韓保林陶宇張洪凱 顧朝劍 廖泳祥 彭永彬 張紅宇 徐培洲 陳曉瓊 吳先軍

水稻葉片內卷突變體rl(t)的鑒定與基因定位

韓保林#陶宇#張洪凱 顧朝劍 廖泳祥 彭永彬 張紅宇 徐培洲 陳曉瓊 吳先軍*

(四川農(nóng)業(yè)大學 水稻研究所/西南作物基因資源與遺傳改良教育部重點實驗室, 成都611130；#共同第一作者;*通訊聯(lián)系人, E-mail:wuxjsau@126.com)

【目的】葉片是水稻理想株型的重要內容，葉片適度卷曲可以提高光合效率。對卷葉相關基因進行遺傳分析和初步定位，為下一步的基因克隆與功能分析提供研究基礎。【方法】利用EMS誘變雄性不育保持系宜香1B獲得一份穩(wěn)定遺傳的葉片向內卷曲突變體，暫命名為rl(t)。在成熟期，測定野生型和rl(t) 的主要農(nóng)藝性狀；在分蘗期，取野生型和rl(t) 葉片用FAA固定液固定進行石蠟切片，同時，用野生型和rl(t)劍葉測定葉綠素含量；在抽穗期，利用Li-6400便攜式光合儀測定10株抽穗期的野生型和rl(t)的光合參數(shù)；將rl(t)與野生型及日本晴雜交，觀察 F1植株表型，對F2表型分離進行χ2測驗，對突變體進行遺傳分析。以 rl(t)/日本晴的 F2群體為材料，利用 BSA 法進行定位?！窘Y果】與野生型相比，突變體葉片向內卷曲明顯，葉片更加直立，葉色變深，其他主要農(nóng)藝性狀均有不同程度降低。光合特性分析表明，突變體比野生型具有更高的光合色素含量，但光合效率沒有明顯差異。葉片組織切片觀察表明，突變體中泡狀細胞變小可能是導致葉片卷曲的主要原因。遺傳分析表明，該突變體受一對隱性核基因控制，利用突變體與日本晴的F2群體進行基因定位，最終將該基因定位在第7染色體長臂InDel標記Ind3和Ind4間610 kb的物理區(qū)間?！窘Y論】rl(t)葉片內卷是由于近軸面泡狀細胞面積減小。RL(t)定位區(qū)間內未見卷葉相關基因報道，推測RL(t)可能是一對新基因。

水稻；卷葉；基因定位

葉片是水稻的主要光合器官，同時也是是水稻理想株型的重要構成因素，與水稻產(chǎn)量密切相關[1]。育種家提出的多個水稻理想株型模式中都將葉片適度內卷作為重要的特征之一，并據(jù)此選育出一系列的高產(chǎn)超級稻品種[2]。葉片適度卷曲，能夠使葉片直立，大田種植中能有效增加群體的透光性。充分發(fā)掘和研究葉形基因對構建水稻理想株型和解析水稻葉形分子機制具有重要意義。

截至目前，科學家通過各種物理和化學方法獲得了大量的葉形材料，并定位和克隆了部分葉片卷曲基因。包括 rl1、rl2、rl3、rl4、rl5、rl6[3]、rl7[4]、rl9(t)[5]、rl10(t)[6]、rl11(t)[7]、url1(t)[8]、nal3[9]、rl12(t)[10]、rl(t)[11]、rl14[12]、rl15(t)[13]、rl16(t)[14]等。隨著分子生物學的發(fā)展，一些葉形基因的研究得以深入。ADL1[15]編碼半胱氨酸蛋白酶，基因突變導致葉片近-遠軸極性改變從而導致葉片向外卷曲。OsAGO7[16]和OsAGO1a[17]屬于Argonaute(AGO)基因家族，OsAGO7的功能獲得性T-DNA插入突變體和抑制OsAGO1a表達的轉基因植株，葉片都表現(xiàn)為外卷。ROC5[18]編碼一個具有亮氨酸拉鏈結構的轉錄因子，負調控泡狀細胞的發(fā)育，功能缺失突變體泡狀細胞大小和數(shù)量都增加，從而導致葉片外卷。此外，ACL1[19]編碼一個無保守結構域的功能未知蛋白，SRL1[20]編碼糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，RL14[12]編碼一個2OG-Fe（Ⅱ）氧化酶，OsCOW1/NAL7[21]屬于水稻YUCCA 基因家族,NRL1[22]編碼糖基轉移酶家族的纖維素合酶類似蛋白。這些基因突變導致葉片卷曲都是由于泡狀細胞數(shù)量和/或大小的改變。SLL1[23]編碼一個KANADI 類轉錄因子，基因突變后導致遠軸面厚壁組織細胞程序化死亡，從而導致突變體葉片向內卷曲，新近報道的SRL2[24]編碼一個新的植物特異蛋白，葉片向內卷曲也是由于遠軸面厚壁組織細胞的缺失，雙突和定量分析表明SLL1和SRL2處于不同的遺傳通路。CFL1[25]編碼一個WW 結構域蛋白，基因突變導致葉片角質層發(fā)育受損從而內卷。挖掘和鑒定新的葉形基因對深入解析葉形分子機制具有重要意義。

