闞東方，季旭明，陳倩，2，韓曉春，武繼彪

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南250355；2山東醫(yī)藥技師學(xué)院)

大黃含藥血清對乳鼠原代肝細(xì)胞能量代謝的影響

闞東方1，季旭明1，陳倩1，2，韓曉春1，武繼彪1

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南250355；2山東醫(yī)藥技師學(xué)院)

目的探討大黃含藥血清對乳鼠原代肝細(xì)胞能量代謝的影響。方法制備大黃含藥血清；以膠原酶消化法獲取乳鼠原代肝細(xì)胞，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白血清組、含藥血清組，分別用20%空白血清培養(yǎng)液、20%大黃含藥血清培養(yǎng)液干預(yù)24 h。采用生化法檢測細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)酶活性，高效液相色譜法檢測細(xì)胞內(nèi)ATP含量及細(xì)胞能荷，羅丹明123熒光染色法檢測細(xì)胞線粒體膜電位。結(jié)果與空白血清組比較，含藥血清組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性低(P均<0.05)，ATP含量低(P<0.05)，兩組能荷比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與空白血清組比較，含藥血清組細(xì)胞線粒體膜電位低(P<0.05)。結(jié)論大黃含藥血清可能通過調(diào)整乳鼠原代肝細(xì)胞線粒體功能來抑制其能量代謝，降低其能量儲備。

肝細(xì)胞；能量代謝；大黃含藥血清；中藥；大鼠

大黃味苦、性寒，有瀉熱通腸、涼血解毒等功效，廣泛應(yīng)用于熱證的治療?，F(xiàn)代研究表明，中藥的寒熱藥性與能量代謝密切相關(guān)[1]。本課題組前期有關(guān)能量代謝的研究主要集中于動物體內(nèi)實驗，涉及寒熱性中藥對體溫、耗氧量、超氧化物歧化酶、琥珀酸脫氫酶等基礎(chǔ)指標(biāo)的影響，并從攝入能、消化能、肝組織能荷等方面進(jìn)行探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃可降低大鼠肝組織ATP酶含量及活性。通過對大黃水煎液和大黃含藥血清指紋圖譜分析，證實大黃含藥血清含有大黃的主要成分大黃素[2]。2016年10月～2017年1月，本研究用大黃含藥血清對乳鼠原代肝細(xì)胞進(jìn)行體外干預(yù)，從細(xì)胞水平反映寒性中藥大黃對能量代謝的影響，為進(jìn)一步研究寒熱藥性對能量代謝的影響機(jī)制提供細(xì)胞模型及理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器來源 雄性SD大鼠20只[體質(zhì)量(250±20)g]、SD乳鼠(3～5日齡)20只由山東中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。大黃，產(chǎn)地甘肅岷縣(掌葉大黃)，經(jīng)鑒定為蓼科植物掌葉大黃的根莖。DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國GIBICO公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；膠原酶Ⅳ、羅丹明123、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司；超微量ATP酶測試盒購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白測定試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；乙腈購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。超聲波細(xì)胞破碎儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司；紫外可見分光光度計購自上海元析儀器有限公司；激光共聚焦顯微鏡(LSM 510)購自德國蔡司公司；高效液相色譜儀等購自美國安捷倫公司。

1.2 大黃含藥血清制備[3]大黃制成2.7 g/mL水煎液。20只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)取10只給予10 mL/kg生理鹽水灌胃，另外10只給予10 mL/kg大黃水煎液灌胃，2次/d，連續(xù)3 d。末次給藥前12 h禁食，末次給藥后1 h用10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，無菌分離血清；56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm濾器過濾除菌分裝，-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?0%大黃含藥血清培養(yǎng)液配制：DMEM高糖培養(yǎng)液39.5 mL加入大黃含藥血清10 mL、青霉素-鏈霉素混合液0.5 mL混勻。20%空白血清培養(yǎng)液配制：DMEM高糖培養(yǎng)液39.5 mL加入空白血清10 mL、青霉素-鏈霉素混合液0.5 mL混勻。

1.3 乳鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)[4，5]及藥物處理 75%乙醇擦拭乳鼠，超凈工作臺內(nèi)冰盤下斷頭取肝臟，剝除包膜和結(jié)締組織，PBS清洗后剪切成1 mm3大小的組織塊，PBS再次吹打清洗后加入0.2%的膠原酶，于4 ℃冰箱靜置消化過夜。加完全培養(yǎng)液2 mL終止消化后用吸管吹打，吹打后的懸液200目尼龍網(wǎng)過濾，4 ℃冰箱靜置20 min，棄懸液。加入完全培養(yǎng)液1 mL，1 000 r/min離心5 min，棄上清。重復(fù)離心3次后將吹打均勻的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6～10 h 內(nèi)對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行第1次換液，培養(yǎng)24 h細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%后隨機(jī)分為含藥血清組和空白血清組，分別用20%大黃含藥血清培養(yǎng)液和20%空白血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用于指標(biāo)檢測。

