王衛(wèi)國

(阜陽市人民醫(yī)院，安徽阜陽 236001)

急性白血病微小殘留病檢測方法臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展

王衛(wèi)國

(阜陽市人民醫(yī)院，安徽阜陽 236001)

急性白血病(AL)患者治療后微小殘留病(MRD)水平直接決定AL復(fù)發(fā)和患者的生存期。近年來，越來越多的方法用于MRD的檢測，如熒光原位雜交(FISH)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、質(zhì)譜技術(shù)，其預(yù)測疾病復(fù)發(fā)、評估預(yù)后等臨床價值得到廣泛認(rèn)可，可為AL的臨床干預(yù)治療提供依據(jù)。

急性白血??；微小殘留病；熒光原位雜交；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；流式細(xì)胞術(shù)；質(zhì)譜技術(shù)

急性白血病(AL)是發(fā)生于造血干細(xì)胞水平的惡性腫瘤，按腫瘤細(xì)胞的分化系別不同，一般可分為急性髓細(xì)胞性白血病(AML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)。AL患者治療后體內(nèi)殘留的腫瘤細(xì)胞數(shù)量決定其臨床結(jié)局。微小殘留病(MRD)是指AL誘導(dǎo)化療或骨髓移植后，達(dá)到臨床和血液學(xué)的完全緩解(形態(tài)學(xué)檢查骨髓中原始細(xì)胞<5%)，而體內(nèi)殘存微量白血病細(xì)胞的狀態(tài)，是病情動態(tài)觀察不可或缺的一部分。因此，監(jiān)測AL患者M(jìn)RD的變化非常重要。近年來，檢測MRD方法不斷發(fā)展，有熒光原位雜交(FISH)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、質(zhì)譜技術(shù)。現(xiàn)將其臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 FISH

FISH是利用核酸探針在高分辨率中期或間期染色體上雜交，檢測染色體異常的一種方法，檢測MRD的靈敏度為1%左右，但若與其他技術(shù)聯(lián)合，也可以是一種選擇。Wang等[1]采用一種獨特的Flow-FISH方法分析白血病干細(xì)胞的比例：對初診的AML患者利用流式細(xì)胞儀分選出CD34+細(xì)胞，結(jié)合初診時遺傳學(xué)的異常結(jié)果，對分選細(xì)胞進(jìn)行FISH，鏡檢分析FISH+CD34+CD38-細(xì)胞(白血病干細(xì)胞)的比例，發(fā)現(xiàn)高比例白血病干細(xì)胞(>1%)是患者2年總生存率(OS)、無事件生存率(EFS)不利因子。由于白血病干細(xì)胞的殘存是AL復(fù)發(fā)的根本原因，這提示富集白血病細(xì)胞后再利用FISH檢測MRD，可能是一種較好的選擇。

2 PCR技術(shù)

2.1 融合基因檢測 融合基因是指兩個或兩個以上的基因編碼區(qū)首尾相連而形成的嵌合基因。目前AL被檢測最常見的融合基因包括BCR-ABL、RUNX1-RUNX1T1、PML-RARα、TEL/AML1等，檢測方法為逆轉(zhuǎn)錄PCR、多重PCR或?qū)崟r定量PCR。酪氨酸激酶抑制劑是治療慢性粒細(xì)胞白血病(Ph染色體是其標(biāo)志性染色體)的首選靶向藥物，但有1/4～1/3的B細(xì)胞ALL患者也伴有Ph染色體或BCR-ABL融合基因。這類患者一般預(yù)后差，以往首選的治療方案是骨髓移植。Ravandi等[2]對Ph+ALL患者采用酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)合化療方式進(jìn)行強(qiáng)化治療，監(jiān)測包含BCR-ABL在內(nèi)的骨髓MRD水平，發(fā)現(xiàn)患者若能獲得首次完全緩解則可以受益于這種強(qiáng)化治療。現(xiàn)在很多臨床治療中心采用酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)合化療方案治療Ph+ALL患者，該方案與骨髓移植的療效差異并不明顯[3]，其中MRD的檢測為臨床治療方法的更新提供了強(qiáng)有力的支持。伴有染色體t(8；21)AML的融合基因為RUNX1-RUNX1T1，此類型AML治療效果較好。伴t(8；21)AML患者異基因造血干細(xì)胞移植后，12個月內(nèi)RUNX1-RUNX1T1轉(zhuǎn)錄本水平比診斷時下降小于3個對數(shù)級和(或)12個月后下降小于4個對數(shù)級預(yù)示著復(fù)發(fā)[4]。對兒童t(8；21)AML患者的研究也表明，1個療程誘導(dǎo)緩解后RUNX1-RUNX1T1轉(zhuǎn)錄本下降是否大于2個對數(shù)級是影響無復(fù)發(fā)生存的獨立預(yù)后因素[5]?？梢?，融合基因的水平及其轉(zhuǎn)錄本下降的水平能提前預(yù)測AL的復(fù)發(fā)，為提前的臨床干預(yù)提供依據(jù)。

