陳 芳, 黃丹丹, 王 芳

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊, 830000;2. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊, 830000;3. 新疆維吾爾自治區(qū)第四附屬醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊, 830000)

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原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜組織中蛋白激酶的表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究

陳 芳1, 黃丹丹2, 王 芳3

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊, 830000;2. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊, 830000;3. 新疆維吾爾自治區(qū)第四附屬醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊, 830000)

目的 觀察并分析蛋白激酶在原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)患者蛻膜組織中的表達(dá)情況，及其與胎盤蛻膜細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。方法 回顧性分析本院就診的140患者，將其分成80例流產(chǎn)組和60例對照組。采用免疫組織化學(xué)染色法分別測定SGK在2組URSA患者蛻膜組織中的表達(dá)情況，同時(shí)采用DNA末端原位標(biāo)記染色法(TUNEL法)分別檢測流產(chǎn)組和對照組的細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。結(jié)果 流產(chǎn)組患者蛻膜組織中SGK的陽性表達(dá)率為25.0%, 明顯低于對照組的93.3%, 2組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 流產(chǎn)組的平均細(xì)胞凋亡指數(shù)為明顯高于對照組, 2組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 URSA患者蛻膜組織中蛋白激酶的表達(dá)降低，與組織細(xì)胞凋亡明顯增加存在相關(guān)性。

蛻膜; 流產(chǎn); 復(fù)發(fā)性凋亡; 蛋白激酶; 相關(guān)性

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA) 在臨床上的定義為連續(xù)發(fā)生3次或3次以上的流產(chǎn)，生育年齡婦女RSA發(fā)生率為1%～5%, 且有逐年上升趨勢。隨著流產(chǎn)次數(shù)的增加，自然流產(chǎn)發(fā)生的危險(xiǎn)也在增加，在連續(xù)發(fā)生2次自然流產(chǎn)后，第3 次有高達(dá)80%妊娠胚胎丟失的危險(xiǎn)。RSA已成為目前生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中亟待解決的問題，但發(fā)病機(jī)制目前尚不十分明確。病因十分復(fù)雜，除了血栓形成傾向、染色體異常、生殖道病原體感染、子宮解剖結(jié)構(gòu)異常和內(nèi)分泌紊亂等因素外，約50%患者原因不明，而原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)指的是致病原因不明確的RSA。目前育齡夫婦群體中RSA的發(fā)病率為1%～2%, 臨床上不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)占復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的比例高達(dá)50%, 因URSA的病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，其中大多與封閉抗體、HLA-G 表達(dá)異常、Th1/Th2平衡失調(diào)、NK細(xì)胞殺傷活性增強(qiáng)、自身免疫性抗體等免疫因素密切相關(guān)，至今仍未找到有效的治療手段[1-2]。有研究[3-4]證實(shí)，子宮內(nèi)膜細(xì)胞中血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶(SGK)含量的高低是受孕成功的關(guān)鍵因素，起著生育分子開關(guān)的重要作用。本研究探討和分析URSA患者蛻膜組織中SGK的表達(dá)和作用，及其與細(xì)胞凋亡之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2009年3月—2013年3月來本院就診的患者80例為流產(chǎn)組，平均年齡(25.6±3.52)歲，自然流史≥2次，既往無死胎、死產(chǎn)史，經(jīng)婦科常規(guī)病因篩查，排除解剖、內(nèi)分泌、染色體、自身免疫性及生殖道感染等方面的疾病。未曾服用對胎兒有不良反應(yīng)的藥物。正常妊娠組60例，為同期篩選的本院就診的患者，平均年齡(24.6±3.65)歲，既往無自然流產(chǎn)、死胎史，排除解剖、染色體、內(nèi)分泌的異常和自身免疫性及生殖道感染等方面的疾病。2組患者一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