1.4 肝細(xì)胞內(nèi)ATP酶活性測定 收集兩組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞為1×107/mL，超聲波細(xì)胞破碎儀破碎后用于試劑盒檢測。經(jīng)用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，以每小時每毫克蛋白中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的量為1個ATP酶活力單位。

1.5 肝細(xì)胞內(nèi)ATP含量及能荷測定 色譜條件：流動相：乙腈(A)-50 mmol/L磷酸鈉(磷酸調(diào)pH=7)、10 mmol/L四丁基溴化銨(B)，VA∶VB=5∶95；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃。

樣本處理：用直徑10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞，血清干預(yù)24 h后，4 ℃ PBS沖洗2遍，盡量棄凈PBS，秤培養(yǎng)皿重量；胰酶消化，4 ℃、1 000 r/min離心，棄上清，加入0.5 mol/L冰冷高氯酸500 μL，輕柔混勻后迅速置于液氮中保存；再次秤培養(yǎng)皿重量，計算重量差值。將樣本從液氮中取出冰上溶解，超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清；加入1 mol/L NaOH調(diào)pH至中性，再次4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清，-20 ℃保存。檢測前0.22 μm濾膜過濾。對照品制備：精密稱取對照品ATP、ADP、AMP適量，加流動相分別溶解至0.05、0.03、0.06 mg/mL，4 ℃儲存?zhèn)溆?。ATP、ADP、AMP含量=(樣品峰面積×對照品的濃度)/(對照品峰面積×樣品濃度)；能荷=(ATP+0.5×ADP)/(ATP+ADP+AMP)

1.6 肝細(xì)胞線粒體膜電位測定 取兩組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，用PBS緩沖液沖洗后每孔中滴加10 μg/mL羅丹明工作液200 μL避光孵育30 min；去除工作液，PBS沖洗后加入培養(yǎng)液200 μL，避光室溫放置30 min，激光共聚焦顯微鏡觀察染色細(xì)胞的形態(tài)。以熒光強(qiáng)度表示線粒體膜電位。

2 結(jié)果

2.1 大黃含藥血清對原代肝細(xì)胞ATP酶活性的影響 空白血清組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性分別為(1.59±0.015)、(1.62±0.060)U/(mgprot·mL)；含藥血清組分別為(1.14±0.081)、(0.57±0.066)U/(mgprot·mL)。與空白血清組比較，含藥血清組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性低(P均<0.05)。

2.2 大黃含藥血清對原代肝細(xì)胞ATP含量及能荷的影響 空白血清組ATP含量為(1.32±0.170)μg/g、能荷為0.228±0.074；含藥血清組分別為(0.95±0.324)μg/g、0.155±0.029。與空白血清比較，含藥血清組ATP含量低(P<0.05)；兩組能荷比較，P均>0.05。

2.3 大黃含藥血清對原代肝細(xì)胞線粒體膜電位(熒光強(qiáng)度)的影響 空白血清組熒光強(qiáng)度為92.6±6.431、含藥血清組為78.9±5.603，與空白血清組比較，含藥血清組熒光強(qiáng)度低(P<0.05)。

3 討論

大黃是寒性中藥的代表藥。課題組前期通過體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)大黃可降低大鼠肝組織ATP酶活力，減少肝組織ATP含量及能荷；并通過基因組學(xué)證實大黃通過調(diào)控機(jī)體防御反應(yīng)及花生四烯酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)抑制機(jī)體能量代謝，降低能量儲備[6]。前期研究采用中藥圖譜指紋技術(shù)證實大黃含藥血清含有大黃主要成分大黃素，可替代中藥水煎液用于體外實驗，避免了中藥水煎液酸堿度、滲透壓等因素對實驗結(jié)果的干擾。機(jī)體能量代謝和藥物代謝主要發(fā)生在肝臟，與永生化的大鼠肝細(xì)胞株相比，大鼠原代肝細(xì)胞保留了肝細(xì)胞原有的特性和代謝酶類，具有與在體動物實驗?zāi)Ｐ拖嗨频乃幮гu價能力[7]。

能量代謝包括能量的合成與分解。ATP是生物體能量的“通用貨幣”，其生成和消耗情況將直接反映機(jī)體能量代謝水平的高低。ATP酶是存在于細(xì)胞器生物膜的蛋白酶，在將ATP催化水解為ADP和磷酸根離子并釋放大量能量的同時維持著細(xì)胞內(nèi)外離子濃度。其活性升高伴隨著ATP消耗增加。故兩者均為衡量能量代謝水平以及線粒體功能的重要指標(biāo)。本研究中大黃含藥血清干預(yù)后的肝細(xì)胞兩種ATP酶活性均顯著降低，提示寒性中藥大黃降低了細(xì)胞的能量消耗。細(xì)胞內(nèi)ATP含量的變化直接反映了細(xì)胞的能量儲備。細(xì)胞內(nèi)ATP含量受兩個因素的調(diào)控，即氧化磷酸化合成ATP的能力和細(xì)胞利用ATP的能力。經(jīng)大黃含藥血清干預(yù)后的肝細(xì)胞在ATP消耗減少的前提下，細(xì)胞內(nèi)ATP含量仍較空白血清組明顯降低，提示細(xì)胞內(nèi)ATP的生成受到明顯抑制，說明大黃從分子水平抑制能量的合成。細(xì)胞能荷是指在總的腺苷酸中所負(fù)荷的高能磷酸基總量，是反應(yīng)細(xì)胞能量生成和利用的平衡狀態(tài)的指標(biāo)。本研究中大黃含藥血清干預(yù)后的肝細(xì)胞能荷有下降趨勢，但與空白血清組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮可能與ATP減少的同時ADP、AMP相對增高及藥物干預(yù)時間較短，細(xì)胞能量生成和利用尚未進(jìn)入失代償階段有關(guān)。