2.2 癌基因檢測 AL患者重現(xiàn)性分子及遺傳學(xué)異常出現(xiàn)頻率較低，但一些癌基因如腎母細(xì)胞瘤基因1(WT1)、腦和AL胞質(zhì)蛋白(BAALC)基因等會因異?；罨磉_(dá)增強(qiáng)。WT1為AL患者較常見的過表達(dá)癌基因[6,7]，利用實時定量PCR技術(shù)檢測其分子表達(dá)水平，可反映MRD水平。Lambert等[8]研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)治療后和療程結(jié)束時外周血WT1 MRD陽性(>0.5%)與較高的復(fù)發(fā)率和較短的OS有關(guān)。PML-RARα表達(dá)水平是監(jiān)測急性早幼粒細(xì)胞白血病MRD的標(biāo)志物，其陽性意味著疾病復(fù)發(fā)，不能當(dāng)作預(yù)示復(fù)發(fā)的指標(biāo)。Yoon等[9]研究發(fā)現(xiàn)，維持治療后第3個月高表達(dá)WT1(>120 copies/104ABL1)的急性早幼粒細(xì)胞白血病患者，具有較高的復(fù)發(fā)率和較低的無病生存期，多因素分析顯示診斷時高白細(xì)胞數(shù)量和維持治療后第3個月WT1高表達(dá)是預(yù)示復(fù)發(fā)的重要因素。可見以WT1的表達(dá)水平來監(jiān)測MRD評估患者預(yù)后是一種可行的方式。AL患者BAALC表達(dá)升高可促進(jìn)白血病細(xì)胞的形成，Weber等[10]用實時定量PCR技術(shù)檢測正常核型AML患者BAALC轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)BAALC與多種預(yù)后不良的基因突變有關(guān)，是預(yù)后不佳的獨立影響因子，可作為一種預(yù)后風(fēng)險分層和MRD監(jiān)測的標(biāo)志物。

2.3 基因重排檢測 ALL患者除了BCR/ABL融合基因陽性率在20%～30%外，其他融合基因陽性率均較低。當(dāng)前許多研究證明免疫球蛋白(Ig)或T細(xì)胞受體(TCR)基因重排是ALL細(xì)胞克隆性的分子標(biāo)志，是ALL患者M(jìn)RD監(jiān)測應(yīng)用最廣泛的指標(biāo)。目前檢測Ig/TCR基因重排國際公認(rèn)的的方法是標(biāo)準(zhǔn)化BIOMED-2 PCR，利用107對不同引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對電泳結(jié)果陽性的標(biāo)本進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，并再通過測序分析進(jìn)行驗證。但這種方法繁瑣且成本過高，一般臨床大多利用特異性引物擴(kuò)增目的片段如等位基因特異性引物PCR法進(jìn)行檢測[11]。為了提高檢測的靈敏度，Logan等[12]利用下一代高通量測序技術(shù)定量檢測ALL患者Ig/TCR重排，認(rèn)為只要樣本充足，檢測MRD敏感度可達(dá)到1×10-6，發(fā)現(xiàn)骨髓移植前30 d內(nèi)MRD≥1×10-4與移植后的復(fù)發(fā)率有關(guān)，17例患者移植后任何時間檢測到MRD≥1×10-6都復(fù)發(fā)并且死亡，這種分子水平檢測到的MRD比臨床復(fù)發(fā)提前89 d(中位數(shù))，這種高靈敏度檢測MRD技術(shù)能為患者復(fù)發(fā)前提供一個明確的臨床干預(yù)窗。Mannis等[13]也使用下一代測序技術(shù)檢測ALL患者自體干細(xì)胞移植后外周血MRD水平(Ig/TCR重排)，以探討MRD水平與復(fù)發(fā)的關(guān)系，多變量分析結(jié)果顯示，僅MRD≥1×10-6是ALL復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因子。可以預(yù)見，隨著技術(shù)的完善，下一代測序技術(shù)檢測MRD的性能會越來越好，可為臨床治療提供更早更準(zhǔn)確的評估信息。

