預(yù)組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高，腦組織含水量顯著下降，腦組織中HIF-1α和VEGF的蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)顯著升高。結(jié)論 丹參酮IIA對(duì)腦出血大鼠腦組織具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與HIF-1α和VEGF因子的表達(dá)有關(guān)。

腦出血； 丹參酮IIA； HIF-1α； VEGF

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)疾病，臨床上常見(jiàn)，占腦卒中的比例約為20%～40%，發(fā)病率和致殘率較高，我國(guó)腦出血的發(fā)病率約為17.1%～55.4%[1]。隨著人口結(jié)構(gòu)的老齡化加劇以及飲食結(jié)構(gòu)的變化，腦出血的發(fā)病率逐漸上升，發(fā)病后約有75%的患者致殘，治療期與恢復(fù)期的高額費(fèi)用對(duì)患者家庭是一種沉重的負(fù)擔(dān)。

丹參在國(guó)內(nèi)廣泛用于治療心腦血管疾病，丹參酮IIA(Tanshinone ⅡA)是丹參的主要活性單體，具有抗氧化、清除自由基、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種藥理活性[2,3]。多項(xiàng)研究表明丹參酮IIA對(duì)腦缺血再灌注損傷中，通過(guò)抑制線粒體裂解，調(diào)節(jié)bcl-2/bax的表達(dá)，增加谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性，清除自由基，抑制細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用[4,5]。此外，30 mg/kg丹參酮ⅡA能夠減少腦梗死大鼠的腦梗死體積，具有很好的腦保護(hù)作用[6]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)注射膠原酶的方法建立腦出血大鼠模型，觀察丹參酮ⅡA對(duì)腦出血大鼠腦組織的保護(hù)作用，并討論可能的初步機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，SPF級(jí)，8～12周齡，體重200～240 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(京)2012-0012；飼養(yǎng)條件：22 ℃～26 ℃，濕度50%～60%，分籠，標(biāo)準(zhǔn)飼料和純凈水喂養(yǎng)，進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 丹參酮IIA購(gòu)自上海芃碩生物科技有限公司(丹參酮ⅡA混懸于1%的二甲基亞砜的PBS平衡鹽溶液制成混懸液)；膠原酶購(gòu)自Sigma公司；HIF-1α和VEGF抗體購(gòu)自Abcam公司；HIF-1α、VEGF和GADPH引物由上海英駿生物工程公司提供；其他試劑為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與腦出血大鼠模型的建立 將40只大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(Sham)、腦出血組(ICH)、丹參酮IIA干預(yù)I組(Tan-Ⅰ)和II組(Tan-Ⅱ)；除假手術(shù)組外，其余各組小鼠參考Rosenberg等[7]方法，建模前12 h禁食禁水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，俯臥固定大鼠，沿頭顱正中切開(kāi)皮膚，暴露前囪，于右側(cè)尾殼核體表前囪垂直3 mm后，側(cè)開(kāi)1 mm處，用顱骨鉆開(kāi)此處，用微量進(jìn)樣器將2 μl膠原酶勻速注入，進(jìn)針深度為5.5 mm，留針5 min，取出微量進(jìn)樣器，縫合切口，術(shù)后腹腔注射青霉素80萬(wàn)單位預(yù)防感染。模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)：建模后可見(jiàn)明顯肢體癱瘓，沿針孔冠狀切面可見(jiàn)腦組織中有血腫形成。建模后，丹參酮IIA干預(yù)Ⅰ組大鼠腹腔注射30 mg/kg，每天一次；Ⅱ組大鼠腹腔注射30 mg/kg，每天兩次，共給藥15 d。

