傅友強(qiáng)于曉莉楊旭健沈宏*

研究報(bào)告

干濕交替誘導(dǎo)水稻根表鐵膜形成的基因表達(dá)譜分析

傅友強(qiáng)1,2于曉莉1楊旭健1沈宏1,*

（1華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510642；2廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所，廣州 510640；*通訊聯(lián)系人，E-mail： hshen@scau.edu.cn）

【目的】干濕交替（AWD）是水稻種植過(guò)程中最重要的管理方式，能夠提高水稻根系活力、增強(qiáng)抗逆性。研究發(fā)現(xiàn)，AWD能明顯促進(jìn)水稻根表鐵膜的形成。然而，AWD誘導(dǎo)水稻根表鐵膜形成的基因表達(dá)譜尚未見(jiàn)報(bào)道?！痉椒ā坎捎蒙芭嘣囼?yàn)，研究了長(zhǎng)期淹水（CK）、干濕交替（AWD）、長(zhǎng)期淹水加Fe2+（CK+Fe）和干濕交替加Fe2+（AWD+Fe）四個(gè)處理下水稻根系基因的差異表達(dá)譜?！窘Y(jié)果】AWD處理與CK處理相比，水稻根系有506個(gè)差異表達(dá)基因（DEG）上調(diào)表達(dá)，有687個(gè)DEG下調(diào)表達(dá)；AWD+Fe處理與CK+Fe處理相比，有308個(gè)DEG上調(diào)表達(dá)和179個(gè)DEG下調(diào)表達(dá)；CK+Fe處理與CK處理相比，有728個(gè)DEG上調(diào)表達(dá)和1175個(gè)DEG下調(diào)表達(dá)；AWD+Fe處理與AWD處理相比，有1252個(gè)DEG上調(diào)表達(dá)和1189個(gè)DEG下調(diào)表達(dá)。維恩圖分析發(fā)現(xiàn)，共計(jì)有3822個(gè)DEG參與了AWD誘導(dǎo)水稻根表鐵膜形成過(guò)程?；蚬δ埽℅O）分析表明，在生物過(guò)程中共有270個(gè)DEG參與了氧化還原反應(yīng)過(guò)程，分子功能中共有165個(gè)DEG與氧化還原酶功能有關(guān)。生物通路富集分析（KEGG）結(jié)果表明，細(xì)胞器類、信號(hào)刺激類、光合作用類、生物合成類和代謝類等生物通路參與了AWD誘導(dǎo)水稻根表鐵膜的形成過(guò)程。AWD和根表鐵膜形成過(guò)程發(fā)現(xiàn)有38個(gè)共享DEG，這些基因的蛋白注釋與水稻抗病性、抗旱性、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、氧化還原、蛋白激酶和轉(zhuǎn)運(yùn)、新陳代謝過(guò)程有關(guān)。與CK處理相比，AWD處理誘導(dǎo)了氧化還原反應(yīng)過(guò)程相關(guān)的基因達(dá)102個(gè)，占總DEG數(shù)的8.25%。AWD處理促進(jìn)了水稻根系過(guò)氧化物酶、脂肪酸氧化酶和乙醇酸氧化酶等相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)。與CK處理相比，AWD處理提高了水稻根系活力和根表鐵膜數(shù)量，分別為22.9%和45.7%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果基本一致，其相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.90?！窘Y(jié)論】綜上所述，AWD明顯誘導(dǎo)了氧化還原反應(yīng)過(guò)程中的相關(guān)基因大量表達(dá)，增加了根系氧化力，促進(jìn)根表鐵膜的形成；過(guò)氧化物酶、脂肪酸氧化酶和乙醇酸氧化酶等相關(guān)的基因可能是AWD誘導(dǎo)水稻根表鐵膜形成的重要基因。

水稻；干濕交替；鐵膜；差異表達(dá)基因；氧化還原相關(guān)基因

稻田干濕交替灌溉處理有利于土壤氧化和還原狀態(tài)的交替進(jìn)行[1]，進(jìn)而提高土壤氧化還原電位，改善土壤的通氣性，協(xié)調(diào)土壤水分與O2之間平衡，節(jié)約灌溉用水和提高水分利用率[2]。同時(shí)，干濕交替灌溉處理增加土壤細(xì)菌、放線菌的活性和數(shù)量，促進(jìn)水稻根系的生長(zhǎng)[3]，從而提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，稻田進(jìn)行干濕交替灌溉處理是水稻生產(chǎn)過(guò)程中最常見(jiàn)的管理措施，對(duì)促進(jìn)水稻生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的提高起著非常重要的作用。有研究表明，干濕交替灌溉處理能夠提高水稻自身的根系氧化力[4]。提高水稻根系抗氧化酶系統(tǒng)如超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性[5]，與對(duì)照相比，根系氧化力增加了180%[6]。因此，根系氧化力和根系抗氧化酶活性的提高是根系響應(yīng)干濕交替灌溉處理的直接體現(xiàn)[7]。然而，干濕交替處理提高水稻根系氧化力的分子機(jī)理很少報(bào)道。有研究表明，根系抗氧化酶活性和根系氧化力的提高是水稻根表鐵膜形成的重要影響因素[8,9]。鐘順清[10]研究發(fā)現(xiàn)，形成鐵膜后的水稻根系活力與根表鐵膜數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)。因此，干濕交替具有提高水稻根系氧化力進(jìn)而誘導(dǎo)水稻根表鐵膜形成的能力。然而，這一過(guò)程的內(nèi)在分子機(jī)理并不清楚。