2.4 基因突變檢測 重現(xiàn)性融合基因表達(dá)僅出現(xiàn)在較少的AML亞型中，但基因突變是較常見的分子生物學(xué)改變，與AML的發(fā)生關(guān)系密切，是AML危險分層的指標(biāo)[14,15]。由于技術(shù)上的難度，目前臨床上以檢測核磷蛋白1(NPM1)突變的MRD最為常見。鎖核酸(LNA)是一種經(jīng)過修飾的RNA，其2′和4′的碳連接在一起，因此若在PCR中使用含LNA的引物，反應(yīng)的穩(wěn)定性會增加。Shayegi等[16]采用引物中含LNA的實時定量PCR技術(shù)檢測具有NPM1突變(NPM1mut)AML患者的MRD：依據(jù)最大約登指數(shù)對應(yīng)的臨界值，NPM1mut/ABL1為1%時具有最佳靈敏度和特異度(首次完全緩解后第90天的監(jiān)測點)；通過交叉驗證部分似然函數(shù)推出，化療后NPM1mut/ABL1>1%最能預(yù)測復(fù)發(fā)，而骨髓移植后NPM1mut/ABL1>10%最能預(yù)測復(fù)發(fā)，并與患者的無病生存率和OS有關(guān)，提示使用該方法檢測這類患者M(jìn)RD可為臨床的早期干預(yù)治療提供依據(jù)。趙婷等[17]研究也表明，NPM1突變陽性的AML患者，伴FLT3-ITD突變和化療后早期MRD高水平提示預(yù)后不良。

3 FCM

白血病相關(guān)免疫表型(LAIP)是指正常的外周血和骨髓細(xì)胞不表達(dá)或表達(dá)比例低的免疫表型，主要的LAIP包括異位性抗原表達(dá)、跨系表達(dá)、跨期表達(dá)、抗原表達(dá)熒光強(qiáng)度異常、散射光異常等，這是FCM檢測MRD的基礎(chǔ)和原理。CD304是漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的表面標(biāo)志，其在B-ALL細(xì)胞可出現(xiàn)較強(qiáng)的跨系表達(dá)。研究[18]發(fā)現(xiàn)，兒童B-ALL患者白血病細(xì)胞CD304的陽性表達(dá)與短生存率有關(guān)，提示CD304表達(dá)也許是一種預(yù)后不良的因子。CD123在正常造血干細(xì)胞為低或不表達(dá)，但在白血病細(xì)胞上表達(dá)增高，且是白血病干細(xì)胞的標(biāo)志之一，AML細(xì)胞表達(dá)CD34/CD123/CD25/CD99與FLT3-ITD突變密切相關(guān)[19]。CD66c是CEA基因家族成員，在血細(xì)胞中主要表達(dá)于粒細(xì)胞，但在BCR/ABL1陽性的B-ALL細(xì)胞上也可出現(xiàn)較高表達(dá)頻率，并對監(jiān)測MRD具有較高的診斷價值[20]。

隨著多色流式細(xì)胞儀的發(fā)展，F(xiàn)CM檢測MRD的準(zhǔn)確性和靈敏度均有提高。Weng等[21]利用八色FCM分析了成人B-ALL的MRD：對BCR-ABL陽性的患者，MRD定量采用FCM和實時定量PCR技術(shù)，比對分析發(fā)現(xiàn)兩種方法具有較好一致性(符合率可達(dá)到89.7%)；誘導(dǎo)化療結(jié)束時完全緩解及經(jīng)過1次鞏固治療的患者，若FCM檢測MRD陰性(MRD<0.01%)預(yù)示著更佳的2年無復(fù)發(fā)生存率和OS，MRD為0.001%～0.01%的患者較檢測不出MRD的患者有較高的2年復(fù)發(fā)率；多變量分析顯示，誘導(dǎo)和1次鞏固治療后MRD陽性(MRD>0.01%)與復(fù)發(fā)高風(fēng)險有關(guān)，1次鞏固治療后MRD陽性預(yù)示較差的OS。八色FCM檢測MRD是一種較靈敏的手段，并能評估臨床預(yù)后，也是FCM檢測MRD的一個發(fā)展方向。