1.4 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 各組大鼠于造模成功后3 d、6 d、9 d、12 d和15 d，依據(jù)Garcia等[8]方法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，分值范圍3～18分，分值越低，神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：自發(fā)活動(dòng)(0～3分);四肢對(duì)稱(chēng)運(yùn)動(dòng)(0～3分);前肢對(duì)稱(chēng)外展(0～3分);爬鐵籠壁(1～3分);軀干對(duì)鈍棒觸及的反應(yīng)(1～3分);觸須對(duì)鈍棒觸及的反應(yīng)(1～3分)。

1.5 標(biāo)本采集 在給藥完成后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，迅速斷頭，打開(kāi)頭顱，取出腦部，分離出血腫組織。

1.6 腦組織含水量 深度麻醉大鼠，斷頭取腦，沿中線切開(kāi)，精密稱(chēng)量濕重(wwt)，放置于80 ℃烘箱烘烤48 h，直至恒重，稱(chēng)量干重(dw)，計(jì)算腦組織含水量(%)=(wwt-dw)/wwt×100%。

1.7 免疫組化法檢測(cè)HIF-1α和VEGF蛋白含量 將腦組織制作成石蠟切片，二甲苯脫蠟，依次浸入梯度酒精(100%、95%、85%、75%)各5 min，加入0.01 mol枸櫞酸鹽緩沖液，微波修復(fù)20 min，PBS洗滌，加入封閉液室溫孵育10 min，PBS洗滌，加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，隨后加入對(duì)應(yīng)二抗，37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，再次用梯度酒精脫水(75%、85%、95%、100%)，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將腦血腫組織勻漿后加入1 ml Trizol，室溫放置5 min，12000 rpm 4 ℃離心15 min，提取總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA，以cDNA為模板在聚合酶催化下進(jìn)行PCR反應(yīng)， HIF-1α引物：上游5’-GTCGGACAGCCTCACCAAACAGAGC-3’，下游5’-GTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAG-3’；VEGF引物：上游5’-CAGCCCCAGCTACCACCTC -3’，下游5’-TCTTCCTCCTCCCCCTCCTC-3’;GADPH引物：上游5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，下游5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’；93 ℃ 42 s， 60 ℃ 40 s，73 ℃ 55 s，共32個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果在熒光定量操作系統(tǒng)中進(jìn)行分析對(duì)比，目標(biāo)基因的相對(duì)定量用2-△△CT計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 進(jìn)行腦出血造模后，大鼠出現(xiàn)了神經(jīng)功能缺損的癥狀，腦出血組大鼠在6 d時(shí)達(dá)到峰值，丹參酮ⅡA干預(yù)組在相同時(shí)間的神經(jīng)功能缺損癥狀輕于腦出血組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

2.2 腦組織含水量的測(cè)定 腦出血組大鼠同側(cè)腦組織的含水量(83.35%±0.72%)顯著高于假手術(shù)組(72.23%±0.64%);丹參酮ⅡA干預(yù)組Ⅰ組(79.18%±0.62%)和Ⅱ組(75.58%±0.43%)的腦組織含水量均顯著低于腦出血組(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)的變化 腦出血組大鼠腦組織的HIF-1α和VEGF的免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于假手術(shù)組(P<0.05);丹參酮ⅡA干預(yù)組的HIF-1α和VEGF的免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于腦出血組(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)水平的變化 腦出血組大鼠腦血腫組織的HIF-1α和VEGF的mRNA表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.05);丹參酮ⅡA干預(yù)組的HIF-1α和VEGF的mRNA表達(dá)水平顯著高于腦出血組(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分(±s)

