邱素華

消化道的運(yùn)動(dòng)依賴消化道平滑肌的收縮, Ca2+是觸發(fā)平滑肌肌絲滑行的關(guān)鍵因素, 細(xì)胞內(nèi)Ca2+在興奮收縮耦聯(lián)中起重要作用, Ca2+濃度改變會(huì)導(dǎo)致一系列病理生理過程［1-5］。膜片鉗技術(shù)可觀察結(jié)腸平滑肌細(xì)胞膜Ca2+電流特征, 為研究及治療相關(guān)疾病提供新的思路［6-10］。膜片鉗技術(shù)需要高產(chǎn)量和高質(zhì)量的細(xì)胞, 傳統(tǒng)的機(jī)械分離法對(duì)平滑肌細(xì)胞的損傷較大, 細(xì)胞存活率低, 存活時(shí)間短, 難以滿足電生理實(shí)驗(yàn)需求,因此建立分離結(jié)腸平滑肌細(xì)胞的方法成為必然。本研究通過查閱國(guó)內(nèi)外現(xiàn)行的平滑肌細(xì)胞的分離方法并加以改進(jìn)［11-15］,建立了適合電生理研究的結(jié)腸平滑肌細(xì)胞分離方法, 該方法操作簡(jiǎn)便, 重現(xiàn)性好。

1 材料與方法

1.1 試劑及溶液 試劑: 膠原酶Ⅱ、大豆胰蛋白酶抑制劑、HEPES及EGTA購(gòu)于Sigma 公司, 其他試劑均為市售產(chǎn)品。無鈣臺(tái)氏液(mmol/L): 氯化鈉(NaCl)137, 氯化鉀(KCl)5.4, 六水合氯化鎂(MgCl2·6H2O)1, 磷酸二氫鈉(NaH2PO4)0.33, 葡萄糖10, 羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)10, 氫氧化鈉(NaOH) 調(diào)pH至7.40。消化液：含0.1%膠元酶Ⅱ和0.01%大豆胰蛋白酶抑制劑的無鈣臺(tái)氏液。KB液(mmol/L) : KCl 40, KH2PO420, MgCl2·6H2O 3, L-谷氨酸 50, ?；撬?20, HEPES 10, 氫氧化鉀(KOH) 80, 葡萄糖10, 乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)0.5, KOH調(diào)pH至7.40。Ca2+電極內(nèi)液(mmol/L):氯化銫(CsCl)120, 二水氯化鈣 (CaCl2·2H2O)1, MgCl2·6H2O 5, 5 5-三磷酸腺苷二鈉(ATP-Na2), EGTA 11, HEPES 10, 葡萄糖11,KOH調(diào)pH至7.20。Ca2+細(xì)胞外液(mmol/L): NaCl 120, CsCl 5, CaCl2·2H2O 1, MgCl2·6H2O 1, 氯化四乙胺 (TEA-Cl)20,Glucose 5.5, HEPES 10, NaOH調(diào)pH至7.35。溶液使用前均需氧飽和。

1.2 方法

1.2.1 單個(gè)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞的分離 參照Bitar法加以改進(jìn), Wistar大鼠, 180～220 g, 雌雄不限, 實(shí)驗(yàn)前禁食24 h, 自由飲水。頸椎脫臼處死, 剖開腹腔, 快速自肛門上2 cm取結(jié)腸約10 cm, 并放置在4℃無鈣臺(tái)氏液中, 沖洗結(jié)腸內(nèi)殘余糞便。將沖洗干凈的腸段移入含無鈣臺(tái)氏液的塑料培養(yǎng)板中,體視顯微鏡下采用機(jī)械法小心的刮除黏膜層、黏膜下層及漿膜層, 將較純的平滑肌組織層剪成1～2 mm3的碎塊, 加入到消化液中, 37℃恒溫水浴震蕩20 min, 200 g/min 離心5 min,棄消化液。再加入10 ml消化液, 37℃恒溫水浴震蕩20 min,加2倍無鈣臺(tái)氏液中止消化, 用玻璃吸管柔和吹打3 min, 使細(xì)胞自由脫落, 尼龍網(wǎng)過篩(孔徑500 μm), 離心, 棄上清, 加適量KB液懸浮細(xì)胞, 4℃冰箱儲(chǔ)存待用, 電生理實(shí)驗(yàn)一般在8 h內(nèi)使用。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 單個(gè)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞在KB 液中保存1 h后, 離心, 采用梯度復(fù)鈣法, 使細(xì)胞外Ca2+終濃度恢復(fù)至1 mmol/L后, 取一滴細(xì)胞懸液置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 細(xì)胞活性檢測(cè) 0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液與細(xì)胞懸液1∶1混合, 室溫放置3～5 min, 取20 μl細(xì)胞懸液置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上, 高倍鏡下觀察細(xì)胞存活狀況。死細(xì)胞染成淡藍(lán)色, 而活細(xì)胞不染色并保持正常形態(tài)。

