康強(qiáng)，鄒浩，劉立鑫，王連敏，石萬紅，張小文

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 肝膽外科，云南 昆明 650106）

肝內(nèi)膽管癌是肝臟常見的惡性腫瘤之一，起源于肝內(nèi)細(xì)小膽管至肝管匯合處的膽管上皮細(xì)胞[1-2]，約占原發(fā)性肝癌的10%[3]，在過去20年間該病發(fā)病率和病死率在全球范圍均呈現(xiàn)上升趨勢，其病死率在美國印第安和阿拉斯加（0.13%）和亞洲泰國人群（0.14%）中最高，在歐洲人群（0.08%）和非洲人群（0.07%）最低[4-5]。Snail作為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）過程中重要轉(zhuǎn)錄因子，可抑制上皮細(xì)胞E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT。EMT是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型細(xì)胞，細(xì)胞失去上皮細(xì)胞表型和極性，細(xì)胞之間的粘連逐漸疏松，轉(zhuǎn)化為具有高侵襲和運(yùn)動能力的間質(zhì)表型細(xì)胞[6-7]，EMT被認(rèn)為是導(dǎo)致腫瘤局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移較為常見和重要的原因[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)研究旨在探討Snail在肝內(nèi)膽管癌的表達(dá)和臨床意義，了解Snail與肝內(nèi)膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移臨床病理特征的關(guān)系，初步探討Snail在肝內(nèi)膽管癌的研究意義，為進(jìn)一步在體外研究和動物實(shí)驗(yàn)研究提供臨床數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1　臨床資料

臨床患者資料來自于昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科二病區(qū)1999年12月—2010年1月期間55例肝內(nèi)膽管癌患者，均接受根治性手術(shù)切除術(shù)，取肝內(nèi)膽管癌腫瘤組織以及鄰近的癌旁正常膽管組織，全部患者簽署知情同意書，并獲昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)；55例患者均無全身遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，男28例，女27例；年齡≥70歲者15例，年齡＜70歲者40例；血清CA19-9≥37 ng/mL者30例，CA19-9＜37 ng/mL者25例；血清CEA≥5 ng/mL者40例，CEA＜5 ng/mL者15例；腫瘤單發(fā)者42例，多發(fā)者13例。TNM分期標(biāo)準(zhǔn)采用國際抗癌聯(lián)盟（UICC）與美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）條例。病理組織評分標(biāo)準(zhǔn)采用國際衛(wèi)生組織條例：腫瘤中低分化者31例，高分化者24例。根據(jù)術(shù)中所見及術(shù)后淋巴結(jié)病理檢查，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者26例。術(shù)后病檢結(jié)果均為肝內(nèi)膽管癌，全部患者術(shù)前未接受化療和放療。隨訪日期到2015年1月1日結(jié)束，失訪6例，平均隨訪期為（22.6±17.3）（3～60）個(gè)月

1.2　免疫組化

臨床病理組織采用4%多聚甲醛（上海翊圣生物科技有限公司）固定、石蠟包埋、制做組織切片，90 ℃烤片2 h，二甲苯溶液（上海翊圣生物）浸泡2次各15 min，依次不同濃度乙醇（100%、95%、90%、75%、70%）各5 min，抗原修復(fù)采用檸檬酸鈉（上海翊圣生物，10 mmol/L，pH 6.0）100 ℃維持10 min，后室溫冷卻30 min，3%過氧化氫（南京凱基生物）作用20 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，5%牛血清蛋白（上海翊圣生物）封閉2 h，孵育一抗兔抗Snail單克隆抗體（1:500，英國Abcam公司，貨號ab180714），4 ℃過夜，孵育二抗（山羊抗兔二抗，上海翊圣生物科技有限公司）20 min，DAB顯色（南京凱基生物），顯微鏡下控制，蘇木素（南京凱基生物）細(xì)胞核復(fù)染，酒精水化及二甲苯透明，中性樹膠（上海翊圣生物）封片，奧林巴斯光學(xué)（日本，DP71）顯微鏡下鏡檢采集數(shù)據(jù)。

