徐飛 鄭秀化++李春映 施季森 甄艷

摘要：為建立適合鵝掌楸胚性愈傷大規(guī)模蛋白質(zhì)組研究，比較分析4種蛋白質(zhì)提取方案：Mg/NP-40-三氯乙酸（簡稱TCA）/丙酮、TCA/丙酮、裂解液-Clean-up、裂解液-TCA/丙酮，并進行蛋白質(zhì)的聚丙烯酰腚凝膠電泳（簡稱SDS-PAGE）和雙向電泳分析。SDS-PAGE圖譜顯示：裂解液-Clean-up、裂解液-TCA/丙酮法分離高分子量蛋白質(zhì)條帶相對于Mg/NP-40-TCA/丙酮、TCA/丙酮法少；Mg/NP-40-TCA/丙酮法和裂解液-Clean up法低分子量提取、分離效果較差。在SDS-PAGE基礎(chǔ)上對Mg/NP-40-TCA/丙酮、TCA/丙酮法提取蛋白質(zhì)樣品進行雙向電泳，結(jié)果表明：TCA/丙酮法得到的凝膠圖蛋白質(zhì)點分布均勻、背景清晰且縱橫條紋較少，且TCA/丙酮法相對于Mg/NP-40-TCA/丙酮法來說在小分子量蛋白質(zhì)、堿性蛋白質(zhì)分離方面有優(yōu)勢。同時隨機選取雙向電泳分離的蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示，TCA/丙酮法較適合鵝掌楸胚性愈傷蛋白質(zhì)組的大規(guī)模分析。

關(guān)鍵詞：鵝掌楸；愈傷組織；蛋白質(zhì)組；SDS-PAGE；雙向電泳

中圖分類號：S718.3 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0252-04

[HJ1.3mm]

收稿日期：2015-10-28

基金項目：江蘇省高校自然科學(xué)重大研究項目（編號：12KJA220002）；江蘇省政府優(yōu)勢學(xué)科（林學(xué)）建設(shè)項目。

作者簡介：徐飛（1993—），男，江蘇泰州人，研究方向為植物蛋白質(zhì)組。E-mail：1291146127@qq.com。

通信作者：甄艷，博士，副教授，研究方向為植物蛋白質(zhì)組。E-mail：zhenyongni30@aliyun.com.cn。

2005年《Science》雜志的特刊列出125個重要的科學(xué)問題，而1個體細(xì)胞如何成為1株完整的植株是其中的一個重要的科學(xué)問題[1]。體胚發(fā)生生理與分子生物學(xué)事件的研究是一個非常有趣的科學(xué)問題，胚性愈傷組織的形成是植物體胚發(fā)生的第一步，它起源于單細(xì)胞，很多具有全能性的愈傷組織可以發(fā)育成完整的植株。目前，關(guān)于胚性愈傷組織的形成機制還不清楚[2]。雜交鵝掌楸是我國著名林木遺傳育種專家葉培忠教授利用分布在我國的中國鵝掌楸和分布在北美的北美鵝掌楸通過人工雜交育成的種間雜種，具有重要的經(jīng)濟價值和社會價值[3]。南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳和生物技術(shù)省-部共建教育部重點實驗室的陳金慧教授在開展雜交鵝掌楸體胚發(fā)生和植株再生研究中已經(jīng)取得了突出的成績，并已進入商品化階段。但是目前鵝掌楸體細(xì)胞胚發(fā)生仍存在許多問題，例如：（1）胚性能力的獲得；（2）對基因型的過度依賴；（3）體細(xì)胞胚誘導(dǎo)頻率還相對較低、培養(yǎng)過程中體細(xì)胞胚發(fā)生能力可能喪失；（4）體細(xì)胞胚發(fā)生不能同步化等。蛋白質(zhì)組學(xué)是功能基因組學(xué)研究的一個重要組成部分，蛋白質(zhì)是基因表達的產(chǎn)物，是生命活動的直接執(zhí)行者和體現(xiàn)者。鵝掌楸愈傷胚性形成的蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)路及組蛋白修飾在愈傷胚性形成中起重要的作用，研究愈傷組織胚性的形成將有助于提高體胚發(fā)生的實踐操作及了解細(xì)胞全能性的基本知識。