1.2.4 細(xì)胞鈣電流記錄 細(xì)胞池中預(yù)先沖入鈣電流細(xì)胞外液, 取已復(fù)鈣的細(xì)胞懸液加入細(xì)胞池中, 靜止10 min使細(xì)胞貼壁。將充灌電極內(nèi)液的玻璃微電極與細(xì)胞膜接觸, 給予輕微負(fù)壓開始封接, 當(dāng)封接電阻大于1 GΩ后即形成高阻封接,破膜, 形成全細(xì)胞模式, 采用Axopatch 200B 放大器(AXON公司)記錄細(xì)胞膜鈣電流。電極尖端電阻以 2～6 MΩ為宜。

1.2.5 鈣電流數(shù)據(jù)采用Clampfit10軟件進(jìn)行分析, 并通過Sigmaplot軟件進(jìn)行作圖及曲線擬合。

2 結(jié)果

2.1 單個(gè)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞的分離及質(zhì)量測(cè)定 光鏡下觀察,細(xì)胞呈梭形, 橫紋清晰, 遮光性較強(qiáng), 長(zhǎng)度各異, 有的舒張,有的收縮, 細(xì)胞成活率90%左右(圖1a), 細(xì)胞外Ca2+濃度恢復(fù)至1 mmol/L后, 細(xì)胞仍能保持長(zhǎng)梭形, 細(xì)胞邊緣清晰, 有光澤(圖1b)。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色, 80% 以上的長(zhǎng)梭狀平滑肌細(xì)胞不染色并保持正常形態(tài), 提示細(xì)胞成活率達(dá)80%。

圖1 a 分離的大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞

圖1 b 復(fù)鈣后的大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞

2.2 細(xì)胞鈣電流記錄

2.2.1 -80 mV鉗制電壓鉗制細(xì)胞, 給予10 ms的快速刺激,使快鈉通道失活, 再給予-40 mV的鉗制電壓, 從-40 mV開始, 以10 mV的階躍刺激連續(xù)去極化至+50 mV, 持續(xù)500 ms,刺激頻率0.5 Hz, 記錄細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)激活電流(圖2a)。

2.2.2 ICa-L電流-電壓(I-V)曲線：大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞最大激活電壓為-10 mV, 反轉(zhuǎn)電位為33 mV(圖2b)

2.2.3 采用雙脈沖刺激, 保持電壓-80 mV, 先給予條件脈沖從-90 mV, 每隔10 mV連續(xù)去極化至0 mV, 持續(xù)300 ms, 然后至-40 mV, 間期1 ms, 再跟一固定的去極化至0 mV, 持續(xù)140 ms的測(cè)試脈沖。記錄細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失活曲線(圖2c)。

2.2.4 采用雙脈沖刺激, 保持電壓-40 mV, 先給予去極化至0 mV, 持續(xù)260 ms的條件脈沖, 再給一同樣的刺激脈沖, 兩脈沖的間隔時(shí)間從0～1 s逐漸增加, 每次75 ms。記錄細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失活曲線(圖2d)。

圖2 a 大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞L-型鈣穩(wěn)態(tài)激活電流

圖2 c 大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞L-型鈣穩(wěn)態(tài)失活曲線

圖2 b ICa-L電 流-電壓(I-V)曲線

圖2 d 大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞L-型鈣穩(wěn)態(tài)失活后恢復(fù)曲線

3 討論

Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使, 幾乎存在于所有的可興奮細(xì)胞中, 它參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種生命活動(dòng)過程, 如：神經(jīng)傳導(dǎo)、肌肉收縮等［16-20］。Ca2+在平滑肌的收縮反應(yīng)中起核心作用, 胞漿內(nèi)Ca2+濃度的變化是啟動(dòng)平滑肌興奮-收縮耦聯(lián)的核心, 因此觀察結(jié)腸平滑肌細(xì)胞膜鈣電流的變化, 將為治療相關(guān)疾病的研究提供新的思路［21-25］。本研究在成功分離大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞的基礎(chǔ)上, 采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄細(xì)胞膜鈣電流并觀察了其激活、失活及失活后恢復(fù)曲線, 記錄的鈣電流電生理特征表明該方法得到的結(jié)腸平滑肌細(xì)胞具有完整的電生理活性。

新鮮分離的大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞更接近機(jī)體的自然狀態(tài), 且能排除機(jī)體體液及神經(jīng)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響, 本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活性和電生理功能特性三個(gè)方面, 鑒定了新鮮分離的大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞質(zhì)量, 該方法操作簡(jiǎn)便, 重現(xiàn)性好。

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