隨著生物技術(shù)水平的提高，基因表達(dá)譜分析、基因芯片分析和全基因組分析等的出現(xiàn)，對(duì)挖掘新的基因響應(yīng)非生物脅迫提供了技術(shù)支撐[11]。有研究表明，基因表達(dá)譜分析對(duì)解析基因的生物功能具有非常重要的作用，基因的差異表達(dá)為重新創(chuàng)造新的表型差異提供了新證據(jù)。如Ⅲ型轉(zhuǎn)氨酶基因在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程中扮演著非常重要的角色[12]；P-型Ca2+ATP酶基因參與了水稻花粉管的生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、花序結(jié)構(gòu)、氣孔開度和Ca2+、Mn2+、Zn2+的運(yùn)輸[13]；蛋白磷酸酶是一種非常重要的信號(hào)通道組分，參與許多非生物脅迫響應(yīng)和植物的生長(zhǎng)與發(fā)育過(guò)程。目前共識(shí)別132個(gè)蛋白磷酸酶基因，都能被非生物脅迫和植物生長(zhǎng)發(fā)育所誘導(dǎo)[14]。其次，同一基因家族不同成員在逆境脅迫條件下表達(dá)豐度也存在明顯差異。如Ray等[15]研究發(fā)現(xiàn)，依賴鈣的蛋白激酶在調(diào)控作物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)下游鈣信號(hào)途徑中發(fā)揮著重要作用。在非逆境脅迫下，有31個(gè)依賴鈣的蛋白激酶基因被識(shí)別，其中，環(huán)境脅迫條件下有6個(gè)依賴鈣的蛋白激酶基因被誘導(dǎo)，1個(gè)依賴鈣的蛋白激酶基因被下調(diào)表達(dá)。此外，非生物脅迫如冷害、干旱和鹽害脅迫也會(huì)誘導(dǎo)大量基因的差異表達(dá)，許多關(guān)鍵功能和調(diào)控基因參與了非生物脅迫過(guò)程[16]。如在鹽脅迫條件下，發(fā)現(xiàn)了成千上百個(gè)基因差異表達(dá)[17]；鹽害、干旱和冷害會(huì)誘導(dǎo)miRNA的差異表達(dá)，調(diào)控著植物生長(zhǎng)發(fā)育，如miR168、miR171和miR396等[18]；Jangam等[19]研究冷脅迫、干旱脅迫、熱脅迫和鹽脅迫條件下水稻品種RGA1（異源三聚體的G-蛋白突變體）的基因差異表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)冷脅迫條件下有878個(gè)上調(diào)基因和810個(gè)下調(diào)基因響應(yīng)，干旱脅迫有882個(gè)上調(diào)基因和837個(gè)下調(diào)基因響應(yīng)，熱脅迫有913個(gè)上調(diào)基因和777個(gè)下調(diào)基因響應(yīng)，鹽脅迫有889個(gè)上調(diào)基因和841個(gè)下調(diào)基因響應(yīng)。由此可見(jiàn)，在非生物脅迫中有大量基因參與響應(yīng)。要了解非生物脅迫忍耐機(jī)制，關(guān)鍵功能和調(diào)控基因的識(shí)別是非常重要的分子基礎(chǔ)[16]。然而，對(duì)干濕交替和根表鐵膜形成過(guò)程中水稻根系差異基因表達(dá)譜的研究很少報(bào)道。因此，本研究運(yùn)用基因轉(zhuǎn)錄組分析干濕交替和水稻根表鐵膜形成過(guò)程中的差異表達(dá)基因，希望進(jìn)一步了解水稻根系中哪些基因可能參與水稻根系氧化力提升，進(jìn)而促進(jìn)水稻根表鐵膜數(shù)量的增加，以期闡明干濕交替條件下，水稻根表鐵膜形成的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與植株培養(yǎng)

水稻材料為感溫型常規(guī)稻品種華航絲苗。挑選飽滿的水稻種子于30℃下進(jìn)行催芽處理，3 d后將幼苗轉(zhuǎn)移到1/2劑量的完全營(yíng)養(yǎng)液中，培養(yǎng)4 d后，轉(zhuǎn)移至10 L的塑料箱中用完全營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。每個(gè)塑料箱移植48株，當(dāng)幼苗長(zhǎng)到3葉1心時(shí)轉(zhuǎn)移于裝有3 kg石英砂的干濕交替裝置中（圖1），每個(gè)裝置栽種3株水稻苗，7 d換一次營(yíng)養(yǎng)液。上述所有溶液pH值都用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)到5.5。

圖1 干濕交替裝置Fig. 1. Device of alternate wetting and drying (AWD).

干濕交替裝置由大小兩個(gè)塑料盆和一個(gè)塑料墊組成，各部件的尺寸如圖1所示。小的塑料盆底下有6個(gè)直徑為1 cm的圓孔，允許營(yíng)養(yǎng)液在大小兩盆間自由流通。試驗(yàn)用砂由＞2 mm、1～2 mm和＜1 mm三種粒徑范圍的石英砂按質(zhì)量比1∶2∶2混合而成，石英砂裝在小盆中。落干處理時(shí)，將塑料墊放入大盆內(nèi)，將小盆墊高，使小盆底部脫離液面，小盆石英砂中的營(yíng)養(yǎng)液就會(huì)從底部圓孔流入大盆，并貯存于大盆中，實(shí)現(xiàn)了水稻落干過(guò)程；淹水處理時(shí)，將塑料墊從大盆中拿出，使小盆浸入裝有營(yíng)養(yǎng)液的大盆中，實(shí)現(xiàn)淹水過(guò)程，淹水狀態(tài)時(shí)始終保持水面在石英砂表面以上2～3 cm的位置。如此往復(fù)1次，稱為1個(gè)干濕交替周期，該裝置能夠人為實(shí)現(xiàn)定時(shí)定量干濕交替處理。

完全營(yíng)養(yǎng)液配方在Yoshida等[20]的基礎(chǔ)上稍做修改，具體如下:NH4NO30.429 mmol/L，Ca(NO3)2·4H2O 1 mmol/L，MgSO4·7H2O 1.667 mmol/L，KH2PO41 mmol/L，K2SO40.513 mmol/L；Fe(Ⅲ)-EDTA 50 μmol/L，MnSO49.1 μmol/L，ZnSO40.15 μmol/L，CuSO40.16 μmol/L，H3BO319 μmol/L，(NH4)4MoO24·4H2O 0.52 μmol/L。

磷鐵比（磷酸根與鐵離子的物質(zhì)的量濃度之比, P/Fe）為1/6的營(yíng)養(yǎng)液是在1/2劑量的完全營(yíng)養(yǎng)液的基礎(chǔ)上將KH2PO4改成0.05 mmol/L，K2SO4改為0.357 mmol/L，補(bǔ)充0.3 mmol/L FeSO4·7H2O，使得P/Fe為1/6，其他組分不變。該磷鐵比有利于形成更多的紅棕色鐵膜[21]。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