將采集得到新鮮標(biāo)本置于4%的中性甲醛溶液中固定，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片(每張切片厚約5 μm)后，進(jìn)行常規(guī)HE染色。用SP免疫組織化學(xué)染色法檢測蛻膜組織中SGK的表達(dá)。所有切片均集中染色，避免組內(nèi)、組間出現(xiàn)誤差。實(shí)驗(yàn)設(shè)置陽性和陰性對照，由試劑公司提供陽性對照，統(tǒng)一采用TBS代替一抗作為陰性對照。采用DNA末端原位標(biāo)記染色法(TUNEL)檢測流產(chǎn)組和對照組的細(xì)胞凋亡指數(shù)，切片標(biāo)本經(jīng)過常規(guī)脫蠟至水、微波修復(fù)、30%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后，加入TUNEL反應(yīng)液及轉(zhuǎn)化劑POD進(jìn)行反應(yīng)，再經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、蘇木素復(fù)染，脫水透明后封片。實(shí)驗(yàn)設(shè)置陽性和陰性對照，由試劑公司提供陽性對照，統(tǒng)一采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)代替TUNEL反應(yīng)液作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷

在光學(xué)顯微鏡下觀察和分析切片，若細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒則為陽性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取40個(gè)高倍鏡視野，采用半定量積分法對結(jié)果進(jìn)行判斷。染色強(qiáng)度積分分級為: 無色: 0分；淡黃色: 1分；棕黃色: 2分；棕褐色: 3分。陽性細(xì)胞數(shù)積分分級: 小于總細(xì)胞數(shù)的5%為0分; 總細(xì)胞數(shù)的5%～20%為1分; 總細(xì)胞數(shù)的21%～50%為2分; 大于總細(xì)胞數(shù)的50%為3分。總積分等于染色強(qiáng)度積分與陽性細(xì)胞數(shù)積分相乘所得值，根據(jù)總積分大小劃分成: 0分: 陰性(-); 1～3分: 弱陽性; 4～6分: 陽性(2+); ≥7分: 強(qiáng)陽性(3+)。將弱陽性(+)、陽性(2+)、強(qiáng)陽性(3+) 3者所占的百分比稱為陽性率。

在光學(xué)顯微鏡下，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核著色呈棕黃色。每張切片隨機(jī)選取40個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算出凋亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞凋亡指數(shù)AI為陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2組患者蛻膜組織均有SGK1的表達(dá)，對照組患者蛻膜組織中SGK1表達(dá)陽性率為93.3%, 平均染色分值為(5.85±1.35)分; 而流產(chǎn)組患者蛻膜組織中SGK1表達(dá)陽性率為25.0%, 平均染色分值為(1.05±0.96)分。2組比較顯示，流產(chǎn)組中SGK1的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。染色后，對照組患者平均細(xì)胞凋亡指數(shù) (2.87±1.07)%, 低于流產(chǎn)組患者的(8.19±3.58)%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

在免疫學(xué)上，妊娠常被認(rèn)為是一個(gè)同種半異體的移植過程，母胎之間免疫平衡的調(diào)節(jié)關(guān)系到妊娠過程的成功與否，由蛻膜和絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞組成母胎界面，滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲向子宮內(nèi)膜層，然后開始進(jìn)行遷移分化、調(diào)節(jié)植入胚，并開始侵襲母體血管。上述全過程啟動子宮胎盤循環(huán)完成，子宮胎盤循環(huán)為胎兒提供供應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)和血液、進(jìn)行排泄代謝產(chǎn)物和氣體交換的場所。滋養(yǎng)層細(xì)胞維持Th1/Th2平衡的基礎(chǔ)是能夠分泌多種細(xì)胞因子。母體和胎兒直接接觸面是蛻膜，蛻膜組織有著相當(dāng)復(fù)雜的免疫細(xì)胞成分，蛻膜NK(dNK)細(xì)胞約占蛻膜免疫活性細(xì)胞總量的70%～80%, 是妊娠早期母胎界面的優(yōu)勢細(xì)胞，另外還有約占15%單核巨噬細(xì)胞和約占15% T淋巴細(xì)胞等。它們的功能、數(shù)量、表型與外周循環(huán)明顯不同，局部免疫耐受或免疫應(yīng)答的形成由這些變化決定，維持母胎免疫平衡。