蛋白質(zhì)樣品制備是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的第1步，也是關(guān)鍵的步驟。由于不同植物組分差異較大，且含有大量干擾物質(zhì)如核酸、多糖、酚類物質(zhì)、鹽類等，到目前為止還沒有一種提取方法適合所有植物[4-5]。蛋白質(zhì)提取過程中操作不精細(xì)或所選取的提取方法或裂解液不適合，都會造成一些蛋白質(zhì)的降解和低豐度蛋白的丟失，直接影響雙向電泳結(jié)果及后續(xù)質(zhì)譜分析。雜交鵝掌楸胚性愈傷組織及體胚材料雜質(zhì)較多，體胚屬于薄壁細(xì)胞，蛋白質(zhì)本身含量低。成功地制備樣品是鵝掌楸愈傷大規(guī)模蛋白組學(xué)研究的保證。本試驗采用4種試驗方案Mg/NP-40-三氯乙酸（簡稱TCA）/丙酮法（簡稱NP-40法）、TCA/丙酮法（簡稱TCA法）、裂解液-Clean-up法（簡稱LBCU法）、裂解液-TCA/丙酮法（簡稱LBTA法）對雜交鵝掌楸胚性愈傷進行蛋白質(zhì)提取、比較分析，以期篩選較適合雜交鵝掌楸愈傷大規(guī)模蛋白質(zhì)組分析的方法。

1材料與方法

1.1試驗材料

雜交鵝掌楸胚性愈傷來源于南京林業(yè)大學(xué)雜交鵝掌楸未成熟的種子（由南京林業(yè)大學(xué)陳金慧教授實驗室提供），雜交鵝掌楸胚性愈傷組織的建立方法見文獻[6]。

1.2試驗方法

1.2.1雜交鵝掌楸胚性愈傷蛋白質(zhì)提取方法

1.2.1.1Mg/NP-40-TCA/丙酮法參照Lee等的方法[7-8]并稍作改進。愈傷組織加少量交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（簡稱PVPP）液氮研磨，之后迅速倒入一定體積Mg/NP-40提取緩沖液（體積分?jǐn)?shù)2%的NP-40，pH值8.3的0.5 mol/L Tris-HCl，20 mmol/L MgCl2，體積分?jǐn)?shù)2%的β-巰基乙醇）中，置于冰上1 h，離心（4 ℃、12 000 g）20 min收集上清，加3倍體積的TCA/丙酮，-20 ℃沉淀過夜；之后離心（4 ℃ 12 000 g 20 min），加入3倍體積的100%丙酮洗沉淀，置于 -20 ℃ 1 h，再離心（12 000 g 4 ℃）1 h后棄上清。用-20 ℃丙酮洗沉淀，重復(fù)2次，室溫風(fēng)干。干粉中加裂解液[7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2%（質(zhì)量濃度）3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽（簡稱CHAPS），1%（質(zhì)量濃度）二硫蘇糖醇（簡稱DTT），2%兩性電解質(zhì)pharmalyte（pH值3～10）]室溫溶解2 h，12 000 g、4 ℃離心1 h收集上清液，用2-D Quant Kit（GE Healthcare）進行蛋白定量，分裝后于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2TCA/丙酮法愈傷組織加少量PVPP液氮研磨，之后迅速倒入3倍體積的10% TCA/丙酮中混勻，于-20 ℃過夜，離心（4 ℃ 12 000 g）20 min棄上清，加入3倍體積的100%丙酮重懸沉淀，在-20 ℃下?lián)u勻1 h；離心（12 000 g 4 ℃）1 h棄上清，重復(fù)2次；沉淀于室溫風(fēng)干后加裂解液，室溫裂解2 h，離心（12 000 g、4 ℃）1 h收集上清液，用2-D Quant Kit（GE Healthcare）進行蛋白定量，分裝于-70 ℃?zhèn)溆谩?