培養(yǎng)21 d的水稻幼苗進(jìn)行如下處理:1）CK，對(duì)照；2）AWD，干濕交替5次；3）CK+Fe，對(duì)照處理的水稻幼苗在磷鐵物質(zhì)的量比為1∶6（P:0.05 mmol/L；Fe2+:0.3 mmol/L）的營(yíng)養(yǎng)液中處理；4）AWD+Fe，干濕交替處理5次的幼苗在磷鐵物質(zhì)的量比為1∶6的營(yíng)養(yǎng)液中處理，其中，干濕交替處理以落干12 h/淹水12 h為一個(gè)干濕交替周期（定義為干濕交替1次）。2 d后，分別取根系基部0～5 cm的水稻根系進(jìn)行RNA提取。采用Omegara E. Z. N. A?植物RNA提取試劑盒提取總RNA，純化后，用1.5%瓊脂糖凝膠在135 V電壓下電泳20 min檢測(cè)條帶的亮度，并利用Agilent 2200 生物分析儀分析RNA濃度及完整性，提取和純化的RNA可進(jìn)行后續(xù)基因差異表達(dá)譜和生物信息分析。首先，將合格的水稻根系RNA進(jìn)行RNA片段化處理，然后打斷成不同大小片段的RNA，進(jìn)行隨機(jī)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA文庫(kù)。連接測(cè)序接頭擴(kuò)增，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫(kù)制備工作，構(gòu)建好的文庫(kù)用HiSeq?2000測(cè)序儀(Illumina，美國(guó))進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序策略為SE：1X50.bp測(cè)序。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的數(shù)據(jù)為原始數(shù)據(jù)（raw data），首先需要對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)(clean data)。并將這些高質(zhì)量數(shù)據(jù)與參考基因組(水稻秈稻基因組，http：//ensembl. gramene.org/Oryza_indica/ Info/Index?)進(jìn)行比對(duì)，得到BAM文件。根據(jù)差異倍數(shù)(|Fold change|＞2)和顯著水平(q值＞0.05)，計(jì)算基因表達(dá)量和分析樣品間差異表達(dá)基因，并對(duì)差異基因進(jìn)行GO和KEGG分析。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

從AWD與CK相比的數(shù)據(jù)庫(kù)中與氧化還原相關(guān)的上調(diào)表達(dá)基因中隨機(jī)選取6個(gè)差異表達(dá)基因，再?gòu)墓餐憫?yīng)干濕交替和鐵膜形成的38個(gè)差異表達(dá)基因中隨機(jī)選取3個(gè)差異表達(dá)基因，即共選取9個(gè)差異表達(dá)基因利用水稻秈稻參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//ensembl.gramene.org/Oryza_indica/Info/Index)查詢各基因的編碼區(qū)序列。利用Primer Premier 6.0引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行熒光定量PCR正反引物的設(shè)計(jì)。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)在線網(wǎng)站(http：//biotools.nubic. northwestern.edu/OligoCalc.html）進(jìn)行引物發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢驗(yàn)和NCBI中的Primer-BLAST (http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi? LINK_LOC=BlastHome）進(jìn)行引物特異性的驗(yàn)證。引物設(shè)計(jì)如表1。

1.3.2 水稻根系總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA

用去離子水清洗水稻根系，根表水分用紙巾吸干，將一定量的根系于液氮中抽提RNA，采用Omegara E.Z.N.A.?植物RNA提取試劑盒提取水稻根系總RNA[22]。用微量分光光度計(jì)分別檢測(cè)RNA在260 nm和280 nm處的光度值，以保證RNA的純度和濃度。采用TaKaRa PrimeScript?反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。隨后，將cDNA反應(yīng)液放入-20℃冰箱中備用。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的測(cè)定

將所得到的反轉(zhuǎn)錄cDNA稀釋50倍作為模板（0.5 μg RNA反轉(zhuǎn)錄）。每個(gè)樣品取適量cDNA稀釋5倍作為標(biāo)準(zhǔn)曲線模板的最大點(diǎn)，隨后按10倍的稀釋梯度作標(biāo)準(zhǔn)曲線模板，采用無(wú)RNA酶純水作標(biāo)準(zhǔn)曲線模板的零點(diǎn)。用目的基因和內(nèi)參基因的引物進(jìn)行熒光定量PCR。分別采用表1中特異性引物在熒光定量PCR儀器（RG3000）上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。擴(kuò)增條件如下:98℃下預(yù)變性10 min；98℃下變性15 s，60℃下退火1 min，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為40個(gè)。用實(shí)時(shí)熒光分析軟件6.0計(jì)算樣品表達(dá)量。相對(duì)表達(dá)量為目的基因表達(dá)量與內(nèi)參基因表達(dá)量的比值。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1. Primers of quantitative real-time PCR.

1.3.4 水稻根表鐵膜的測(cè)定

水稻根表DCB-Fe采用DCB法稍加修改進(jìn)行提取[23]，即水稻根系用去離子水沖洗干凈，放入150 mL的三角瓶中，加入0.03 mol/L Na3C6H5O7·2H2O 40 mL，0.1 mol/L NaHCO35 mL及Na2S2O41 g，于25℃下在150 r/min的搖床上振動(dòng)3 h，溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容。

DCB浸提液中的鐵用原子吸收分光光度計(jì)（型號(hào):日立Z-5300，日本）測(cè)定。植物根表鐵膜數(shù)量（厚度）采用g/kg（根干質(zhì)量）表示。

表2 數(shù)據(jù)過(guò)濾統(tǒng)計(jì)分析Table 2. Statistical analysis of data filtering.

1.3.5 根系活力的測(cè)定

根系活力的定量測(cè)定根據(jù)Ramasamy等[24]的方法，略有修改:將處理完后的水稻根系用自來(lái)水沖洗，去除水稻幼苗的地上部，根系用去離子水沖洗3次，然后用濾紙吸去根系表面的水分，將根系放入100 mL三角燒瓶中。加50 μg/mL的α-萘胺溶液與pH7.0磷酸緩沖液各25 mL，用玻璃棒將根系全部浸入溶液中，輕輕振蕩，靜置10 min。吸取2 mL溶液，測(cè)定α-萘胺含量，作為試驗(yàn)開始時(shí)的數(shù)值。另外，不放根系的空白處理同時(shí)進(jìn)行，作為α-萘胺的自然氧化值。

樣品在25℃下以150 r/min恒溫振蕩3 h，吸取2 mL溶液，加入10 mL去離子水，隨后加入1%對(duì)氨基苯磺酸溶液1 mL和亞硝酸鈉溶液1 mL，在室溫中放置5 min，待混合液變成紅色，再用去離子水定容到25 mL。在20～60 min內(nèi)于510 nm下讀取吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的α-萘胺濃度。從試驗(yàn)開始（10 min）時(shí)的數(shù)值減去自動(dòng)氧化的數(shù)值，即為溶液中所有的α-萘胺量，再減去試驗(yàn)結(jié)束時(shí)α-萘胺含量，即得試驗(yàn)期間根系所氧化的α-萘胺量。被氧化的α-萘胺量以μg/（g·h）表示。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