本研究利用EMS誘變雄性不育保持系材料宜香1B篩選獲得一份葉片向內卷曲、葉色加深、葉片直立突變體rl(t)，并調查了突變體的表型和主要農(nóng)藝性狀，測定了突變體的光合作用和光合色素含量，通過石蠟切片分析了突變體的葉片組織結構，對突變體進行了遺傳分析和基因定位，以期為進一步研究葉形分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗材料

本實驗室利用EMS誘變宜香1B，在M2獲得一份葉片向內卷曲突變體，暫命名為rl(t)，經(jīng)多代種植突變性狀穩(wěn)定。

1.2遺傳分析和定位群體的構建

2014年夏在四川溫江以rl(t)為母本，宜香1B和日本晴分別為父本雜交,獲得雜種F1；2014年冬在海南陵水，種植F1，F(xiàn)1自交，成熟后按單株收獲全部種子；2015年夏在四川溫江種植rl(t)/宜香1B、rl(t)/ 日本晴的F2群體，成熟期調查rl(t)/宜香1B群體中平展葉片和向內卷曲葉片單株數(shù)進行遺傳分析，選取rl(t)/ 日本晴群體中與突變體rl(t)葉片形態(tài)一致的單株用于基因定位。同時，宜香1B和突變體rl(t)作為對照種植。

1.3農(nóng)藝性狀調查

2015年在四川溫江分別種植rl(t)和宜香1B，田間栽插規(guī)格為15 cm×21 cm，每行10株，常規(guī)田間管理，成熟期隨機調查10株的分蘗數(shù)、株高、結實率和千粒重等農(nóng)藝性狀。

成熟期分別測定突變體與野生型的葉卷曲指數(shù)(LRI，%)與葉直立指數(shù)（LEI，%）[16]，計算公式為LRI=(Lw-Ln)/Lw×100； LEI=Lnl/Lsl×100。其中Ln為自然狀態(tài)下葉片最寬處兩邊緣之間的距離，Lw為葉片展開后兩邊緣間的距離；Lnl為自然狀態(tài)下葉片基部到葉片尖端的距離，Lsl為葉片拉伸后葉片基部到葉片尖端的距離。

1.4葉片組織切片觀察

參照鄒良平等[18]的方法進行。分蘗盛期分別取rl(t)和宜香1B劍葉中間部位用FAA固定液固定，經(jīng)梯度酒精脫水,二甲苯透明，浸蠟和包埋后切片，厚度為10 pm，用甲苯胺藍染色，最后在顯微鏡下觀察拍照。

1.5光合色素及光合參數(shù)的測定

參照Lichtenthaler的方法[26]，分蘗盛期分別取rl(t)和宜香1B劍葉，去除主脈剪碎，各稱取0.20 g，浸泡在30 mL 體積分數(shù)為80%的丙酮溶液中，24℃黑暗條件下放置48 h，10 000 r/min下離心10 min，用紫外分光光度計分別在663 nm、646 nm和470 nm 3個波長下測定rl(t)和宜香1B的光密度值，每個樣品重復3次。

表1 基因定位分子標記引物及qRT-PCR引物序列Table 1. The sequences of molecular markers used for gene mapping and qRT-PCR markers.