1.2.1.3裂解液-Clean-up法在愈傷組織中加少量PVPP液氮研磨，之后迅速倒入一定體積裂解緩沖液[7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2%（質(zhì)量濃度）CHAPS，1%（質(zhì)量濃度）DTT，2%兩性電解質(zhì)pharmalyte，pH值3～10]中，冰浴1 h（其間不斷混勻），之后離心（12 000 g、4 ℃）1 h收集上清，上清液用Clean-Up kit（GE Healthcare）處理。將Clean-up kit純化的蛋白質(zhì)沉淀溶于裂解緩沖液中，用2-D Quant Kit（GE Healthcare）進行蛋白質(zhì)定量，分裝后于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.4裂解液-TCA/丙酮法在愈傷組織中加少量PVPP液氮研磨，之后迅速倒入一定體積裂解液[7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2%（質(zhì)量濃度）CHAPS，1%（質(zhì)量濃度）DTT，2%兩性電解質(zhì)pharmalyte，pH值3～10]中，冰浴中1 h，并不斷混勻，于12 000 g離心（20 min，4 ℃）后收集上清；在上清液中加3倍沉淀體積的10% TCA/丙酮，-20 ℃過夜，12 000 g 離心（20 min，4 ℃）去上清后加入3倍體積100%丙酮清洗沉淀，置于-20 ℃ 1 h，12 000 g離心1 h 4 ℃；棄上清，重復(fù)3次。沉淀于室溫風(fēng)干，加裂解液，室溫放置2 h，使蛋白充分溶于裂解液中；用2-D定量試劑盒（Quant Kit，GE Healthcare）進行蛋白質(zhì)定量，分裝于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2雙向（2-DE）電泳分析雙向電泳第1向等電聚焦（IEF），采用24 cm固相pH值梯度（IPG）、pH值4～7膠條，蛋白質(zhì)上樣量為120 μg。利用IEF系統(tǒng)（EttanTM IPGphorTM3 IEF System，GE Healthcare）進行蛋白質(zhì)的水化和等電聚焦，溫度設(shè)置為20 ℃，每根膠條的最大電流低于50 μA，水化和聚焦程序：第1步，30 V 6 h；第2步，60 V 6 h；第3步，200 V 1 h；第4步，500 V 1 h；第5步，1 000 V 1 h；第6步，4 000 V 1 h；第7步，8 000 V 30 min；第8步，8 000 V 30 min；第9步，8 000 V 6 h。

蛋白質(zhì)樣品聚焦后，第1步蛋白質(zhì)還原：將1% DTT加入平衡液[6 mol/L尿素，30%（質(zhì)量濃度）丙三醇，2%十二烷基磺酸鈉（簡稱SDS），50 mmol/L Tris-HCl]中平衡15 min；第2步蛋白質(zhì)烷基化：將4%碘乙酰胺加入平衡液中平衡15 min。

第2向聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱SDS-PAGE）采用Ettan DALTⅡ垂直電泳系統(tǒng)進行SDS-PAGE。將平衡的膠條轉(zhuǎn)移至12.5%分離膠上，用低熔點瓊脂糖溶液進行封膠，待瓊脂糖溶液凝固后，置于Ettan DALTⅡ垂直電泳系統(tǒng)中電泳。參數(shù)設(shè)定：第1步，2 W/膠，45 min；第2步，17 W/膠，約5 h，待溴酚藍(lán)轉(zhuǎn)移出凝膠面下邊沿時，停止電泳。

1.2.3染色與掃描本試驗采用硝酸銀染色[9]，用Imagine ScannerⅢ掃描，圖像用Image Master 2D Platinum 6.0軟件（GE Healthcare）進行分析。

1.2.4酶解、質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)酶解及基質(zhì)輔助激光電解離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF）方法參照文獻[10-11]。利用Mascot檢索引擎對蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析獲得的MS肽段信息及MS/MS離子信息進行非冗余NCBI數(shù)據(jù)庫檢索、鑒定。肽質(zhì)量誤差范圍±0.4 u；胰蛋白酶解1個漏切；考慮乙?；饔茫ǖ鞍踪|(zhì)N端），脲甲基化（C）及氧化（M）修飾；母離子和子離子類型為單一同位素質(zhì)量；檢索時用綠色植物庫（Green Plants 734557）。檢索總離子分值大于99或匹配肽的最低覆蓋率為10%。