本研究所有數(shù)據(jù)在SPSS 13.0軟件上采用Turkey (P＜0.05)法進(jìn)行單重比較，根據(jù)所得數(shù)據(jù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，用OriginPro 9.0軟件作圖，并用不同字母表示不同處理間差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1水稻根系RNA質(zhì)量評(píng)估

依據(jù)原始數(shù)據(jù)的分析結(jié)果對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，去除接頭序列和污染部分；再去除含有過(guò)多N堿基（＞10%，N堿基為儀器不能辨讀的堿基）及含有過(guò)多低質(zhì)量堿基（質(zhì)量值低于20的堿基占整條序列的20%以上）的序列。所得數(shù)據(jù)產(chǎn)生了超過(guò)6.73 G的50 nt單末端序列數(shù)據(jù)庫(kù)。整個(gè)過(guò)程接頭污染不到0.3%，過(guò)多的N序列不到0.05%，低質(zhì)量序列不到1.7%，得到6.56 G的干凈數(shù)據(jù)，Q20都大于98%（表2）。說(shuō)明數(shù)據(jù)過(guò)濾后的質(zhì)量非?？煽?，可進(jìn)行下一步的質(zhì)量統(tǒng)計(jì)。

表 3 Reads比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 3. Alignment result statistics of Reads.

2.2堿基序列比對(duì)

我們使用tophat進(jìn)行序列比對(duì)，參數(shù)為: read-mismatches=2(允許2個(gè)錯(cuò)配)，readgap-length=2（允許2個(gè)gap）。將測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，對(duì)數(shù)據(jù)測(cè)序覆蓋區(qū)域、測(cè)序數(shù)據(jù)覆蓋深度等做出綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12個(gè)樣品中總的Reads數(shù)范圍達(dá)到0.13億～0.18億條，總的堿基數(shù)達(dá)到6.5億～9.0億個(gè)，基本覆蓋了水稻全部基因組序列。通過(guò)去掉多序列比對(duì)的結(jié)果，單序列比對(duì)率都大于82%，且比對(duì)基因組中正負(fù)鏈基本相似，表明了堿基序列匹配的準(zhǔn)確性（表3）。

2.3干濕交替誘導(dǎo)水稻根表鐵膜形成的差異表達(dá)基因分析

水稻幼苗通過(guò)砂培方式培養(yǎng)21 d后，進(jìn)行如下4個(gè)處理:CK，長(zhǎng)期淹水處理（對(duì)照）；AWD，干濕交替5次處理；CK+Fe，對(duì)照水稻幼苗在P/Fe（磷酸根與鐵離子的物質(zhì)的量濃度之比）為1∶6的溶液中處理2 d；AWD+Fe，干濕交替處理的幼苗在P/Fe為1∶6的溶液中處理2 d，然后進(jìn)行基因表達(dá)譜分析。如圖2所示，AWD處理與CK處理相比，水稻根系有506個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，有687個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；AWD+Fe處理與CK+Fe處理相比，根系上調(diào)表達(dá)基因有308個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因有179個(gè)；CK+Fe處理與CK處理相比，根系上調(diào)表達(dá)基因有728個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因有1175個(gè)；AWD+Fe處理與AWD處理相比，根系上調(diào)表達(dá)基因有1252個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因有1189個(gè)。

利用網(wǎng)絡(luò)在線工具（http：//genedenovoweb. ticp.net：81/gdtools/login.php）將圖3-A、B、C和D 4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行維恩圖分析，發(fā)現(xiàn)共有3 822個(gè)差異表達(dá)基因參與了干濕交替誘導(dǎo)水稻根表鐵膜的形成過(guò)程。其中，有90個(gè)基因共同受干濕交替處理（AWD vs CK 和AWD+Fe vs CK+Fe）誘導(dǎo)；有869個(gè)基因共同受Fe2+（CK+Fe vs CK和AWD+Fe vs AWD）誘導(dǎo)（圖3）。重要的是，38個(gè)差異表達(dá)基因共同受干濕交替和鐵膜形成誘導(dǎo)。

圖2 水稻根系4個(gè)數(shù)字基因表達(dá)庫(kù)Fig. 2. Four digital gene expression libraries of rice roots.

圖3 差異表達(dá)基因數(shù)目在維恩圖中的分布情況Fig. 3. Distribution of differentially expressed genes in the Venn diagram.

圖4 GO功能分類Fig. 4. GO classification.

2.4差異表達(dá)基因的GO分析

Gene Ontology分析即GO分析，可分為分子功能（Molecular function）、生物過(guò)程（Biological process）和細(xì)胞組成（Cellular component）三個(gè)部分，它常用于提供基因功能分類標(biāo)簽和基因功能研究的背景知識(shí)。通過(guò)物種和基因信息，用GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行查找，從而得到基因GO的注釋信息（功能信息）。首先，將中4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的差異表達(dá)基因共3822個(gè)分離出來(lái)，然后進(jìn)行整體GO分析（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從生物過(guò)程來(lái)看，有8個(gè)主要的生物過(guò)程，分別為新陳代謝過(guò)程（metabolic process）、氧化還原過(guò)程（oxidation-reduction process）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程（regulation of transcription）、電子傳遞（electron transport）、蛋白磷酸化過(guò)程（protein phosphorylation）、蛋白水解過(guò)程（proteolysis）、氧化脅迫的響應(yīng)過(guò)程（response to oxidative stress）和鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程（response to salt stress）。有趣的是，除了新陳代謝過(guò)程外，有270個(gè)與氧化還原過(guò)程相關(guān)的差異表達(dá)基因響應(yīng)干濕交替誘導(dǎo)根表鐵膜的形成過(guò)程。從細(xì)胞組成來(lái)看，主要有9個(gè)細(xì)胞組成，分別為細(xì)胞膜（membrane）、葉綠體（chloroplast）、線粒體（mitochondrion）、質(zhì)體（plastid）、細(xì)胞壁（cell wall）、細(xì)胞核（nucleus）、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體（transcription factor complex）、液泡（vacuole）、質(zhì)外體（apoplast），其中大部分差異表達(dá)基因主要定位在細(xì)胞膜上。從分子功能來(lái)看，主要有9個(gè)分子功能，分別為綁定酶活（binding）、氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）、水解酶活性（hydrolase activity）、絲/蘇氨基蛋白激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）、轉(zhuǎn)錄因子酶活性（transcription factor activity）、電子傳遞活性（electron carrier activity）、過(guò)氧化物酶活性（peroxidase activity）、二聚體蛋白活性（protein dimerization activity）和單氧酶活性（monooxygenase activity），其中大部分差異表達(dá)基因主要參與分子綁定酶活功能。值得注意的是，除了綁定酶活功能外，有165個(gè)與氧化還原酶活性相關(guān)的基因響應(yīng)干濕交替誘導(dǎo)水稻根表鐵膜的形成過(guò)程。

圖5 基于KEGG的不同差異表達(dá)基因的通路分布Fig. 5. Pathway assignment of differentially expressed genes based on KEGG analysis.