大田條件下，利用Li-6400便攜式光合儀(LI-COR, 美國)分別測定10株抽穗期的rl(t)和野生型葉片的凈光合速率、氣孔導度、CO2胞間濃度和蒸騰速率。

1.6DNA提取和基因定位

采用CTAB法[27]提取基因組DNA，選取平展葉片單株和葉片內卷單株各15株，提取DNA分別構建DNA顯、隱池。利用均勻分布于水稻12條染色體上的500對SSR及InDel標記篩選rl(t)和日本晴間多態(tài)性標記，用多態(tài)性標記進行F2顯、隱池分析，找到連鎖標記，再用單株進行驗證。在初定位的基礎上，利用已經(jīng)公布的93-11和日本晴基因組序列，運用 Primer 5.0軟件設計InDel引物（表1）縮小定位區(qū)間。

1.7卷葉相關基因的實時PCR分析

抽穗期分別取野生型與突變體劍葉，采用Trizol試劑提取總RNA, 使用逆轉錄試劑盒HiScript Q RT SuperMix for qPCR，將總RNA純化反轉成cDNA。 對RL14、ACL1、NAL7、NRL1、SRL1、ROC5、OsAGO7、SLL1、SRL2及CFL1等與葉片卷曲相關基因進行定量分析。引物設計見表1。以Actin為內參, 50 μL PCR體系, 設置3次重復,具體操作參照Vazyme公司SYBR Green Master Mix說明書，反應在Bio-Rad CYF96型定量PCR儀上進行。

2 結果與分析

2.1突變體表型分析

突變體rl(t)與野生型最顯著差異表現(xiàn)在葉片上，野生型葉片近乎平展，葉色淡綠，而rl(t)葉片向內卷曲嚴重，且葉色深綠（圖1-A、B）。rl(t)在3葉期時葉片開始向內卷曲，隨著生長，內卷逐漸明顯。突變體劍葉、倒2葉和倒3葉的卷曲指數(shù)分別為64.85%、67.42%、71.80%，遠高于野生型（圖1-C）。突變體葉片更加直立，與野生型相比，rl(t)劍葉、倒2葉和倒3葉的葉片直立指數(shù)均顯著增加。除葉片外，突變體與野生型在生育期、株高、分蘗數(shù)、穗長、每穗實粒數(shù)、每穗粒數(shù)、結實率、粒長及千粒重等性狀方面均存在極顯著差異（表2）。

2.2光合作用與光合色素含量測定

在分蘗期分別測定野生型和突變體劍葉的光合色素含量，結果表明，rl(t)的葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素含量均極顯著增加，類胡蘿卜素顯著增加（圖2）。

同時，測定野生型和突變體光合參數(shù)。rl(t)的凈光合速率、氣孔導度及蒸騰速率都低于野生型，而胞間二氧化碳濃度則高于野生型，但所有差異都未達到顯著水平（表3）。

2.3葉片形態(tài)的組織學分析

為從組織層面解析rl(t)葉片卷曲原因，抽穗期取野生型和突變體葉片固定進行石蠟切片。結果顯示，在葉片卷曲處，野生型泡狀細胞大小為2904.45 μm2, rl(t)為1126.3 μm2，突變體的泡狀細胞面積明顯減小，而其他部位未發(fā)現(xiàn)明顯異常（圖3）。表明可能是泡狀細胞面積減小導致了葉片向內卷曲。

圖1 野生型宜香1B與突變體rl(t)的表型特征Fig.1. Phenotype of wild type Yixiang 1B and mutant rl(t).

表2 宜香1B與rl(t)的農(nóng)藝性狀比較Table 2. Comparison of agronomic traits between rl(t) and its wild type.

2.4遺傳分析與基因定位

rl(t)/宜香B和rl(t)/日本晴的F1葉片均呈平展，rl(t)/宜香1B的F2群體遺傳分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2群體葉片呈現(xiàn)分離，在總共200個單株中，157個單株表現(xiàn)為葉片平展，43個單株表現(xiàn)為葉片向內卷曲，經(jīng)χ2測驗, 平展葉∶卷葉符合3∶1的分離比(χ2= 1.31)，此外，rl(t)/日本晴的F2群體展葉與卷葉單株數(shù)分別為1905和579個單株，同樣符合3∶1分離比(χ2=3.79)，綜合結果表明葉片卷曲由一對隱性單基因控制。

圖2 野生型宜香1B與突變體rl(t)光合色素比較Fig.2. Comparison of leaf photosynthetic pigment contents between Yixiang 1B and rl(t).