掌握正常血細(xì)胞中不同抗原在不同分化階段的表達(dá)量和表達(dá)規(guī)律、辨別出AL細(xì)胞出現(xiàn)的LAIP類型、確定隨訪的抗體組合是FCM檢測MRD的關(guān)鍵。一項多中心聯(lián)合利用FCM檢測AML MRD研究顯示[22]：在學(xué)習(xí)和培訓(xùn)后的檢測階段，每個中心會有一定程度的LAIP錯失，提示LAIP的確定和識別對FCM檢測MRD極其關(guān)鍵。另一項5個中心參與的研究結(jié)果顯示[23]：在歐洲方案的基礎(chǔ)上，優(yōu)選出八色方案檢測B-ALL患者的白血病細(xì)胞，可以區(qū)分出99%患者的異常細(xì)胞；與實時定量PCR檢測MRD結(jié)果比較，兩者呈明顯的正相關(guān)，若能收到足夠的細(xì)胞，可以達(dá)到與實時定量PCR相似的靈敏度?？梢娎肍CM檢測AL MRD需要優(yōu)化方案并標(biāo)準(zhǔn)化，并加強(qiáng)對檢測者的培訓(xùn)。

FCM監(jiān)測MRD對患者的療效判斷、復(fù)發(fā)風(fēng)險評估等有重要作用，并且對移植后的結(jié)局預(yù)示也非常有價值。Bar等[24]采用FCM監(jiān)測MRD，發(fā)現(xiàn)MRD對ALL患者清髓造血細(xì)胞移植的疾病結(jié)局有影響：移植前MRD陽性患者具有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險；若移植后MRD陽性，患者的復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險增加；聯(lián)合分析移植前后MRD的影響，MRD均陰性患者復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險最低，可見FCM對移植AL患者的預(yù)后評估提供了有效手段。丁喆等[25]也利用FCM檢測成人Ph染色體陰性B-ALL的MRD水平，結(jié)果也表明自體造血干細(xì)胞移植前和治療過程中MRD陰性，患者可以獲得更好的結(jié)局。

4 質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜技術(shù)是通過測定樣品中被離子化的離子質(zhì)荷比(m/z)，以實現(xiàn)對樣品的定性和定量，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的支撐技術(shù)之一?；|(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)具有較高的靈敏度、精密度，在醫(yī)學(xué)科研中應(yīng)用較多。Song等[26]利用MALDI-TOF MS分析發(fā)現(xiàn)，m/z為4 625的多肽在初治的AL患者中表達(dá)高于對照組和非惡性血液病組，并隨著治療后緩解程度的增加而下降；患者獲得分子學(xué)緩解時，m/z為4 625的多肽峰信號強(qiáng)度與健康對照者相似并明顯低于復(fù)發(fā)患者，且m/z為4 625多肽高水平的患者比低水平患者OS低；可見m/z為4 625的多肽可用于AL患者M(jìn)RD水平監(jiān)測和提供預(yù)后信息。Bai等[27]利用MALDI-TOF MS獲取成人AML患者血清多肽圖，發(fā)現(xiàn)：快速分類診斷模型尋找出3種敏感性和特異性俱佳的指標(biāo)，分別為泛素樣修飾激活酶1(UBA1)、纖維蛋白原α鏈前體異構(gòu)體1和血小板第四因子(PF4)；UBA1水平在初診、難治性或復(fù)發(fā)的AML患者中升高，但纖維蛋白原α鏈前體異構(gòu)體1和PF4水平在這兩者中變化方向與UBA1相反；UBA1表達(dá)相對強(qiáng)度高的AML患者生存期較低，纖維蛋白原α鏈前體異構(gòu)體1和PF4表達(dá)相對強(qiáng)度增高的患者具有較高的OS，由此推測這3種肽能用于MRD檢測和臨床預(yù)后的評估。質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用為AL患者檢測MRD開辟了新的方向和思路。

新的技術(shù)和方法的應(yīng)用，使AL患者M(jìn)RD檢測更加敏感和準(zhǔn)確，但目前也有一些問題有待解決：FISH敏感度低、探針價格昂貴并且應(yīng)用范圍??；PCR技術(shù)敏感度高，但融合基因、基因重排或突變并不普遍存在，且分子生物學(xué)檢測的標(biāo)準(zhǔn)化問題也有待解決；FCM檢測優(yōu)勢是適用范圍廣，但結(jié)果受到設(shè)門方式、抗體組合的選擇、檢測者經(jīng)驗等影響，不同實驗室間檢測結(jié)果差異較大，在國內(nèi)尤其要解決FCM檢測的標(biāo)準(zhǔn)化和檢驗技師的培訓(xùn)問題；質(zhì)譜技術(shù)中復(fù)雜的樣品前處理、怎樣控制檢測變異、不同檢測平臺的數(shù)據(jù)整合等問題。但隨著高通量測序技術(shù)、數(shù)字PCR技術(shù)、芯片技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)等新技術(shù)的發(fā)展，越來越多MRD標(biāo)志物會被發(fā)現(xiàn)，將推動AL預(yù)后評估進(jìn)入“MRD時代”。

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