與假手術(shù)組組對(duì)比*P<0.05；與ICH組相比#P<0.05

3 討 論

腦出血是常見(jiàn)的非外傷性致死性疾病，目前仍缺乏有效可靠的治療方法。腦出血后導(dǎo)致急性腦水腫以及血腫周?chē)X組織缺血缺氧，繼發(fā)造成神經(jīng)組織損傷。主要是由于血腫周?chē)M織血流量減少、乳酸堆積、血腫活性物質(zhì)釋放等引起血腫周?chē)X組織缺血缺氧、神經(jīng)元凋亡，從而出現(xiàn)神經(jīng)組織損傷。腦出血后腦含水量的增加，推測(cè)是由于腦細(xì)胞內(nèi)鈉鉀泵功能的失調(diào)，從而引起腦組織出現(xiàn)水分的異常增加。丹參酮ⅡA能夠降低腦出血后腦含水量，可能與其抑制炎性細(xì)胞和炎性因子的滲入，而產(chǎn)生的毒性作用，形成細(xì)胞毒性水腫。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α，Hypoxia inducible factor-1α)是連接在促紅細(xì)胞生成素基因的低氧反應(yīng)的一種核轉(zhuǎn)錄因子[9，10]，在正常狀態(tài)下組織幾乎不表達(dá)，但在低氧狀態(tài)下，HIF-1α的表達(dá)增高，并隨缺氧程度與缺氧時(shí)間相關(guān)[11]。國(guó)內(nèi)報(bào)道指出HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)率隨腦出血時(shí)間延長(zhǎng)而增加[12]，研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)生成的HIF-1α具有保護(hù)腦組織損害的作用[13]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦出血大鼠腦組織中HIF-1α顯著增加，使用丹參酮ⅡA干預(yù)后，血腫周?chē)X組織中HIF-1α的表達(dá)明顯高于腦出血組，提示HIF-1α表達(dá)的上調(diào)對(duì)腦出血后腦組織的損傷具有保護(hù)作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是HIF-1α的目的基因，作為血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂原，能夠特異性誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，修復(fù)血管內(nèi)膜，維持內(nèi)膜完整性。在血管形成之前，VEGF對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有直接的保護(hù)作用[14]。報(bào)道指出，VEGF具有一定的促神經(jīng)再生作用，在腦缺血灶周腦組織中VEGF的表達(dá)顯著上升，微血管密度顯著增加，有效改善缺血半暗帶的血塊[15,16]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用丹參酮ⅡA干預(yù)后，血腫周?chē)X組織的VEGF表達(dá)顯著高于腦出血組，推測(cè)丹參酮ⅡA通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進(jìn)血管新生，提高微血管的抗損能力，從而發(fā)揮保護(hù)腦出血損傷的腦組織。

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Effects of Tanshinone ⅡA on HIF-1α and VEGF expression in brain tissue of intracerebral hemorrhage rats

ZHAOHongling,LILei,MIAOCheng,etal.

(DepartmentofNeurology,XinxiangCentralHospital,Xinxiang453000,China)

Objective To investigate the improvement of Tanshinone ⅡA on intracerebral hemorrhage (ICH) the effects on HIF-1α and VEGF expression.Methods Rats were randomly divided into 4 groups:sham,ICH,ICH treated with Tanshinone ⅡA once a day and ICH treated with Tanshinone IIA twice a day.In addition to sham rats,the rats were injected with collagenase to established ICH model,and then were injected with 30 mg/kg of Tanshinone ⅡA intraperitoneally once or twice a day.At the end of 15-day experimental period,rats neural function of each group was scored and the water content in brain were calculated accordingly.The expression of HIF-1α and VEGF were determined by western blot and quantitative PCR,respectively.Results Compared with ICH group,the neural function was significantly improved and the water content in brain was decreased after Tanshinone ⅡA administration.Moreover,Tanshinone IIA treatment resulted in a markedly increase of HIF-1α and VEGF expression when compared with ICH rats.Conclusion Tanshinone ⅡA treatment can improve the neural function in brain tissue of ICH rats,which may be related with the regulation of HIF-1α and VEGF expression.

Intracerebral hemorrhage; Tanshinone ⅡA; HIF-1α; VEGF

1003-2754(2017)02-0130-03

2016-10-26；

2016-11-29

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

趙紅領(lǐng)，E-mail:honglingzhao69@163.com

R743.34

A