圖3 野生型宜香1B與突變體rl(t)的葉片細胞學分析Fig.3. Cytology analysis of Yixiang 1B(WT) and the rl(t) mutant at the heading stage.

圖4 RL(t)的基因定位Fig. 4. Molecular mapping of RL(t).

表3 野生型宜香1B與突變體rl(t)光合特性比較Table 3. Comparison of the photosynthetic characters between Yixiang 1B and rl(t).

以rl(t)/日本晴的F2群體為定位群體，利用在雙親間表現(xiàn)多態(tài)性的428對引物，通過集團分離分析法進行基因定位（圖4），發(fā)現(xiàn)在第7染色體長臂上的標記RM3394與RM5752在基因池間表現(xiàn)連鎖。然后利用579個隱性單株進行驗證和初步定位，結果將RL(t)定位在RM3394與RM5725之間，遺傳距離分別為3.37 cM和2.76 cM。

為進一步精細定位，在RM3394與RM5725之間共設計了9對插入缺失（Ind）標記, 其中6對表現(xiàn)多態(tài)性(表1) 。利用多態(tài)性標記對579個隱性單株進行連鎖分析，最終將RL(t)定位在Ind3與Ind4之間，遺傳距離分別為0.95 cM和0.69 cM，根據(jù)已公布的9311參考序列，兩者物理距離為610 kb。在水稻MSU-RGAP數(shù)據(jù)庫（http：//rice. plantbiology.msu.edu/index.shtml）查詢，在該定位區(qū)間內共有102個基因，沒有與葉形相關基因。

圖5 卷葉相關基因在野生型宜香1B與突變體rl(t)葉片中的實時PCR分析Fig. 5. Real-time PCR analysis of the genes related to rolled leaf in leaves of Yixiang 1B and rl(t).

2.5卷葉相關基因的實時PCR分析

為了研究rl(t)與其他已經(jīng)報道卷葉基因的關系，我們對與葉片卷曲相關的10個基因進行了實時PCR分析。結果發(fā)現(xiàn)，與泡狀細胞發(fā)育相關基因ACL1、RL14、NAL7、NRL1、SRL1表達量下調，ROC5表達量則出現(xiàn)上調，與葉片極性發(fā)育相關的OsAGO7、SLL1、SRL2及與角質層相關基因CFL1的表達量無明顯變化（圖5），暗示rl(t)可能與ACL1、RL14、NAL7、NRL1、SRL1及ROC5處于同一調控通路，通過調控泡狀細胞的發(fā)育影響葉片的卷曲。

3 討論

葉片卷曲是水稻葉形特征之一。目前水稻中發(fā)現(xiàn)了豐富的水稻葉卷材料，根據(jù)葉片卷曲方向可分為內卷和外卷，根據(jù)卷曲程度可分為高度筒卷、中度卷曲和微卷，根據(jù)卷曲發(fā)生的時期可分為全生育期卷曲、生育前期卷曲而后期展開和前期不卷而后期卷曲。本研究中rl(t)屬于內卷，高度筒卷且表現(xiàn)為全生育期卷曲。除了葉形上的變化，rl(t)葉片顏色加深，實驗數(shù)據(jù)表明，rl(t)葉片葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素及類胡蘿卜素含量均極顯著或顯著高于野生型，但rl(t)的光合效率與野生型無明顯改變，推測與葉片向內卷嚴重、光合面積減少相關，這與趙芳明[28]等研究結果一致。