2結(jié)果與分析

2.1蛋白質(zhì)濃度分析

采用2-D Quant Kit進行蛋白質(zhì)樣品濃度測定，由圖1可以看出，Mg/NP-40-TCA/丙酮、TCA/丙酮、裂解液-Clean up、裂解液-TCA/丙酮方法提取雜交鵝掌楸總蛋白質(zhì)濃度分別為（10.7±0.6）、（9.8±1.5）、（3.0±0.8）、（1.4±01） mg/mL，可見Mg/NP-40-TCA/丙酮、TCA/丙酮法提取鵝掌楸愈傷組織蛋白質(zhì)的效率高。利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件對4種提取方法進行差異顯著性分析可見，在0.05水平上，Mg/NP-40-TCA/丙酮、TCA/丙酮法與裂解液-Clean up、裂解液-TCA/丙酮法，0.01水平上差異顯著；Mg/NP-40-[JP3]TCA/丙酮法和TCA/丙酮法之間沒有顯著差異，裂解液-Clean up法和裂解液-TCA/丙酮法之間也不存在顯著差異（圖1）。

[TPXF11.tif]

2.2SDS-PAGE圖譜分析

由圖2可見，Mg/NP-40-TCA/丙酮、TCA/丙酮方法對高分子量蛋白質(zhì)提取效果明顯好于裂解液-Clean up法和裂解液-TCA/丙酮法；Mg/NP-40-TCA/丙酮法提取蛋白質(zhì)在分子量30 ku以下條帶較少，TCA/丙酮法和裂解液-TCA/丙酮法提取低分子量蛋白質(zhì)較好；裂解液-Clean up法和裂解液-TCA/丙酮法提取高分子量蛋白質(zhì)量較Mg/NP-40-TCA/丙酮、TCA/丙酮法少?？傮w來說，從SDS-PAGE圖譜中可以看出，4種方法在低分子量蛋白質(zhì)提取、分離效果方面較高分子量蛋白質(zhì)差，低分子量蛋白質(zhì)在SDS-PAGE膠中出現(xiàn)了彌散現(xiàn)象。為了綜合考慮，筆者對Mg/NP-40-TCA/丙[CM（25]酮、TCA/丙酮2種方法提取的蛋白質(zhì)進行雙向電泳，以進[CM）]

[FK（W13][TPXF22.tif]

一步進行比較分析。

2.3雙向電泳圖譜分析

基于SDS-PAGE分析結(jié)果，對TCA/丙酮、Mg/NP-40-TCA/丙酮法提取的蛋白質(zhì)進行雙向電泳分析，硝酸銀染色。由圖3可見，2種方法獲得的雙向電泳圖譜上蛋白質(zhì)點分布較均勻且蛋白質(zhì)點圓潤，圖譜背景清晰，但是Mg/NP-40-TCA/丙酮法的雙向電泳圖譜上蛋白質(zhì)點較TCA/丙酮法蛋白質(zhì)點少，且高豐度蛋白質(zhì)數(shù)量較多，雙向電泳分析中高豐度蛋白質(zhì)的存在會影響蛋白質(zhì)的上樣量及掩蓋低豐度蛋白質(zhì)的呈現(xiàn)。此外，TCA/丙酮法在低分子量蛋白質(zhì)（圖3中的b、b′）和堿性蛋白質(zhì)（圖3中的a、a′）提取方面還有很大的優(yōu)勢。從整體情況分析可知，TCA/丙酮法較Mg/NP-40-TCA/丙酮法效果好。

[FK（W14][TPXF33.tif]

2.4蛋白質(zhì)鑒定

隨機選擇TCA/丙酮提取方法的雙向電泳圖譜中的幾個蛋白質(zhì)點（圖3）進行質(zhì)譜鑒定。蛋白質(zhì)點5、6、7在綠色植物的數(shù)據(jù)庫中沒有匹配，可能原因在于鵝掌楸基因組序列信息少，限制了蛋白質(zhì)的鑒定。表1結(jié)果顯示，TCA/丙酮法提取的蛋白質(zhì)與MALDI/TOF/TOF質(zhì)譜鑒定分析是兼容的，因此該方法適合鵝掌楸愈傷組織大規(guī)模的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

[BT1#]3結(jié)論與討論

樣品制備是雙向電泳的第1步，蛋白質(zhì)提取的質(zhì)量關(guān)系到雙向電泳圖譜的質(zhì)量及質(zhì)譜鑒定結(jié)果。本試驗利用 Mg/NP-40-TCA/丙酮、TCA/丙酮、裂解液-Clean up、裂解液-TCA/丙酮4種方法提取胚性愈傷組織蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-PAGE電泳和2-DE電泳比較分析，以期尋求適合雜交鵝掌楸胚性愈傷蛋白質(zhì)組分析的提取方案。