臨床上原因不明的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)占復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的比例較高，因此找到其有效的治療手段是目前亟需解決的難題。按生殖免疫學(xué)的觀點(diǎn)，胚胎作為半同種移植物，之所以能在母體中存活，有賴于免疫耐受機(jī)制的形成，使得其避開了母體免疫系統(tǒng)的排斥攻擊，而原因不明的流產(chǎn)是一種失敗的半同種移植結(jié)果，多數(shù)研究也證實(shí)妊娠婦女對胚胎半同種抗原的免疫耐受決定了妊娠的成功與否。由于失衡的遺傳物質(zhì)，常?？沙霈F(xiàn)死胎和流產(chǎn)的現(xiàn)象，主要涉及9號染色體最多見，男性異常核型占9.5%，女性占13.2%。

蛋白激酶是主要的細(xì)胞內(nèi)信息分子，參與了糖尿病性心血管病、低氧性肺動脈高壓等多種疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶C在血管病變，如門脈高壓等疾病的發(fā)生過程中也起重要作用。當(dāng)胎盤代謝障礙時(shí)，此時(shí)環(huán)核甙酸(cANP、cHMF)水平發(fā)生改變，導(dǎo)致胎盤功能不全(PI), 環(huán)核甙酸磷酸化作用過程與cHMF-依賴蛋白激酶和cANP-激活相關(guān)。環(huán)核甙酸依賴蛋白激酶活性所顯示的改變證明，在PI發(fā)病機(jī)制中胎盤蛋白磷酸化作用障礙可能起重要作用。

蛋白激酶在妊高征的發(fā)生中扮演了重要角色，妊高癥患者蛻膜和胎盤絨毛上的細(xì)小動脈血管厚度明顯增加，并且相對于正常妊娠者來說，其管壁纖維素樣壞死率明顯升高，說明胎盤絨毛血管管壁發(fā)生了重構(gòu)。蛋白激酶C通道是最重要的細(xì)胞膜后信號傳導(dǎo)途徑之一，其通道由于酶活性增高，在慢性低氧時(shí)酶量增多，通道功能會因此發(fā)生顯著上調(diào)。妊高征患者胎盤絨毛組織胞膜/胞漿蛋白激酶C-α比值明顯高于正常妊娠婦女。免疫組化檢測結(jié)果顯示，妊高征患者胎盤細(xì)小動脈管壁蛋白激酶C-α明顯比正常妊娠婦女表達(dá)高，提示妊高征患者胎盤絨毛蛋白激酶C-α表達(dá)異常及其活性增加，尤其是前膠原纖維Ⅰ增加，導(dǎo)致胎盤細(xì)小血管管壁增厚，尤其是重度患者，胎兒-胎盤單位灌注血流減少，減少胎兒供應(yīng)血氧，最終限制胎兒生長。另一方面，胎盤血管血供減少，管壁增厚，進(jìn)一步損傷胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管活性物質(zhì)進(jìn)一步增多，進(jìn)而致孕婦全身的細(xì)小動脈發(fā)生痙攣性收縮，導(dǎo)致蛋白尿、高血壓、水腫等一系列臨床表現(xiàn)。進(jìn)一步深入研究蛋白激酶C亞型及其在血管重構(gòu)中的作用，有可能從蛋白和(或)基因水平認(rèn)識原因不明的流產(chǎn)的機(jī)制，可有目的地使用特異性拮抗劑，通過蛋白激酶C在細(xì)胞內(nèi)的活性及表達(dá)調(diào)控，滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力降低，影響胚胎的植入和著床。胎兒與母體血流失調(diào)，而失調(diào)的胎盤血流不能為胎兒提供充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，影響胎兒的發(fā)育和胚胎的生存。