水稻中已經(jīng)定位克隆多個控制葉片卷曲的基因，通過分析發(fā)現(xiàn)，影響葉片卷曲的形成機制，可以分為四類:第一類，近-遠軸極性的改變導致葉片卷曲，例如SLL1[24]、ADL1[15]、OsAGO7[16]、OsAGO1a[17]等；第二類，泡狀細胞異常導致葉片卷曲，例如ROC5[18]、ACL1[19]等；第三類，厚壁組織發(fā)育異常導致葉片卷曲，例如SLL1[24]、SRL2[25]；第四類，角質層發(fā)育異常導致葉片卷曲，例如CFL1[26]。其中，泡狀細胞異常導致葉片卷曲是報道最多的一類。泡狀細胞是水稻的動力細胞，在水分儲藏、調控葉片的伸展和卷曲上起著重要作用[29]。泡狀細胞導致葉片卷曲，主要是通過影響泡狀細胞的數(shù)量和/或大小。SRL1[20]、LC2[30]、OsHox32[31]和YABBY1[32]等通過調控泡狀細胞數(shù)量控制葉片的卷曲，RL14[12]、OsMYB103L[33]和NRL1[23]等通過影響泡狀細胞的大小調控葉片卷曲，而ROC5[18]、ACL1[19]、NAL7[22]等則是同時作用于泡狀細胞的數(shù)量和大小調控葉片卷曲。本研究中，石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，rl(t)的泡狀細胞面積較野生型明顯增加，而細胞數(shù)量幾乎沒有變化，表明泡狀細胞面積的增加是導致rl(t)卷曲的主要原因。同時，定量PCR分析表明，rl(t)主要影響與泡狀細胞相關基因的表達，推測rl(t)可能參與調控水稻葉片泡狀細胞的發(fā)育。

本研究將RL(t)定位在第7染色體長臂兩個InDel標記Ind3和Ind4之間，物理距離為610 kb。已報道的SRL1[20]也位于第7染色體，但與RL(t)不在同一區(qū)間，且物理位置較遠。在定位區(qū)間內未見葉形相關基因報道，推測RL(t)可能是一個控制水稻葉片卷曲的新基因。

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Identification and Gene Mapping of a Rolled Leaf Mutant rl(t) in Rice

HAN Baolin#, TAO Yu#, ZHANG Hongkai, GU Chaojian, LIAO Yongxiang, PENG Yongbin, ZHANG Hongyu, XU Peizhou, CHEN Xiaoqiong, WU Xianjun*
(Rice Research Institute, Sichuan Agricultural University/Key Laboratory of Southwest Crop Genetic Resource and Improvement, Ministry of Education, Chengdu 611130, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: Wuxjsau@126.com)

【Objective】Rice leaf is an important factor for ideal plant architecture in rice, and moderate rolling of the leaves can improve light acceptance and photosynthetic rate. Genetic analysis and primary mapping of the target genes are useful in map-based cloning and function analysis.【Method】A stable inherited mutant, derived from an indica maintainer line Yixiang 1B by EMS treatment, exhibited significantly inward-rolling, more erect and green leaves. At the maturity stage, 10 plants of rl(t) and its wild type(WT) were randomly selected to measure the main agronomic traits including leaf rolling index and leaf erect index. At the tillering stage, the same part of leaf of rl16(t) and WT was taken and fixed by FAA for paraffin sectioning. The chlorophyll content in rl16(t) and WT was tested at the same stage. At the heading stage, the photosynthetic rate, intercellular carbon dioxide concentration, stamatal conductance，and transpiration rate of flag leaves in rl15(t) and WT were measured by using the portable gas exchange system Li-6400.【Result】Compared to wide type, rl(t) displayed reduced plant height, shortened panicle length as well as other agronomic traits. Leaf photosynthetic pigment contents were significantly higher than those of the wild type. However, no difference is observed in photosynthetic efficiency. Cytological analysis showed that the rolled leaf phenotype was possibly caused by the reduced size of bulliform cells. Genetic analysis indicated that rolled leaf phenotype in rl(t) was controlled by a single recessive nuclear gene. In an F2population derived from a cross between the mutant and Nipponbare, RL(t) was mapped to a 610 kb region between Ind3 and Ind4 on the long arm of chromosome 7. In target region, there are 102 genes altogether.【Conclusion】The rolled leaf of rl(t) was due to increased area of bulliform cells in adaxial layer and no gene related to roll-leaf was reported in the target region. So, RL (t) gene would be a putative novel rolled leaf gene.

rice; rolled leaf; gene mapping

Q343.5; S511.024

A

:1001-7216(2017)02-0149-08

2016-10-20； 修改稿收到日期:2016-12-29。

國家重點研發(fā)計劃資助項目(2016YFD0100406)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201403002-3)；四川省農(nóng)作物育種攻關項目。