1.3　免疫組化結(jié)果評分

評分方法參考復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院肝癌研究所出版文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[10-11]，采用Image pro plus軟件分析，綜合染色面積和強(qiáng)度評分。染色面積標(biāo)準(zhǔn)：棕色面積＞50%為1分，棕色＜50%位0分。染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)：棕黑色染色為2分，較淺棕色為1分，無染色為0分。結(jié)果分別給2名病理科醫(yī)師觀察，染色面積和強(qiáng)度評分相加，總分≥2分認(rèn)為是高表達(dá)，低于2認(rèn)為是低表達(dá)。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 21.0軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，癌和癌旁Snail表達(dá)比較采用配對t檢驗(yàn)。繪制Kaplan-Meier總體生存曲線和累計(jì)復(fù)發(fā)曲線，Log-rank檢驗(yàn)分析總體生存率和累計(jì)復(fù)發(fā)率差異，采用Cox回歸模型進(jìn)行多因素生存分析。檢驗(yàn)結(jié)果取雙側(cè)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1　Snail在肝內(nèi)膽管癌的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

免疫組化法檢測55例肝內(nèi)膽管癌病理組織，結(jié)果表明在腫瘤組織中（圖1A-B）表達(dá)明顯高于癌旁組織（圖1C-D）；Snail染色主要位于細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中未見表達(dá)，經(jīng)免疫組化評分分析腫瘤組織與癌旁組織結(jié)果分別為2.764±0.844、0.914+0.765，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.575，P＜0.001）（圖1E）；其中腫瘤組織高表達(dá)率為48.6%（27/55），癌旁組織高表達(dá)率為18.0%（10/55），兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.770，P=0.001）（圖1F）。

將Snail定量表達(dá)與肝內(nèi)膽管癌病例病理特征相結(jié)合分析，結(jié)果表明過表達(dá)的Snail患者與低表達(dá)的Snail患者在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤分化、微血管侵犯以及復(fù)發(fā)之間存在差異（表1）。

圖1　Snail表達(dá)免疫組化檢測結(jié)果　A-B：腫瘤組織（×200）；C-D：癌旁組織（×200）；E：Snail相對表達(dá)量比較；F：Snail高表達(dá)百分比比較Figure 1　Results of immunohistochemical staining for Snail expressions　A–B: Tumor tissue (×200); C–D: Peritumoral tissue (×200);E: Comparison of relative Snailexpression levels; F: Comparison of percentages of high Snail expression

2.2　Snail與55例肝內(nèi)膽管癌病例生存分析

S n a i l免疫組化染色結(jié)果與生存分析結(jié)果表明，過表達(dá)Snail的病例術(shù)后總體生存率較低（P=0.018）（圖2A），術(shù)后累計(jì)復(fù)發(fā)率較高（P=0.032）（圖2B）。單因素總體生存率和累計(jì)復(fù)發(fā)率分析結(jié)果表明TNM分期、微血管侵犯淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、以及Snail染色可預(yù)測肝內(nèi)膽管癌患者預(yù)后（均P＜0.05）（表2）；多因素Cox回歸模型分析結(jié)果表明微血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及Snail 表達(dá)可是肝內(nèi)膽管癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（均P＜0.05）（表3）。

表1　Snail表達(dá)與肝內(nèi)膽管癌患者臨床病理特征的關(guān)系分析[n（%）]Table 1　Analysis results of relations of snail expression with cliniopathologic features　ICC patients　[n(%)]

圖2　Snail表達(dá)與患者生存的關(guān)系　A：總體生存率；B：累計(jì)復(fù)發(fā)率Figure 2　Relation of Snail expression and survival of the patients　A: Overall survival rate; B: Cumulative recurrence rate

表2　單因素總體生存率和累計(jì)復(fù)發(fā)率分析結(jié)果Table 2　Univariate analysis of factors for overall survival and cumulative recurrence rates

表3　多因素Cox回歸模型分析結(jié)果Table 3　Analysis results of multivariate Cox regression model

