易燕 劉芳 柴艷婷 紀(jì)宏先 李珍

·調(diào)查研究·

十堰市苯丙酮尿癥兒童苯丙氨酸羥化酶基因突變檢測(cè)研究

易燕 劉芳 柴艷婷 紀(jì)宏先 李珍

目的 分析十堰市苯丙酮尿癥(PKU)患兒苯丙氨酸羥化酶(PAH)基因的突變特點(diǎn)，以指導(dǎo)產(chǎn)前診斷。方法 納入2012年1月至2015年12月十堰市確診的PKU患兒15例為研究對(duì)象，應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法，檢測(cè)患兒PAH基因全部外顯子及其啟動(dòng)子區(qū)域序列。結(jié)果 30個(gè)PAH等位基因中，突變基因出現(xiàn)19個(gè)，占63.3%，類型共10種。突變類型主要為R243Q、R241C、Y365X、R111X，其余均為散在發(fā)生突變，對(duì)比國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)及PAH相關(guān)國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)，未見(jiàn)新的基因突變類型。結(jié)論 十堰市PAH基因突變具有多樣性和復(fù)雜性，R243Q、R241C、Y365X、R111X為其主要突變位點(diǎn)。

苯丙酮尿癥；兒科；苯丙氨酸羥化酶；基因突變

苯丙酮尿癥(PKU)為常染色體隱性遺傳病，由苯丙氨酸羥化酶(PAH)基因突變，導(dǎo)致PAH活性降低或喪失，使苯丙氨酸在體內(nèi)大量積蓄所致[1]，該疾病可影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，導(dǎo)致嚴(yán)重的智力低下及神經(jīng)行為異常[2,3]。早期診斷、及時(shí)治療是降低疾病影響的重要措施[4,5]，因此明確患兒PKU基因的突變特點(diǎn)，提升基因診斷效果有重要意義。該疾病的發(fā)病有顯著的種族及地域差異[6]，本研究重點(diǎn)探討了十堰市患兒PAH基因突變特點(diǎn)，旨在提升該疾病的早期診斷、遺傳咨詢和孕前干預(yù)效果，報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 納入對(duì)象共15例，均為2012年1月至2015年12月十堰市新生兒疾病篩查中心篩查確診或門診就診后確診的經(jīng)典型PKU患兒，患兒監(jiān)護(hù)人均對(duì)本研究知情同意?；純耗挲g20 d～5歲,平均(2.2±0.7)歲，戶口在我市且至研究結(jié)束時(shí)未變動(dòng)，初診時(shí)血清苯丙氨酸濃度274～2 710 μmol/L、平均(1 857.6±582.4)μmol/L，患兒均經(jīng)尿喋吟分析排除四氫生物喋吟缺乏癥。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器:全血基因組DNA提取試劑盒、2×RCR Master Mix、DNA純化試劑盒，均購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司；Chelex-100，購(gòu)自Biorad；引物合成，由上海生工生物技術(shù)有限公司提供；PCR擴(kuò)增儀、基因測(cè)序儀，購(gòu)自ABI。

1.2.2 DNA提取:采用全血基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行：①將經(jīng)EDTA抗凝處理的200 μl全血置入1.5 ml 離心管，加入20 μl蛋白酶K，混勻后加入200 μl 緩沖液GB，顛倒混勻并放置10 min，使溶液變清涼，隨后加入200 μl無(wú)水乙醇，顛倒混勻；②所得混合液置入吸附柱CB3，以12 000 r/min速度離心30 s，棄廢液，吸附柱CB3中加入500 μl緩沖液GD，同條件離心30 s，棄廢液；③吸附柱CB3中加入600 μl漂洗液PW，同條件離心30 s，棄廢液，重復(fù)1次；④吸附柱CB3再次同條件離心2 min，棄廢液后室溫放置，晾干殘留漂洗液；⑤吸附柱CB3轉(zhuǎn)入新的離心管，向吸附膜中間加入50～200 μl洗脫緩沖液TB，室溫放置2～5 min，以12 000 r/min速度離心2 min，將溶液收集到離心管中。

1.2.3 引物設(shè)計(jì):應(yīng)用Primer5設(shè)計(jì)13對(duì)引物，分別用于擴(kuò)增PAH基因1-13外顯子及側(cè)翼序列，引物區(qū)域、序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序:在ABI 9700型擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體積20 μl，包括1.5 U Taq DNA聚合酶，引物濃度2 pmol/L，dNTP 2.5 mmol/L。先設(shè)定95℃預(yù)熱，持續(xù)15 min；94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸45 s，此加熱方案共持續(xù)20個(gè)循環(huán)，且每個(gè)循環(huán)退火溫度下降0.2℃；第20個(gè)循環(huán)結(jié)束后，以94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，此加熱方案共持續(xù)15個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸，持續(xù)5 min。產(chǎn)物接受2%瓊脂糖凝膠電泳、后續(xù)測(cè)序反應(yīng)。產(chǎn)物直接測(cè)序，樣品純化及分析均由中國(guó)優(yōu)生優(yōu)育基因科學(xué)專家指導(dǎo)中心完成。