2.5差異表達(dá)基因的KEGG分析

從復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的角度出發(fā)，根據(jù)KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）生物學(xué)通路數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.genome.jp/)，對(duì)差異基因進(jìn)行生物通路富集分析，從而提取出最相關(guān)的生物通路上的差異基因，更加有利于下游試驗(yàn)的開展。從圖5可知，4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共3 822個(gè)差異表達(dá)基因主要參與33條通路。對(duì)這些通路進(jìn)行歸納總結(jié)和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，33條KEGG通路大致可分成5大類，即細(xì)胞器類、信號(hào)刺激類、光合作用類、生物合成類和代謝類。其中細(xì)胞器類主要有3條通路，即過(guò)氧化物酶體通路（peroxisome）、溶酶體通路（lysosome）、核糖體通路（ribosome）；信號(hào)刺激類主要有2條通路，即植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（plant hormone signal transduction）和植物與病原菌交互作用通路（plant-pathogen interaction）；光合作用類主要有3條通路，即光合作用通路（photosynthesis）、光合天線蛋白通路（photosynthesis-antenna proteins）和碳固定通路（carbon fixation in photosynthetic organisms）；生物合成類主要有7條通路，分別為次生代謝生物合成通路（biosynthesis of secondary metabolites）、抗生素生物合成通路（biosynthesis of antibiotics）、苯丙烷生物合成通路（phenylpropanoid biosynthesis）、氨基酸生物合成通路（biosynthesis of amino acids）、萜類化合物生物合成通路（terpenoid backbone biosynthesis）、黃酮類生物合成通路（flavonoid biosynthesis）和不飽和脂肪酸生物合成通路（biosynthesis of unsaturated fatty acids）。而代謝類通路最多，達(dá)到了18條，其中最重要的兩條通路是新陳代謝通路（metabolic pathways）和不同環(huán)境條件下的微生物新陳代謝通路（microbial metabolism in diverse environments）。上述結(jié)果表明了細(xì)胞器類、信號(hào)刺激類、光合作用類、生物合成類和代謝類等通路都參與了干濕交替誘導(dǎo)水稻根表鐵膜的形成過(guò)程。

2.6共響應(yīng)干濕交替和根表鐵膜的38個(gè)差異表達(dá)基因分析

將共同受干濕交替和根表鐵膜形成誘導(dǎo)的38個(gè)差異表達(dá)基因根據(jù)NR數(shù)據(jù)庫(kù)（non-redundant，非冗余蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)）進(jìn)行基因的蛋白注釋。所注釋的蛋白，可歸納為7大類(表4)，分別為抗病性類(2個(gè))、抗旱性類(4個(gè))、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜類（8個(gè)）、氧化還原類(5個(gè))、蛋白激酶和轉(zhuǎn)運(yùn)類(5個(gè))、新陳代謝類(10個(gè))及其他(4個(gè))。同一類型不同基因的表達(dá)水平存在明顯差異。對(duì)于抗病性類而言，與對(duì)照相比，干濕交替有利于病原菌相關(guān)蛋白基因上調(diào)表達(dá)，例如BGIOSGA033475-TA，它隨著根表鐵膜的形成，表達(dá)量逐漸增加。而植物抗病響應(yīng)基因如BGIOSGA032127-TA，其表達(dá)量與BGIOSGA033475-TA呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。對(duì)于抗旱性類而言，干濕交替處理都能降低疏水相關(guān)蛋白和對(duì)脫水響應(yīng)的元件結(jié)合蛋白基因的下調(diào)表達(dá)，從而提高水稻抗旱性（表4）。對(duì)于水稻細(xì)胞壁和細(xì)胞膜類而言，干濕交替誘導(dǎo)了葡聚糖水解酶基因BGIOSGA005143-TA的上調(diào)表達(dá)，下調(diào)了糖基水解酶BGIOSGA019479-TA基因的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)了與細(xì)胞壁纖維素蛋白基因BGIOSGA012450-TA、微纖維素蛋白基因BGIOSGA012450-TA和微管蛋白基因BGIOSGA009910-TA的表達(dá)，細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)蛋白基因BGIOSGA031806-TA也明顯下調(diào)表達(dá)。其次，細(xì)胞膜蛋白基因如BGIOSGA033296-TA和BGIOSGA025169-TA基因也下調(diào)表達(dá)，從而改變了細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和生理生化特性。根表鐵膜的形成改善了細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)蛋白基因和細(xì)胞膜蛋白基因。對(duì)于氧化還原類而言，除了乙醇酸氧化酶基因BGIOSGA017163-TA外，干濕交替處理都下調(diào)其他4個(gè)氧化還原酶基因的表達(dá)。除了異黃酮還原酶蛋白基因外，根表鐵膜的形成都促進(jìn)了其他氧化還原酶基因的下調(diào)表達(dá)。對(duì)于蛋白激酶和轉(zhuǎn)運(yùn)類而言，5個(gè)蛋白激酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在干濕交替處理?xiàng)l件下都下調(diào)表達(dá)，而根表鐵膜的形成都能改善蛋白激酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)。對(duì)于新陳代謝類而言，不管是單獨(dú)干濕交替處理還是干濕交替誘導(dǎo)的根表鐵膜形成過(guò)程，與氧結(jié)合蛋白基因BGIOSGA012186-TA、光捕捉蛋白基因BGIOSGA003133-TA和肽酶C1A蛋白基因BGIOSGA015910-TA都能上調(diào)表達(dá)。除了NAD(P)(+)綁定蛋白基因BGIOSGA026338-TA和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶蛋白基因BGIOSGA031475-TA都能在AWD和AWD+Fe處理中下調(diào)表達(dá)外，其他蛋白基因如晚期胚胎發(fā)育蛋白基因BGIOSGA033178-TA、肽酶蛋白基因C13 BGIOSGA017447-TA、C1A蛋白基因BGIOSGA016118-TA、類似葉綠體核DNA綁定蛋白酶BGIOSGA023256-TA和類似乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶蛋白基因BGIOSGA010778-TA在AWD中都下調(diào)表達(dá)，而AWD+Fe處理改善了這些蛋白基因的表達(dá)水平。有趣的是，我們還發(fā)現(xiàn)了3個(gè)假設(shè)蛋白基因，分別為BGIOSGA033067-TA、BGIOSGA031784-TA和BGIOSGA013300-TA，且干濕交替誘導(dǎo)其中2個(gè)基因上調(diào)表達(dá)。值得注意的是，非編碼區(qū)基因也參與了干濕交替誘導(dǎo)根表鐵膜的形成過(guò)程，干濕交替明顯誘導(dǎo)非編碼區(qū)基因如NCRNA_4800的上調(diào)表達(dá)。非編碼區(qū)可能在調(diào)控鐵膜形成過(guò)程中也起著重要作用。

