張燕華，高艷娥，臧睿，楊紅梅

(1西安630醫(yī)院，西安710000；2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

姜黃素對(duì)宮頸癌干細(xì)胞增殖、聚集及化療敏感性的影響

張燕華1，高艷娥2，臧睿1，楊紅梅1

(1西安630醫(yī)院，西安710000；2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

目的探討姜黃素對(duì)宮頸癌干細(xì)胞增殖、聚集及化療敏感性的影響。方法用流式細(xì)胞術(shù)從人宮頸癌細(xì)胞株CASKI中分選CD133+的宮頸癌干細(xì)胞。將宮頸癌干細(xì)胞隨機(jī)分為七組，CC10組、CC20組、CC40組、CC60組、CC80組及CC100組分別給予終濃度為10、20、40、60、80、100 mg/mL姜黃素進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)照組給予等量溶劑與培養(yǎng)基培養(yǎng)。用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率。取對(duì)照組、CC60組細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1周，光鏡下計(jì)數(shù)聚集的直徑大于100 μm的干細(xì)胞球個(gè)數(shù)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)宮頸癌干細(xì)胞比例。取宮頸癌干細(xì)胞隨機(jī)分為BV組、CC組、BV+CC組、對(duì)照組四組，分別加入10 mg/mL貝伐單抗、60 mg/mL姜黃素、10 mg/mL BV+60 mg/mL姜黃素、等量溶劑與培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)算細(xì)胞凋亡率。結(jié)果CC10組、CC20組、CC40組、CC60組、CC80組、CC100組細(xì)胞增殖抑制率均高于對(duì)照組(P均<0.05)；且隨著姜黃素濃度的增加，宮頸癌干細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高(P均<0.05)。CC60組直徑大于100 μm的干細(xì)胞球個(gè)數(shù)少于對(duì)照組(P<0.05)，干細(xì)胞比例低于對(duì)照組(P<0.05)。BV+CC組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組、BV組、CC組(P均<0.05)，CC組高于對(duì)照組、BV組(P均<0.05)，BV組高于對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論姜黃素可抑制宮頸癌干細(xì)胞增殖，降低其聚集能力，增加其對(duì)貝伐單抗的治療敏感性。

宮頸癌；宮頸癌干細(xì)胞；姜黃素；細(xì)胞增殖；細(xì)胞聚集；貝伐單抗；治療敏感性

宮頸癌是發(fā)病率僅次于乳腺癌的女性惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年升高，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[1]。目前宮頸癌新藥的研發(fā)多側(cè)重于預(yù)防。雖然傳統(tǒng)放化療可部分提高宮頸癌患者的生存率、改善患者預(yù)后，但仍無法有效控制宮頸癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及治療耐藥[2，3]。貝伐單抗為一種人源單克隆抗體，可通過抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的活性而抑制血管生成。貝伐單抗單用或與其他化療藥物聯(lián)用可減少腫瘤血管生成，治療轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性宮頸癌療效顯著，但易耐藥[4，5]。腫瘤干細(xì)胞是一類富有廣泛增殖和形成腫瘤能力的細(xì)胞，是腫瘤發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及治療耐藥的根本原因[6，7]。研究顯示，宮頸癌干細(xì)胞具有極強(qiáng)的自我更新、不斷增殖和體內(nèi)成瘤能力。CD133+是常見的宮頸癌干細(xì)胞流式分選的分子標(biāo)志物[8]。姜黃素是從姜黃根莖提取物中分離得到的一種多酚類化合物，具有顯著的抗腫瘤作用，可抑制轉(zhuǎn)移性宮頸癌細(xì)胞增殖遷移、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、降低宮頸癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力[9，10]。但關(guān)于姜黃素對(duì)宮頸癌干細(xì)胞的作用鮮有報(bào)道。2015年7月～2017年5月，本研究探討姜黃素對(duì)宮頸癌干細(xì)胞增殖、聚集和化療敏感性的影響，以期為宮頸癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、治療耐藥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料來源 人宮頸癌細(xì)胞CASKI(用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、飽和濕度、含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，貼壁后用流式細(xì)胞儀分選CD133+的宮頸癌干細(xì)胞)由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院生化細(xì)胞所提供。姜黃素液(按2 g/mL溶于二甲基亞砜后保存于4 ℃冰箱，使用時(shí)用培養(yǎng)基分別稀釋成10、20、40、60、80和100 mg/mL)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。貝伐單抗(按10 mg/mL溶于二甲基亞砜后保存于4 ℃冰箱)購(gòu)于Roche公司；FITC標(biāo)記CD133抗人抗體購(gòu)于美國(guó)BD公司；細(xì)胞培養(yǎng)所用的試劑均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Multiskan Ascent酶標(biāo)儀(型號(hào)413MBY042078)、奧林巴斯倒置顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司，BD FACSAriaTM流式細(xì)胞分選儀購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2 宮頸癌干細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用MTT法。將宮頸癌干細(xì)胞隨機(jī)分為七組，CC10組、CC20組、CC40組、CC60組、CC80組及CC100組分別給予終濃度為10、20、40、60、80、100 mg/mL姜黃素，對(duì)照組給予培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取各組細(xì)胞以1×103/孔接種于低吸附的96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞匯合度接近90%時(shí)，每孔加入滅菌MTT液30 μL。37 ℃孵育4 h后每孔中加入DMSO 150 μL，低速振蕩10 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。計(jì)算姜黃素對(duì)宮頸癌干細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)，IC50=57.23 mg/mL。