表1 PAH基因全長(zhǎng)外顯子擴(kuò)增引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

2 結(jié)果

2.1 患者PAH基因測(cè)序結(jié)果 15例納入患兒中，6例檢出2個(gè)突變基因位點(diǎn)，包括1例純合突變，7例檢測(cè)1個(gè)突變基因位點(diǎn)，2例未檢測(cè)出基因突變位點(diǎn)。見(jiàn)表2。

2.2 PAH基因突變類型及分布頻率 在本研究所檢測(cè)的30個(gè)等位基因中，共發(fā)現(xiàn)19個(gè)突變基因，檢出率63.3%。此19個(gè)突變基因共包括10種突變類型，其中錯(cuò)義突變5種、無(wú)義突變3種、缺失突變1種、剪切位點(diǎn)突變1種。R241C、Y356X突變頻率最高，均為13.3%，其次為R243Q，為10.0%，再次為R111X，為6.7%，且為純合突變，其余均為散在發(fā)生。經(jīng)科技查新、查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)、查詢PAH專業(yè)網(wǎng)站及數(shù)據(jù)庫(kù)，證實(shí)未見(jiàn)新的PAH基因突變類型。見(jiàn)表3。

3 討論

PKU是少數(shù)可治的遺傳代謝性疾病之一[7-9]，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療能夠有效改善患兒預(yù)后，使患兒智能及神經(jīng)功能發(fā)育接近正常人。該疾病形成的分子基礎(chǔ)是PAH基因突變，導(dǎo)致的PAH結(jié)構(gòu)及活性變化。報(bào)道指出，PAH基因的突變點(diǎn)多位于編碼區(qū)，只引發(fā)一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變，突變對(duì)酶活性的影響程度有差異，主要取決于突變的類型和位點(diǎn)[10]。受基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展影響，PKU的診治效果顯著提升，早期檢測(cè)PAH基因突變能夠?qū)υ缙谠\治、遺傳咨詢及孕前干預(yù)均有積極作用，研究證實(shí)PAH基因突變存在明顯的種族和地域分布差異[11-13]，國(guó)內(nèi)報(bào)道的突變種類有100余種，且還在不斷上升，但有關(guān)十堰市的PAH突變基因卻少有研究報(bào)道，這不利于本地區(qū)PKU的控制，本研究則有助于彌補(bǔ)此方面空白。

表2 患兒PAH基因測(cè)序結(jié)果

表3 患兒PAH基因突變及構(gòu)成

本研究報(bào)道的15例PKU患兒中，共檢測(cè)出10種、19個(gè)基因突變類型，主要表現(xiàn)為R243Q、R241C、Y365X、R111X突變，提示十堰市開展PKU產(chǎn)前基因診斷或進(jìn)行相關(guān)基因突變研究時(shí)，需要重點(diǎn)關(guān)注上述突變，這與國(guó)內(nèi)其他報(bào)道既有相似性也有差異性。如強(qiáng)榮等[14,15]報(bào)道陜西地區(qū)PAH基因突變類型中，R243Q為特點(diǎn)突變，但其突變檢出率89.10%，高于本研究；朱文斌等[16,17]報(bào)道福建地區(qū)主要PAH基因突變型也包括R241C，但其他還包括R408C、EX6-96A>G，這與本研究結(jié)果不同。本研究患兒致病基因突變廣泛存在于PAH基因的第3、7外顯子上，而既往報(bào)道顯示日本人主要集中在第6、7、12外顯子，歐洲人更多集中于第3、10、12外顯子[18-20]，這表明十堰市PAH基因突變存在高度異質(zhì)性；對(duì)比國(guó)內(nèi)部分研究，可見(jiàn)十堰市PAH基因突變涉及的外顯子與寧夏、蘇州地區(qū)存在一定差異性，表明國(guó)內(nèi)不同地區(qū)PKU患兒PAH基因突變分布也存在明顯差異。但本研究并未發(fā)現(xiàn)與國(guó)際國(guó)內(nèi)既往報(bào)道不同的新型PKU基因突變類型，這提示十堰市PAH基因突變又與其他地區(qū)存在一定相似性。

基因突變檢出率的差異除受到檢測(cè)方案的影響外，可能還提示本地部分患兒突變基因可能出現(xiàn)于PAH基因的13個(gè)外顯子之外區(qū)域；或其致病機(jī)制并非PAH基因突變，而可能涉及到基因表達(dá)的順式作用元件、反式作用因子、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等因素。

綜上所述，十堰市PKU兒童PAH基因突變存在一定地域特征，具備一定的多樣性與復(fù)雜性，目前所知的主要突變種類為R243Q、R241C、Y365X、R111X，掌握其特征對(duì)PKU的早期診治、遺傳咨詢及孕期檢查有一定作用。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.02.042

442000 湖北省十堰市婦幼保健院

劉芳，442000 湖北省十堰市婦幼保健院；

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A

1002-7386(2017)02-0300-03

2016-06-09)