婦女正常的生育能力與子宮內(nèi)膜細(xì)胞中SGK的含量關(guān)系密切，作為生育分子開關(guān)的SGK, 其含量的高低是妊娠的關(guān)鍵調(diào)控因素，在受孕成功中起著關(guān)鍵的作用。目前，關(guān)于血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶(SGK)與URSA關(guān)系的研究不斷深入[5-6]。邱添等[7-8]研究證實(shí), RSA患者蛻膜組織中SGK1的表達(dá)低于健康人正常水平。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組患者蛻膜組織中SGK1表達(dá)陽性率為93.3%，平均染色分值為(5.85±1.35)分; 而流產(chǎn)組患者蛻膜組織中SGK1表達(dá)陽性率為25.0%, 平均染色分值為(1.05±0.96)分, 2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？芍猄GK在流產(chǎn)組患者蛻膜組織中的表達(dá)明顯低于對照組，與邱添等的研究結(jié)果類似。

母體胎兒屏障滋養(yǎng)層和蛻膜組織的功能是正常的妊娠生理過程順利進(jìn)行的前提。在正常的妊娠過程中，滋養(yǎng)層細(xì)胞和胎盤蛻膜細(xì)胞不斷進(jìn)行細(xì)胞增殖和凋亡，使得組織結(jié)構(gòu)得以不斷改建維持妊娠，滿足胚胎生長發(fā)育的需要。母體胚胎的正常發(fā)育需要子宮蛻膜組織提供必要的營養(yǎng)支持，細(xì)胞的凋亡可調(diào)整滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜的深度，另一方面也保護(hù)著胚胎免受母體的免疫排斥，而自然流產(chǎn)的發(fā)生往往伴隨著這種平衡狀態(tài)的打破。胎盤的正常功能有賴于其血供的正常供給，當(dāng)合體細(xì)胞的凋亡數(shù)目增加，胎盤的血管生長受到抑制，進(jìn)而引起血供不足，胎盤功能出現(xiàn)障礙[9-11]。胎盤發(fā)育過程中若蛻膜細(xì)胞的凋亡過度，則胚胎發(fā)育停止，妊娠過程受阻，最終導(dǎo)致自然流產(chǎn)的發(fā)生[12-13]。妊娠中涉及的細(xì)胞凋亡過程重要而復(fù)雜。研究[14-15]表明，正常早期妊娠過程中均有細(xì)胞凋亡的發(fā)生，包括滋養(yǎng)細(xì)胞層的凋亡、胎盤結(jié)構(gòu)的重塑以及蛻膜組織的退化與重建，任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)凋亡異常，均會影響妊娠的正常發(fā)育，增加流產(chǎn)發(fā)生的可能性。本研究顯示, URSA患者蛻膜組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)明顯高于正常早孕患者，這提示SGK在RSA患者蛻膜細(xì)胞凋亡過程中可能起著重要的作用。蛻膜組織的過度凋亡與蛻膜細(xì)胞中表達(dá)的SGK含量的減少有關(guān)，當(dāng)SGK表達(dá)減少，機(jī)體抑制凋亡的能力隨之下降，蛻膜組織出現(xiàn)過度凋亡，進(jìn)而使得胎盤發(fā)育受阻，最終引發(fā)自然流產(chǎn)。

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Relationship between expression of SGK and apoptosis in uterine decidua in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion

CHEN Fang1, HUANG Dandan2, WANG Fang3

(1. the Forth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang, 830000; 2. Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine of Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang, 830000; 3. the Fourth Affiliated Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi, Xinjiang, 830000)

Objective To observe the expression of SGK in uterine decidua in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA) and to investigate its role in the course of apoptosis. Methods The data of 140 patients in our hospital was retrospectively analyzed. The expression of SGK was detected by immunohistochemistry in decidua of URSA (abortion group,n=80) and normal first trimester pregnant women (control group,n=60). The apoptotic index was detected by TUNEL. Results Compared with the control group, the positive expression of SGK decreased significantly in the abortion group, and the difference was statistically significant(P<0.05). The average apoptotic index of the abortion group was significantly higher than that of the control group(P<0.05). Conclusion The positive expression of SGK is decreased in uterine decidua cells in patients with URSA, which is related to apoptosis.

decidua; abortion; recurrent apoptosis; protein kinases; correlation

2016-12-18

新疆維吾爾自治區(qū)教育廳基金(j281822)

R 714.21

A

1672-2353(2017)11-101-03

10.7619/jcmp.201711030