1.3 宮頸癌干細(xì)胞聚集能力檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)照組、CC60組(因60 mg/mL最接近姜黃素的IC50)細(xì)胞用無血清養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)1周富集宮頸癌干細(xì)胞。無血清培養(yǎng)基由DMEM-F12(1∶1)500 mL、B27(1∶50)10 mL、20 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子1 mL、20 ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子500 μL組成。200倍奧林巴斯倒置顯微鏡(OLYMPUS IX71)下觀察細(xì)胞聚集成球情況。隨機(jī)取3個(gè)視野進(jìn)行拍照，統(tǒng)計(jì)直徑大于100 μm的干細(xì)胞球個(gè)數(shù)，取平均值。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)宮頸癌干細(xì)胞比例。

1.4 宮頸癌干細(xì)胞貝伐單抗敏感性檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。將宮頸癌干細(xì)胞隨機(jī)分為BV組、CC組、BV+CC組、對(duì)照組，分別加入終濃度10 mg/mL貝伐單抗、60 mg/mL姜黃素、10 mg/mL BV+60 mg/mL姜黃素、培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)算細(xì)胞凋亡率。操作按流式細(xì)胞儀說明書進(jìn)行。以上重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)宮頸癌干細(xì)胞增殖能力的影響 對(duì)照組、CC10組、CC20組、CC40組、CC60組、CC80組、CC100組細(xì)胞增殖抑制率分別為27.52%±2.68%、40.18%±1.70%、47.41%±1.68%、55.49%±1.98%、77.02%±3.55%、93.02%±1.40%。CC10組、CC20組、CC40組、CC60組、CC80組、CC100組細(xì)胞增殖抑制率均高于對(duì)照組(P均<0.05)。且隨著姜黃素濃度的增加，宮頸癌干細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高(P均<0.05)。

2.2 姜黃素對(duì)宮頸癌干細(xì)胞聚集的影響 對(duì)照組、CC60組直徑大于100 μm的干細(xì)胞球個(gè)數(shù)分別為143、84個(gè)/視野。CC60組直徑大于100 μm的干細(xì)胞球個(gè)數(shù)少于對(duì)照組(P<0.05)；對(duì)照組、CC60組宮頸癌干細(xì)胞比例分別為3.47%±0.06%、1.23%±0.09%，CC60組宮頸癌干細(xì)胞比例低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3 姜黃素對(duì)宮頸癌干細(xì)胞貝伐單抗敏感性的影響 BV組、CC組、BV+CC組、對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為4.63%±0.47%、37.70%±1.09%、53.44%±1.98%、0.00 17%±0.00 07%。BV+CC組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組、BV組、CC組(P均<0.05)，CC組高于對(duì)照組、BV組(P均<0.05)，BV組高于對(duì)照組(P均<0.05)。

