曹珍，高玉雪，徐金媛，王茹燕，李峰，朱學(xué)濤，史立宏，呂世軍

(濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261000)

遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞侵襲的抑制作用及機(jī)制

曹珍，高玉雪，徐金媛，王茹燕，李峰，朱學(xué)濤，史立宏，呂世軍

(濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261000)

目的探討遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞侵襲的抑制作用及其機(jī)制。方法將培養(yǎng)好的小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1隨機(jī)分為A、B、C、D組。A組常規(guī)培養(yǎng)；B、C、D組于缺氧條件下(37 ℃、5% CO、95% N2)進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)C、D組分別加入0.1、0.5 μmol/L遠(yuǎn)華蟾毒精進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)0、6、12、24 h采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力(遷移距離)，用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力(穿膜細(xì)胞數(shù))，用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)及磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)蛋白表達(dá)。結(jié)果不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞遷移距離D組

乳腺癌；遠(yuǎn)華蟾毒精；細(xì)胞侵襲；4T1細(xì)胞；中藥

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系最密切的一類蛋白水解酶[1，2]。在腫瘤微環(huán)境中，缺氧是促進(jìn)腫瘤增殖侵襲的主要因素。缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧條件的反應(yīng)，其在缺氧條件下才可以穩(wěn)定表達(dá)[3，4]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路之一，參與多種重要生物學(xué)過程的調(diào)控。其通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。有研究表明，蟾酥可抑制肺癌細(xì)胞生長和侵襲，但未證明是其中哪種單體化合物具有該作用[6]。本課題組發(fā)現(xiàn)，蟾酥中提取的單體化合物遠(yuǎn)華蟾毒精可明顯抑制小鼠乳腺癌細(xì)胞的非定向遷移、定向趨化運(yùn)動(dòng)和對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的侵襲，而其分子作用機(jī)制尚不清楚。2015年9月～2016年12月，本研究對(duì)此進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑來源 小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1由濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心提供。遠(yuǎn)華蟾毒精購自上海晶都生物技術(shù)有限公司、兔抗MMP-2單抗、兔抗MMP-9單抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗HIF-1α單抗、兔抗磷酸化的PI3K及磷酸化的AKT單抗購自美國Santa Cruz公司；RPMI1640培養(yǎng)基和類胎牛血清購自美國Hyclone公司；Transwell小室、細(xì)胞培養(yǎng)板購自Sigma公司；Matrigel購自BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物濃度確定及細(xì)胞分組 將4T1細(xì)胞于37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞接種于96孔板常規(guī)培養(yǎng)24 h，分別加入濃度0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5 μmol/L遠(yuǎn)華蟾毒精再孵育24 h，每孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔波長490 nm處的吸光度值。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。通過細(xì)胞生長曲線可見0.5 μmol/L濃度內(nèi)的遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)細(xì)胞增殖影響較小，大于該濃度時(shí)明顯抑制細(xì)胞增殖。確定遠(yuǎn)華蟾毒精實(shí)驗(yàn)濃度為0.1、0.5 μmol/L。將培養(yǎng)好的細(xì)胞隨機(jī)分為A、B、C、D組。A組常規(guī)培養(yǎng)；B、C、D組于缺氧條件下(37 ℃、5% CO、95% N2)進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)C、D組分別加入0.1、0.5 μmol/L遠(yuǎn)華蟾毒精進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 4T1細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用劃痕實(shí)驗(yàn)。各組細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)，每個(gè)孔平行劃三道痕。分別于培養(yǎng)0、6、12、24 h在低倍鏡(×100)下拍照，統(tǒng)計(jì)每孔不同時(shí)間點(diǎn)劃痕距離。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 4T1細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。取各組細(xì)胞，按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行操作，24 h后將小室置于高倍鏡下觀察拍照，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野下穿過人工基膜的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 4T1細(xì)胞HIF-1α、MMP-9、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，裂解，提取細(xì)胞總蛋白，制備凝膠，各組加入等量蛋白后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、滴加一抗MMP-2、MMP-9、HIF-1α、p-PI3K、p-Akt孵育過夜，二抗孵育后化學(xué)發(fā)光劑顯影，曝光。目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量=(目標(biāo)蛋白條帶灰度值-內(nèi)參蛋白條帶灰度值)/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)4T1細(xì)胞遷移能力的影響 藥物干預(yù)0、6、12、24 h，A組遷移距離分別為(2.6±0.56)、(2.8±0.42)、(3.0±0.37)、(3.3±0.51)μm；B組分別為(3.0±0.43)、(3.4±0.55)、(3.7±0.39)、(3.9±0.48)μm；C組分別為(2.4±0.36)、(2.6±0.33)、(3.0±0.52)、(3.2±0.47)μm；D組分別為(1.5±0.57)、(1.7±0.53)、(1.6±0.49)、(1.8±0.46)μm。不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞遷移距離D組