線粒體是細(xì)胞能量產(chǎn)生和供應(yīng)的主要場所，其氧化磷酸化產(chǎn)生了機(jī)體80%的ATP[8]。線粒體膜電位的穩(wěn)定是氧化磷酸化過程的必要條件[9]，因此線粒體膜電位是評價線粒體功能的關(guān)鍵指標(biāo)，可單獨用來衡量線粒體產(chǎn)能狀態(tài)。本研究中含藥血清組肝細(xì)胞線粒體膜電位較空白血清組下降，提示大黃可能通過影響線粒體功能抑制了ATP的產(chǎn)生。肝細(xì)胞線粒體膜電位下降可能與以下因素有關(guān)：一是大黃抑制氧化呼吸鏈活性，導(dǎo)致線粒體內(nèi)外膜兩側(cè)的電位差下降，從而使線粒體膜電位下降。二是大黃通過某種途徑抑制了ATP合成酶活性。因ATP合成酶的F0亞基能夠讓線粒體內(nèi)膜外側(cè)的H+回流，進(jìn)而推動合成ATP。當(dāng)ATP合成酶活性下降時，線粒體內(nèi)膜外側(cè)的H+回流減少，線粒體膜電位下降，ATP合成減少[10]。本研究結(jié)果表明，大黃含藥血清顯著減少大鼠原代肝細(xì)胞能量儲備，降低細(xì)胞能量代謝。以往中藥藥性與能量代謝相關(guān)的研究主要集中在動物模型及體內(nèi)實驗，采用含藥血清干預(yù)原代細(xì)胞建立模型進(jìn)行藥物寒熱藥性及能量代謝研究鮮有報道，因此可采用上述方法建立細(xì)胞寒證模型，為體外進(jìn)行寒熱藥性對能量代謝的影響搭建細(xì)胞平臺，有利于體外高通量進(jìn)行寒熱藥的能量代謝研究，進(jìn)一步闡示寒熱藥性的本質(zhì)及性效發(fā)生規(guī)律，為更好地指導(dǎo)臨床用藥奠定基礎(chǔ)。

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EffectofserumcontainingDahuang(rhubarb)onenergymetabolismofratprimaryhepatocytes

KANDongfang1,JIXuming,CHENQian,HANXiaochun,WUJibiao

(1CollegeofTraditionalChineseMedicine,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China)

ObjectiveTo observe the effect of serum containing Dahuang (rhubarb) on energy metabolism of rat primary hepatocytes.MethodsMedicated serum was prepared on SD rats. Hepatocytes were isolated from SD neonatal rats by collagenase digestion and then were randomly divided into the blank serum group and medicated serum group. Cells in the two groups were cultured with 20% blank serum and 20% serum containing Dahuang (rhubarb) for 24 hours, respectively. The activities of Na+-K+-ATPase, and Ca2+-Mg2+-ATPase were detected with spectrophotometer. The content of ATP, ADP, and AMP was tested with high performance liquid chromatography (HPLC) as well as energy charge. The mitochondrial membrane potential was analyzed with rhodamine 123 by laser confocal microscope.ResultsCompared with the blank serum group, the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase decreased (allP<0.05) and the content of ATP decreased in the medicated serum group (P<0.05). There was no significant difference in the level of energy charge between the two groups (P>0.05). Compared with the blank serum group, the mitochondrial membrane potential decreased in the medicated serum group (P<0.05).ConclusionThe serum containing Dahuang (rhubarb) may inhibit the energy metabolism and reduce the energy reserve of rat primary hepatocytes by regulating mitochondrial function.

hepatocytes; energy metabolism; serum containing Dahuang (rhubarb); traditional Chinese medicine; rats

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.37.003

R285.5

A

1002-266X(2017)37-0009-03

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2007CB512601，2013CB531803)；國家自然科學(xué)基金面上項目(81673852)；山東省重點產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)項目(2016CYJS08A01-4，2016CYJS08A01-3)。

闞東方(1984-)，女，在讀博士，主要研究方向為中藥藥性。E-mail：893181869@qq.com

武繼彪(1963-)，男，教授，主要研究方向為心腦血管疾病的防治。E-mail：wujibiao1963@163.com

2017-07-14)