3 討論

研究顯示，腫瘤干細(xì)胞是維持腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的根本原因[6]，其具有先天耐藥性，是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因[7]。因此腫瘤干細(xì)胞是腫瘤治療的重要靶標(biāo)，尋找可直接或間接作用于腫瘤干細(xì)胞的藥物是治療腫瘤的有效策略。CD133是宮頸癌、前列腺和黑素瘤等多種腫瘤的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志之一[8]。因此，本研究以CD133為分子標(biāo)志物分選宮頸癌干細(xì)胞，后經(jīng)無血清懸浮培養(yǎng)法富集宮頸癌干細(xì)胞。

藥理學(xué)研究顯示，姜黃素具有抗腫瘤和殺滅腫瘤干細(xì)胞的作用[11]，可增加直腸癌CD133+腫瘤干細(xì)胞的放療敏感性[12]，姜黃素可抑制肝癌細(xì)胞增殖，并可通過調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3的磷酸化而干預(yù)肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)[13]。本研究結(jié)果顯示，隨著姜黃素濃度的增加宮頸癌干細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，與姜黃素對(duì)肺癌干細(xì)胞的增殖抑制作用類似，說明姜黃素也可抑制宮頸癌干細(xì)胞的增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)，姜黃素可顯著降低宮頸癌干細(xì)胞成球能力，該結(jié)果與相關(guān)研究[13]類似。表明姜黃素在宮頸癌干性維持中發(fā)揮重要作用，可能抑制宮頸癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。

貝伐單抗是治療復(fù)發(fā)性宮頸癌的有效藥物，但使用范圍仍有局限性，且已有研究顯示部分患者對(duì)貝伐單抗耐藥[4，5]。本研究檢測(cè)貝伐單抗單獨(dú)使用、姜黃素單獨(dú)使用、貝伐單抗聯(lián)合姜黃素使用時(shí)宮頸癌干細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果經(jīng)貝伐單抗聯(lián)合姜黃素組干預(yù)的細(xì)胞凋亡率最高，該結(jié)果與相關(guān)研究[12]具有相似性。說明姜黃素也可增加宮頸癌干細(xì)胞對(duì)貝伐單抗治療的敏感性，可能具有抑制宮頸癌干細(xì)胞耐藥的作用。

綜上所述，姜黃素可顯著抑制宮頸癌干細(xì)胞的增殖和成球能力，并可增強(qiáng)宮頸癌干細(xì)胞對(duì)貝伐單抗的治療敏感性。姜黃素可能在宮頸癌干細(xì)胞的干性維持、宮頸癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和治療耐藥中發(fā)揮重要作用，有潛力成為宮頸癌治療的輔助藥物。

[1] Shi JF, Canfell K, Lew JB, et al. The burden of cervical cancer in china synthesis of the evidence[J]. Br J cancer, 2012,130(3):641-652.

[2] Eskander RN, Tewari KS. Chemotherapy in the treatment of metastatic,persistent,and recurrent cervical cancer[J]. Curr Opin Obstet Gynecol, 2014,26(4):314-321.

[3] 劉煥芝.宮頸癌的治療進(jìn)展[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥,2010,17(25):19-20.

[4] Monk BJ, Sill MW, Burger RA, et al. PhseⅡ trial of bevacizumab in the treatment of persistent or recurrent squamous cell carcinoma of the cervix: a gynecologic oncology group study[J]. J Clin Oncol, 2009,27(7):1069-1074.

[5] Panares RL, Garcia AA. Bevacizumab in the management of solidtumors[J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2007,7(4):433-445.

[6] Dalerba P, Clarke M. Cancer stem cells and tumor metastasis:first steps into uncharted territory[J]. Cell Stem Cell, 2007,1(3):241-242.