2.2 遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)4T1細(xì)胞侵襲能力的影響 藥物干預(yù)24 h，A組穿膜細(xì)胞數(shù)為65個(gè)/5個(gè)視野，B組為70個(gè)/5個(gè)視野，C組為50個(gè)/5個(gè)視野，D組為30個(gè)/5個(gè)視野。穿膜細(xì)胞數(shù)D組

2.3 遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)4T1細(xì)胞HIF-1α、MMP-9、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)的影響 藥物干預(yù)24 h，A組HIF-1α、MMP-9、p-PI3K、p-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.0±0.12、1.0±0.09、0.8±0.06、0.7±0.06；B組分別為1.0±0.13、1.8±0.15、4.0±0.22、2.6±0.18；C組分別為0.6±0.05、0.6±0.04、0.5±0.07、0.4±0.09；D組分別為0.2±0.04、0.1±0.03、0.1±0.02、0.2±0.03。HIF-1α、MMP-9、p-PI3K、p-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量D組

3 討論

研究表明，蟾酥具有確切的抗腫瘤活性，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化，還有逆轉(zhuǎn)耐藥性、抑制腫瘤血管形成及增強(qiáng)免疫等作用[8，9]。遠(yuǎn)華蟾毒精是蟾酥提取物，可抑制癌細(xì)胞的生長，使荷瘤小鼠存活時(shí)間延長。本品可抑制腫瘤細(xì)胞惡液質(zhì)的產(chǎn)生，亦可抑制惡液質(zhì)素對(duì)正常細(xì)胞的影響，從而預(yù)防腫瘤患者惡液質(zhì)。遠(yuǎn)華蟾蜍精中的途氧化苦參堿有抗乙型肝炎病毒的作用，可降低乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟內(nèi)HBsAg和HBcAg的含量，且對(duì)兩者作用一致，無選擇性。氧化苦參堿是一種較強(qiáng)的免疫抑制劑，可以抑制多種炎性因子的釋放，有明確的抗炎作用。本研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)華蟾毒精可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖與侵襲。

研究表明，在人類很多常見的惡性腫瘤和癌前病變組織中均有不同程度的HIF-1表達(dá)，而在其相應(yīng)的正常組織中表達(dá)變化并不明顯。HIF-1普遍存在于人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，常氧下也有表達(dá)，但合成的HIF-1蛋白很快即被細(xì)胞內(nèi)氧依賴性泛素蛋白酶降解途徑所降解，只有在缺氧條件下HIF-1才可穩(wěn)定表達(dá)[10]。HIF-1β亞基在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定表達(dá)，而HIF-1α亞基在翻譯后即被泛素蛋白酶水解復(fù)合體降解。因此，在正常氧飽和度下的細(xì)胞中基本檢測(cè)不到亞基的表達(dá)；而在缺氧狀態(tài)下，僅亞基的降解被抑制，1α和β亞基形成有活性的HIF-1α，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄。因此本研究設(shè)計(jì)在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞有利于HIF-1α的穩(wěn)定表達(dá)，經(jīng)檢測(cè)其在缺氧環(huán)境下高表達(dá)，經(jīng)遠(yuǎn)華蟾毒精干預(yù)后HIF-1α表達(dá)降低，驗(yàn)證了遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)HIF-1α的抑制作用。