2.7響應(yīng)干濕交替的氧化還原相關(guān)基因分析

從圖6中可看出，氧化還原過(guò)程（oxidationreduction process）中的差異表達(dá)基因在GO生物過(guò)

程中所占的基因數(shù)目最多，其比例高達(dá)8.25%，說(shuō)明了干濕交替明顯誘導(dǎo)水稻根系氧化還原過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)。其次為轉(zhuǎn)錄調(diào)控(regulation of transcription)、電子傳遞(electron transport)、蛋白磷酸化(protein phosphorylation)、蛋白質(zhì)水解(proteolysis)、氧化脅迫響應(yīng)(response to oxidative stress)、絲氨基酸代謝過(guò)程(serine family amino acid metabolic process)、蔗糖代謝過(guò)程（sucrose metabolic process）、淀粉代謝過(guò)程(starch metabolic process)和碳水化合物代謝過(guò)程(carbohydrate metabolic process)等的相關(guān)基因。其他(Others)盡管所占GO生物過(guò)程中的基因達(dá)66.42%，但是其中所包含的生物過(guò)程高達(dá)363條，且每條生物過(guò)程基因數(shù)目都低于1.40%。因此，根系氧化還原過(guò)程相關(guān)基因的變化響應(yīng)了干濕交替誘導(dǎo)過(guò)程。

表4 38個(gè)差異表達(dá)基因的分類及注釋Table 4. Categories and annotations of 38 differentially expressed genes.

圖6 AWD vs CK數(shù)據(jù)庫(kù)中的差異表達(dá)基因在生物過(guò)程（GO）中的分布情況Fig. 6. Distribution of differentially expressed genes in the biological process of GO classification in AWD vs CK library.

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)在線工具（http：//genedenovoweb. ticp.net：81/gdtools/index.php）中的表格篩選和合并功能將AWD vs CK數(shù)據(jù)庫(kù)中共102個(gè)參與氧化還原過(guò)程中的差異表達(dá)基因篩選出來(lái)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在干濕交替誘導(dǎo)過(guò)程中共有30個(gè)差異表達(dá)基因上調(diào)表達(dá)，72個(gè)差異表達(dá)基因下調(diào)表達(dá)（圖7）。我們重點(diǎn)分析了30個(gè)上調(diào)表達(dá)差異基因并對(duì)其進(jìn)行蛋白功能注釋。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干濕交替處理誘導(dǎo)了多種氧化還原相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，其中最多的為NAD(P)-依賴的氧化酶[NAD(P)-dependent dehydrogenase]、鐵/抗壞血酸-依賴的氧化還原酶(iron/ ascorbate-dependent oxidoreductase family)、III型過(guò)氧化物酶(classical plant (class III) peroxidase subfamily)、縮氨酸-蛋氨基-S-氧還原酶[peptide-methionine (S)-S-oxide reductase activity]、乙醇酸氧化酶[peroxisomal (S)-2-hydroxy-acid oxidase]、脂肪酸去飽和酶（fatty acid_desaturase）等。我們通過(guò)對(duì)30個(gè)與氧化還原過(guò)程相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行熱圖分析也得到同樣的結(jié)果（圖8）。

圖7 氧化還原相關(guān)基因中上調(diào)或下調(diào)表達(dá)基因數(shù)目Fig. 7. Numbers of up-regulated or down-regulated genes associated with oxidation-reduction.

圖8 30個(gè)差異表達(dá)基因熱圖分析Fig. 8. Heat map diagram of 30 differentially expressed genes.

圖9 9個(gè)差異表達(dá)基因的驗(yàn)證分析Fig. 9. Verification assay of 9 differentially expressed genes.

2.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，9個(gè)上調(diào)或下調(diào)表達(dá)基因被隨機(jī)從4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中選取進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。在9個(gè)差異表達(dá)基因中，有6個(gè)基因?qū)儆贏WD vs CK數(shù)據(jù)庫(kù)中與氧化還原相關(guān)且上調(diào)表達(dá)的基因。對(duì)于這9個(gè)基因，除了BGIOSGA026866-TA和BGIOSGA030543-TA基因外，其他基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的表達(dá)模式與這些基因利用表達(dá)譜預(yù)測(cè)的結(jié)果相似（圖9）。利用RNA-seq和qRT-PCR基因表達(dá)數(shù)值以2為底的對(duì)數(shù)進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者的相關(guān)性非常高，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.90077（圖10），驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可信度。

圖#10 qRT-PCR和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的線性回歸分析#Fig. 10. Coefficient analysis of fold change data between qRT-PCR and RNA-seq.

圖11 干濕交替對(duì)水稻根系活力和根表鐵膜的影響Fig.11. Effect of alternate wetting and drying on root activity and iron plaque (IP) on rice root surface.