[7] Shimono Y, Zabala M, Cho R, et al. Downregulation of miRNA-200c links breast cancer stem cells with normal stem cells[J]. Cell, 2009,138(3):592-603.

[8] 靳榮,李紅芳.泛素水解酶22siRNA對(duì)宮頸癌CD133+宮頸癌干細(xì)胞增殖和侵襲的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào),2016,37(1):48-53.

[9] 李牧,王麗,劉海莉,等.姜黃素通過降低一氧化氮合酶水平抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,33(12):1752-1756.

[10] 游贛花,羅俊,潘年松,等.姜黃素對(duì)宮頸癌荷瘤裸鼠的作用及機(jī)制研究[J].華西藥學(xué)雜志,2014,29(6):654-656.

[11] Yu X, Zhong J, Yan L, et al. Curcumin exerts antitumor effects in retinoblastoma cells by regulating the JNK and p38 MAPK pathways[J]. Int J Mol Med, 2016,38(3):861-868.

[12] 舒小鐳,何笑冬,李倩,等.姜黃素對(duì)直腸癌CD133+腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞群放療敏感性的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2014,35(4):1013-1015.

[13] 王斌,潘戰(zhàn)宇,閆祝辰,等.姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMCC-7721增殖及干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響及機(jī)制[J].河北中醫(yī),2016,38(12):1778-1783.

Effectsofcurcuminoncellproliferation,aggregation,andchemosensitivityofcervicalcancerstemcells

ZHANGYanhua1,GAOYan'e,ZANGRui,YANGHongmei

(1Xi'an630Hospital,Xi'an710000,China)

ObjectiveTo explore the effects of curcumin on the cell proliferation, aggregation, and the sensitivity to bevacizumab of cervical cancer stem cells.MethodsThe CD133+cervical cancer stem cells (CCSCs) were isolated from CASKI cells by flow cytometry. The CCSCs were divided into seven groups: CC10 group, CC20 group, CC40 group, CC60 group, CC80 group, and CC100 group which were given a final concentration of 10, 20, 40, 60, 80 and 100 mg/mL curcumin, while cells in the control group were given the same amount of solvent and culture medium. The inhibition rate of cell proliferation in each group was detected by MTT. The cells in the control group and CC60 group were cultured in serum-free medium for 1 week. The number of stem cell spheres with diameter greater than 100 μm was counted by light microscope, and the proportion of CD133+cells was detected by flow cytometry. The cervical cancer stem cells were divided into four groups, BV group (added with bevacizumab 10 mg/mL), CC group (added with 60 mg/mL curcumin), BV+CC group (added with 10 mg/mL bevacizumab and 60 mg/mL curcumin), and the control group (treated with the same amount of solvent and medium). After 48-hour culture, the apoptosis rate was determined by flow cytometry.ResultsThe rates of cell proliferation inhibition in the CC10 group, CC20 group, CC40 group, CC60 group, CC80 group, and CC100 group were higher than that of the control group (allP<0.05), and with the increase of curcumin concentration, the proliferation inhibition rate of cervical cancer stem cells gradually increased (allP<0.05). The number of stem cell spheres with diameter greater than 100 μm of the CC60 group was less than that of the control group (P<0.05). The proportion of cervical cancer stem cell in the CC60 group was lower than that in the control group (P<0.05). The apoptosis rate in the BV+CC group was higher than that in the control group, BV group, and CC group (P<0.05), the apoptosis rate in the CC group was higher than that in the control group and BV group (P<0.05), and the apoptosis rate in the BV group was higher than that in the control group (P<0.05).ConclusionCurcumin can inhibit the proliferation and decrease the stem cell aggregation of CCSCs and increase the sensitivity of CCSCs to bevacizumab.

cervical carcinoma; cervical cancer stem cells; curcumin; cell proliferation; cell aggregation; bevacizumab; treatment sensitivity

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.37.005

R737.33

A

1002-266X(2017)37-0015-03

陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2016JM8067)。

張燕華(1969-)，女，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)閶D科腫瘤及婦科內(nèi)分泌。E-mail：xi_an630@qq.com

2017-07-08)