從蛋白質(zhì)樣品濃度的測定可以看出，裂解液-Clean up、裂解液-TCA/丙酮法提取蛋白質(zhì)濃度較低，Mg/NP-40-TCA/丙酮、TCA/丙酮法提取蛋白質(zhì)濃度較高，是前2種方法提取蛋白濃度的3～4倍。顯著性分析表明，Mg/NP-40-TCA/丙酮法、TCA/丙酮法提取蛋白質(zhì)量與裂解液-Clean up法、裂解液-TCA/丙酮法存在顯著差異，表明這2種方法總蛋[CM（25]白提取效果明顯優(yōu)于前2種方法。雖然Mg/NP-40-[CM）]

從SDS-PAGE圖譜分析可以看出，裂解液-Clean up法、裂解液-TCA/丙酮法在提取高分子量蛋白質(zhì)方面沒有優(yōu)勢。一般來說，Clean up試劑盒純化效果較好且耗時短，但Clean up試劑盒價格較高，從而提高試驗成本，且該試劑盒較適合少量蛋白質(zhì)的提取和純化。[JP2]與裂解液-Clean up法、裂解液-TCA/丙酮法相比，TCA/丙酮法、Mg/NP-40-TCA/丙酮法提取效率高，由SDS-PAGE圖譜看出，蛋白質(zhì)條帶較清晰。雙向電泳分析表明，TCA/丙酮法所獲得的2-DE圖譜中蛋白質(zhì)數(shù)量和質(zhì)量較Mg/NP-40-TCA/丙酮法好。TCA/丙酮提取方法獲得的蛋白質(zhì)點多、清晰、縱橫條紋較少，且在小分子量蛋白質(zhì)和堿性蛋白質(zhì)分離中有優(yōu)勢；質(zhì)譜試驗結(jié)果表明，TCA/丙酮法提取的蛋白質(zhì)適合質(zhì)譜鑒定、分析。因此綜合分析這4種提取方法表明，TCA/丙酮法適合雜交鵝掌楸愈傷大規(guī)模蛋白質(zhì)組分析。為了更好地、更多地鑒定蛋白質(zhì)，下一步工作應(yīng)結(jié)合雜交鵝掌楸的轉(zhuǎn)錄組信息來鑒定蛋白質(zhì)組。

[HS2][HT8.5H]參考文獻：[HT8.SS]

[1]Vogel G. How does a single somatic cell become a whole plant[J]. Science，2005，309（5731）：86.

[2]Ikeuchi M，Sugimoto K，Iwase A. Plant callus：mechanisms of induction and repression[J]. Plant Cell，2013，25（9）：3159-3173.

[3]王章榮. 鵝掌楸屬雜交育種成就與育種策略[J]. 林業(yè)科技開發(fā)，2008，22（5）：1-4.

[4]Zhen Y，Shi J S. Evaluation of sample extraction methods for proteomic analysis of coniferous seeds[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2011，33（5）：1623-1630.

[5]Wang W，Tai F J，Chen S N. Optimizing protein extraction from plant tissues for enhanced proteomics analysis[J]. Journal of Separation Science，2008，31（11）：2032-2039.

[6]陳金慧，施季森，諸葛強，等. 雜交鵝掌楸體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究[J]. 林業(yè)科學(xué)，2003，39（4）：49-53.

[7]Lee D G，Ahsan N，Lee S H，et al. An approach to identify cold-induced low-abundant proteins in rice leaf[J]. Comptes Rendus Biologies，2007，330（3）：215-225.

[8]梁書劍，張萌，王巍，等. 雙向電泳比較兩種方法獲得的水稻葉片蛋白[J]. 生物學(xué)雜志，2009，26（3）：68-71.

[9]Shevchenko A，Wilm M，Vorm O A，et al. Mass spectrometric sequencing of proteins from silver-stained polyacrylamide gels[J]. Analytical Chemistry，1996，68（5）：850-858.

[10]Shi J，Zhen Y，Zheng R H. Proteome profiling of early seed development in Cunninghamia lanceolata（Lamb.） Hook[J]. Journal of Experimental Botany，2010，61（9）：2367-2381.

[11]Khatun J，Ramkissoon K，Giddings M C. Fragmentation characteristics of collision-induced dissociation in MALDI TOF/TOF mass spectrometry[J]. Analytical Chemistry，2007，79（8）：3032-3040.