2.9干濕交替對(duì)水稻根系氧化力及根表鐵膜形成的影響

從圖11可知，干濕交替處理的水稻根系活力和根表鐵膜數(shù)量明顯增加（圖11-C），與對(duì)照相比，干濕交替處理的水稻根系活力增加了22.9%。根表鐵膜數(shù)量增加了45.7%（圖11-B、D），表明干濕交替處理通過(guò)提高水稻根系活力產(chǎn)生了更多的根表鐵膜。

3 討論

轉(zhuǎn)錄組的應(yīng)用在基因組序列、基因調(diào)控、基因差異、轉(zhuǎn)錄后修飾和基因拼接等方面對(duì)進(jìn)一步理解植物的生理和分子機(jī)理提供了新的證據(jù)[25]。Neto等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在氧化脅迫和非生物脅迫處理中，分別有990和1 727個(gè)差異表達(dá)基因被識(shí)別。其中，311個(gè)差異表達(dá)基因共同響應(yīng)氧化脅迫和非生物脅迫。Tian等[27]對(duì)常規(guī)野生型水稻進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，正常葉片與正常根系相比，有3 617個(gè)差異表達(dá)基因上調(diào)表達(dá)，4 171個(gè)差異表達(dá)基因下調(diào)表達(dá)，其中，有535個(gè)基因只在根系中表達(dá)，而不在葉片中表達(dá)。干旱脅迫的水稻根系與對(duì)照相比，有139個(gè)差異表達(dá)基因上調(diào)表達(dá)，有315個(gè)差異表達(dá)基因下調(diào)表達(dá)。最后發(fā)現(xiàn)了37個(gè)基因在水稻根系中特異表達(dá)。為野生型水稻在干旱脅迫條件下提供了一個(gè)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的資源。Wang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，與光合作用相關(guān)的基因在葉片中普遍發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞膜合成和細(xì)胞壁修飾相關(guān)的基因在根系中大量發(fā)現(xiàn)。有5 284個(gè)差異表達(dá)基因響應(yīng)了干旱脅迫，其中，有261個(gè)轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的差異表達(dá)基因受干旱脅迫的誘導(dǎo)。Ray等[29]研究發(fā)現(xiàn)，水分脅迫條件下有1 563個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，1 746個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。在干旱脅迫條件下6個(gè)植物品種中共發(fā)現(xiàn)了5 611個(gè)差異表達(dá)基因。因此，在轉(zhuǎn)錄組分析中，大量差異表達(dá)基因響應(yīng)了非生物脅迫。本研究的結(jié)果也表明，在四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中（AWD vs CK、AWD+Fe vs CK+Fe、CK+Fe vs CK和AWD+Fe vs AWD）共發(fā)現(xiàn)了3822個(gè)差異表達(dá)基因。其中，AWD vs CK（506上調(diào)和687下調(diào)）中差異表達(dá)基因數(shù)多于AWD+Fe vs CK+Fe（308上調(diào)和179下調(diào)），可能與水稻根表鐵膜形成后恢復(fù)部分基因的表達(dá)水平有關(guān)。有趣的是，與干濕交替（AWD vs CK和AWD+Fe vs CK+Fe）相比，CK+Fe vs CK（728上調(diào)和1 175下調(diào)）和AWD+Fe vs AWD（1 252上調(diào)和1 189下調(diào)）有較多的差異表達(dá)基因，表明了水稻根表鐵膜形成過(guò)程中也會(huì)誘導(dǎo)大量差異表達(dá)基因的響應(yīng)。因此，干濕交替和鐵膜形成過(guò)程都能誘導(dǎo)大量差異表達(dá)基因的響應(yīng)，這進(jìn)一步證實(shí)了我們之前的猜想。為了將問(wèn)題簡(jiǎn)單化，本研究先通過(guò)干濕交替處理獲得根系氧化力存在明顯差異的水稻幼苗，然后再進(jìn)行根表鐵膜的誘導(dǎo)過(guò)程。

有研究表明，調(diào)控淀粉新陳代謝、抗氧化防御、呼吸和光合作用相關(guān)基因會(huì)響應(yīng)干旱脅迫。同時(shí)，根系生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、逆境響應(yīng)、木質(zhì)素分解、新陳代謝、氧化還原反應(yīng)和DNA復(fù)制等過(guò)程的相關(guān)基因也受干旱脅迫的誘導(dǎo)[30]。其次，光合作用、呼吸作用、能量的產(chǎn)生、碳-氮的吸收和活化、重要糖/淀粉途徑和氨基酸代謝等相關(guān)基因響應(yīng)干旱脅迫[31]。非生物脅迫也會(huì)調(diào)控植物激素。如植物激素脫落酸受非生物脅迫調(diào)控了許多植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[32]。干旱脅迫會(huì)誘導(dǎo)脫落酸相關(guān)基因的下調(diào)表達(dá)，與水分脅迫相關(guān)的關(guān)鍵酶參與了多元醇和糖類、氨基酸和季銨化合物、細(xì)胞壁松軟和結(jié)構(gòu)組分、膽固醇和長(zhǎng)鏈脂肪酸、細(xì)胞分裂素和第二新陳代謝等的生物合成[29]。同時(shí)，干旱脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞分裂和能量產(chǎn)生等相關(guān)基因的表達(dá)[33]。我們的研究結(jié)果也表明，利用GO分析對(duì)四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中3 822個(gè)差異基因進(jìn)行功能分類，發(fā)現(xiàn)新陳代謝過(guò)程、氧化還原過(guò)程、轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程、電子傳遞、蛋白磷酸化過(guò)程、蛋白水解過(guò)程、氧化脅迫的響應(yīng)過(guò)程和鹽脅迫的響應(yīng)過(guò)程都參與了干濕交替誘導(dǎo)水稻根表鐵膜的形成過(guò)程。值得注意的是，根系氧化還原反應(yīng)過(guò)程所占的基因比例較大。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，在生物通路中，差異表達(dá)基因主要分布在代謝通路、生物合成通路、光合作用通路、信號(hào)刺激通路和細(xì)胞器通路。通過(guò)維恩圖分析發(fā)現(xiàn)，在四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中，有38個(gè)共同差異表達(dá)基因，這些基因與抗病性、抗旱性、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、氧化還原、蛋白激酶和轉(zhuǎn)運(yùn)、新陳代謝蛋白有關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了氧化還原反應(yīng)過(guò)程中差異表達(dá)基因響應(yīng)了干濕交替過(guò)程。有趣的是，我們還發(fā)現(xiàn)4個(gè)潛在的基因未能識(shí)別其蛋白功能，其可能參與干濕交替誘導(dǎo)水稻根表鐵膜的形成過(guò)程[34]。