3　討　論

肝內(nèi)膽管癌作為一種侵襲性較強(qiáng)的惡性腫瘤，預(yù)后較差、有效治療措施有限[12-13]，高侵襲和轉(zhuǎn)移是其導(dǎo)致死亡的最主要原因之一[12]，選取合理有效的分子標(biāo)記物評估肝內(nèi)膽管癌患者預(yù)后與早期復(fù)發(fā)，對肝內(nèi)膽管癌患者具有重要的臨床治療指導(dǎo)意義，大量研究[14-16]證實(shí)EMT可促進(jìn)腫瘤細(xì)的胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，而在EMT過程中Snail作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子[17]，其可促進(jìn)腫瘤EMT致使腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力大大提高，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[18-19]。

核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子S n a i l，能夠結(jié)合到E-cadherin基因DNA中啟動子區(qū)域[20]以及通過表觀遺傳學(xué)修飾[21]抑制E-cadherin的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞EMT，在眾多促進(jìn)腫瘤侵襲的研究中表明，不同的分子通過不同的信號通路導(dǎo)致Snail因子異常增加，可加速腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生，Ke等[22]在CD151分子對肝細(xì)胞肝癌的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移研究中，發(fā)現(xiàn)CD151可通過PI3K/Akt/Snali信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT；此外在體外肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞研究中，采用RNA干擾技術(shù)沉默Snail蛋白表達(dá)后細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力減低[11]；吳天山等[23]對胰腺癌患者行病理標(biāo)本免疫組化染色，結(jié)合隨訪資料分析Snail與EMT指標(biāo)密切相關(guān)，是胰腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，Snail在肝內(nèi)膽管癌病理組織中呈現(xiàn)過表達(dá)，臨床病理特征分析結(jié)果表明過表達(dá)的Snail與侵襲轉(zhuǎn)移病理特征相關(guān)，結(jié)合既往研究，筆者推測Snail在肝內(nèi)膽管癌中過表達(dá)可能會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT改變，致使腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力增加，這為目前腫瘤的分子靶向提供了部分臨床數(shù)據(jù)，當(dāng)靶向沉默Snail后可能會降低細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，緩解患者的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)，為患者帶來新的治療機(jī)會。

在Snail臨床隨訪研究中，Kong等[24]對44例肝門部膽管癌進(jìn)行了臨床隨訪研究，結(jié)果表明Snail可預(yù)測較差的預(yù)后，作為預(yù)后指標(biāo)；在103例胃癌病例的臨床隨訪研究中，結(jié)果表明Snail能夠作為一種合理的預(yù)后因子預(yù)測胃癌的進(jìn)展，并可作為胃癌的干預(yù)靶點(diǎn)之一[25]。在此，我們的隨訪生存分析結(jié)果表明，過表達(dá)的Snail肝內(nèi)膽管癌患者中，其術(shù)后總體生存率較低，且過表達(dá)Snail患者的術(shù)后累計(jì)復(fù)發(fā)率較高，在單因素分析和多因素Cox回歸模型分析結(jié)果表明Snail染色可作為預(yù)測肝內(nèi)膽管癌患者預(yù)后的指標(biāo)，這與Snail在其他腫瘤中的研究結(jié)果類似，這對指導(dǎo)患者術(shù)后常規(guī)進(jìn)行Snail免疫組化染色評估肝內(nèi)膽管癌患者的預(yù)后具有重要的意義，為早期進(jìn)行生物治療提供有力的數(shù)據(jù)，同樣為降低患者術(shù)后復(fù)發(fā)率和病死率都提供有力的支持。

綜上所述，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)論為Snail在肝內(nèi)膽管癌中表現(xiàn)為過表達(dá)，過表達(dá)的Snail與肝內(nèi)膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移臨床病理特征相關(guān)，雖Snail的具體作用機(jī)制需要我們更深層次的探索，但根據(jù)本研究結(jié)果推斷，Snail有可能做為預(yù)測肝內(nèi)膽管癌患者預(yù)后因子，并可望作為生物治療的作用靶點(diǎn)。

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