MMP是一個(gè)大家族，因其需要Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名。MMP幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分(明膠、纖維蛋白及基底膜Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型膠原)，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞浸潤結(jié)締組織基質(zhì)，侵入小血管和淋巴管，可見其在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是該過程中主要的蛋白水解酶[11，12]。MMP家族已分離鑒別出26個(gè)成員，根據(jù)作用底物以及片斷同源性，將MMP分為6類，明膠酶為其中重要的一類。明膠酶主要分為兩個(gè)亞型，一種被糖化，為MMP-9；另一種非糖化，為MMP-2。MMP-9與MMP-2在細(xì)胞外基質(zhì)降解中起關(guān)鍵作用，因而與乳腺腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系密切[13]。本研究也驗(yàn)證了MMP-9作為HIF-1α的下游因子在乳腺癌細(xì)胞中異常表達(dá)，遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)MMP-9表達(dá)有抑制作用。

PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路與乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且只有在磷酸化時(shí)才發(fā)揮作用。PI3K磷脂?；际钦婧松锛?xì)胞膜的組成部分，PI3K激活可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長、抗凋亡。Akt是一種蘇氨酸/絲氨酸激酶，是PI3K下游的主要效應(yīng)分子之一，PI3K/Akt信號(hào)通路在人類很多惡性腫瘤(乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和胰腺癌等)中都可以被激活，且乳腺癌中這條信號(hào)通路的活化高達(dá)70%[14]。本研究檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt在缺氧環(huán)境下表達(dá)增加，經(jīng)遠(yuǎn)華蟾毒精干預(yù)后表達(dá)降低，說明遠(yuǎn)華蟾毒精可能通過PI3K/Akt通路發(fā)揮作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)遠(yuǎn)華蟾毒精通過PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制HIF-1α 、MMP-9蛋白的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

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InhibitoryeffectofYuanhuatoadpoisonfineoninvasionofmousebreastcancercells

CAOZhen,GAOYuxue,XUJinyuan,WANGRuyan,LIFeng,ZHUXuetao,SHILihong,LYUShijun

(WeifangMedicalUniversity,Weifang261000,China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect and mechanism of Yuanhua toad poison fine on the invasion of mouse breast cancer cells.MethodsThe cultured mouse breast cancer cells 4T1 were randomly divided into groups A, B, C, and D. Cell in the group A

the conventional culture; cells in the groups B, C, and D were cultured under the hypoxic conditions (at 37 ℃, 5% CO and 95% N2); while cells in the groups C and D were added with 0.1 and 0.5 mol/L Yuanhua toad poison fine culture. At 0, 6, 12, and 24 h, the cell migration ability was examined by Scratch test (migration distance); the invasive ability was detected by Transwell invasion test (Number of cells through die); the relative expression levels of HIF-1α, matrix metalloproteinase 9 (MMP-9), phosphoinositide 3-kinase (PI3K), and p-Akt protein were detected by Western blotting.ResultsThe migration distance of each group at different time points was in the following order: group D< group C< group B< group A, the number of transmembrane cells: group D< group C< group B< group A, the expression of HIF-1α, MMP-9, p-PI3K, and p-Akt protein: group D< group C< group B< group A, and the differences in the above indexes were statistically significant between these two groups (allP<0.05).ConclusionYuanhua toad poison fine can decrease the expression of HIF-1α and MMP-9 through the PI3K/AKT pathway, thereby inhibiting the invasion of breast cancer cells.

breast carcinoma; Yuanhua toad poison fine; cell invasion; 4T1 cells; traditional Chinese medicine

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.37.006

R737.9

A

1002-266X(2017)37-0018-03

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H1622)。

曹珍(1991-)，女，在讀碩士，主要研究方向?yàn)槿橄侔┑那忠u與轉(zhuǎn)移。E-mail:2425278948@qq.com

呂世軍(1961-)，男，博士，教授，主要研究方向?yàn)槿橄侔┑那忠u與轉(zhuǎn)移。E-mail:sjlu@wfmc.edu.cn

2017-06-10)