從AWD vs CK數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)102個(gè)氧化還原相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有30個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，72個(gè)基因下調(diào)表達(dá)（圖2）。從這些上調(diào)表達(dá)基因中，有NADP依賴的氧化酶、鐵/抗壞血酸依賴的氧化酶、Ⅲ型過(guò)氧化物酶、乙醇酸氧化酶、脂肪酸氧化酶和硫氧化還原酶等相關(guān)基因。干濕交替處理能夠誘導(dǎo)大量根表鐵膜的形成（圖6），水稻根表鐵膜的形成可能與這些基因編碼的氧化酶產(chǎn)生大量的氧化性物質(zhì)有關(guān)。有研究表明，光合作用（在光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)Ⅱ中通過(guò)電子傳遞鏈產(chǎn)生）、呼吸作用（通過(guò)電子傳遞鏈產(chǎn)生）、乙醇酸氧化酶、草酸氧化酶、黃嘌呤氧化酶、脂肪酸氧化酶和過(guò)氧化物酶等都會(huì)產(chǎn)生大量的氧化性物質(zhì)H2O2[35]。Wang等[36]研究發(fā)現(xiàn)，綁定在細(xì)胞質(zhì)膜中的NADPH氧化酶催化產(chǎn)生H2O2[37]。其次，H2O2作為一種信號(hào)分子，能夠改變和調(diào)節(jié)植物的生理生化過(guò)程[38,39]。有研究表明，光呼吸系統(tǒng)是產(chǎn)生H2O2最快速的一種方式，主要因?yàn)楣夂粑到y(tǒng)中乙醇酸氧化酶催化乙醇酸，直接產(chǎn)生H2O2[40-42]。干濕交替被認(rèn)為是一種適度的干旱脅迫，而適度干旱脅迫有利于H2O2的產(chǎn)生，H2O2主要來(lái)自于相應(yīng)抗氧化酶如超氧化物岐化酶、過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶等含量的上升，同時(shí)，又能降低H2O2的氧化脅迫[43,44]。我們的研究結(jié)果表明，干濕交替確實(shí)能夠提高水稻根系氧化活力，誘導(dǎo)水稻根表鐵膜的形成（圖6）。因此，干濕交替處理可能誘導(dǎo)大量氧化還原酶相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)水稻根表鐵膜的形成。

此外，通過(guò)基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，干濕交替可能通過(guò)調(diào)控一系列基因的差異表達(dá)參與根表鐵膜的形成，為根表鐵膜形成機(jī)理的研究提供了理論依據(jù)。然而，除了水稻自身，根際特征等非生物因素對(duì)根表鐵膜的形成也有一定影響[45]。干濕交替不僅影響了水稻根系的基因表達(dá)，同時(shí)也會(huì)改變根際周圍土壤的氧化還原狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，干濕交替過(guò)程中，土壤氧化還原電位升高，土壤通氣性增強(qiáng)，根際的氧環(huán)境改變等，增加了根表鐵膜形成所必需的氧氣[3]，這不僅可以直接影響根表鐵膜的形成，也可以通過(guò)提高水稻根系氧化力進(jìn)而影響根表鐵膜形成。水分狀況的改變也會(huì)導(dǎo)致土壤中的鐵形態(tài)發(fā)生變化，在干濕交替過(guò)程中，土壤中的結(jié)晶態(tài)氧化鐵和無(wú)定形氧化鐵相互轉(zhuǎn)化，F(xiàn)e2+與Fe3+相互轉(zhuǎn)化，鐵形態(tài)的變化影響根表鐵膜的形成[46]。另一方面，干濕交替也會(huì)影響根際微生物的活性和群落結(jié)構(gòu)。與鐵膜形成相關(guān)的鐵氧化細(xì)菌和鐵還原細(xì)菌可能通過(guò)響應(yīng)干濕交替過(guò)程改變其數(shù)量和活性，進(jìn)而影響鐵膜的形成[47]?？梢?jiàn)根表鐵膜的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，根際土壤環(huán)境對(duì)根表鐵膜形成的影響有待進(jìn)一步研究。

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Gene Expression Profile Analysis for Alternate Wetting and Drying Induced Formation of Iron Plaque on Root Surface of Rice Seedlings

FU Youqiang1,2, YU Xiaoli1, YANG Xujian1, SHEN Hong1,*
(1College of Natural Resources and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;2Rice Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China;*Corresponding author, E-mail： hshen@scau.edu.cn)

【Objective】Alternate wetting and drying (AWD) could enhance root activity and resistance to environmental stresses, which is the most important management in rice cultivation. AWD could induce the formation of iron plaque on root surface of rice seedlings significantly. However, differentially expressed genes (DEG) of rice roots remains unknown in the process of AWD induced formation of iron plaque. 【Method】In this study, DEG of rice roots were investigated in response to waterlogging (CK), AWD, CK+Fe, AWD+Fe treatments in sand-culture experiments.【Results】Compared with CK, AWD induced up-regulated expression of 506 DEG and down-regulated expression of 687 DEG. Compared with CK+Fe, AWD+Fe induced up-regulated expression of 308 DEG and down-regulated expression of 179 DEG. Compared with CK, CK+Fe induced up-regulated expression of 728 DEG and down-regulated expression of 1175 DEG. Compared with AWD, AWD+Fe induced up-regulated expression of 1252 DEG and down-regulated expression of 1189 DEG. Results from Venn diagram analysis indicated that 3822 DEG were involved in the process of AWD-induced formation of iron plaque on root surface. Gene Ontology(GO) analysis showed that a total of 270 DEG participated in the oxidation-reduction process, and 165 DEG were related to the functions of redox enzymes. Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) results indicated that DEG involved in organelle class, signal stimulus, photosynthesis, metabolism and synthesis etc. participated the regulatory process of AWD induced formation of iron plaque on root surface. Thirty eight shared genes showed differential expression in process of both AWD and the formation of iron plaque. The proteins encoded by these genes were responsible for the resistance to disease, drought, redox, translocation and metabolism of rice. In comparison to CK, AWD induced 102 DEG in the process of oxidation and reduction, which accounted for 8.25% of the total. AWD enhanced up-regulated expression of genes that were associated with peroxidase, fatty acid oxidase, glycolic oxidase etc. In comparison to CK, AWD raised root activity and amount of iron plaque on root surface by 22.9% and 45.7%, respectively. Results of real-time RT-PCR confirmed the transcriptional group analysis with the correlation coefficient 0.90. 【Conclusion】 AWD induced expression of many differential genes, enhanced root oxidative capacity, and formed iron plaque on root surface. Peroxidase, fatty acid oxidase and glycolic oxidase might be important genes involved in AWD-induced formation of iron plaque on root surface of rice seedlings.

rice seedling; alternate wetting and drying (AWD); iron plaque; differentially expressed gene (DEG); oxidation-reduction related genes.

S143.7+2; S511.061

:A

:1001-7216(2017)02-0133-16

2016-07-31；修改稿收到日期:2016-11-22。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31372125）；廣州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2014J4100240）。