許作鵬 仲崇元 張麗佳 劉巧泉

水稻脆稈突變體bc1-wu3的鑒定與基因克隆

許作鵬 仲崇元 張麗佳 劉巧泉*

(揚(yáng)州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 揚(yáng)州225009;*通訊聯(lián)系人, E-mail：qqliu@yzu.edu.cn)

【目的】莖稈機(jī)械強(qiáng)度與植株抗倒伏性直接相關(guān)。發(fā)掘脆稈突變體，克隆其相關(guān)基因有助于了解莖稈機(jī)械強(qiáng)度遺傳機(jī)制，為抗倒伏育種提供理論依據(jù)。【方法】在經(jīng)60Co-γ誘變的粳稻品種武育粳3號(hào)后代群體中獲得一個(gè)脆稈突變體，命名為bc1 -wu3（brittle culm 1 from Wuyujing3），以突變體bc1 -wu3為母本，Kasalath為父本構(gòu)建相應(yīng)的F2分離群體，采用圖位克隆的方法定位相應(yīng)脆稈基因。【結(jié)果】與野生型相比，突變體的葉片、葉鞘、莖稈等組織在全生育期始終表現(xiàn)為脆性，易折斷；穗長和粒長顯著降低，粒寬顯著增加。莖稈細(xì)胞細(xì)胞壁糖成分測定表明，細(xì)胞壁中纖維素含量極顯著下降，而木糖、葡萄糖及阿拉伯糖含量則顯著增加。莖稈切片觀察發(fā)現(xiàn)突變體莖稈的厚壁細(xì)胞層數(shù)減少，厚壁細(xì)胞細(xì)胞壁極顯著變薄。遺傳分析表明，bc1- wu3脆性性狀受1對(duì)隱性核基因控制。采用圖位克隆的技術(shù)將該基因定位于第3染色體標(biāo)記MK12與MK18之間，物理距離為57 kb，在此定位區(qū)段內(nèi)包含1個(gè)已克隆的脆性基因BC1（LOC_Os03g30250）。測序結(jié)果表明，突變體bc1-wu3中BC1基因第2外顯子內(nèi)（CDS 659處）有1個(gè)堿基的替換(G-T)，導(dǎo)致編碼氨基酸由半胱氨酸變異為苯丙氨酸。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，BC1基因在脆稈突變體bc1-wu3莖稈中的表達(dá)量顯著降低?！窘Y(jié)論】據(jù)此推斷本研究中定位的脆稈基因bc1-wu3為BC1新等位基因。相關(guān)結(jié)果加深了對(duì)BC1基因功能的認(rèn)識(shí)，有助于闡明水稻莖稈強(qiáng)度遺傳機(jī)制。

水稻；脆稈突變體；BC1基因；遺傳分析；基因定位

水稻是重要的糧食作物，其產(chǎn)量直接關(guān)系糧食安全。在眾多影響產(chǎn)量的因素中，倒伏是重要的限制因子[1-2]。莖稈是水稻的重要組織，支撐著整個(gè)植株的質(zhì)量。莖稈的機(jī)械強(qiáng)度與抗倒伏性密切相關(guān)，是影響水稻產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一。莖稈的機(jī)械強(qiáng)度取決于莖稈機(jī)械組織的特性和發(fā)育狀況，是細(xì)胞壁的次生壁理化性質(zhì)的具體體現(xiàn)[3-4]。在自然或人工誘變情況下，與細(xì)胞壁合成相關(guān)基因的突變會(huì)引起植株莖稈機(jī)械強(qiáng)度降低，產(chǎn)生脆稈突變體。脆稈突變體是闡明莖稈機(jī)械強(qiáng)度遺傳機(jī)制及細(xì)胞壁合成調(diào)控機(jī)制的理想材料，同時(shí)在水稻生產(chǎn)上也具有重要的應(yīng)用價(jià)值[5]。

目前已報(bào)道的脆稈突變體有20多個(gè)，已克隆的控制莖稈機(jī)械強(qiáng)度的基因有10個(gè)[6]。BC14/OsNST1基因調(diào)控非纖維素多糖的形成，突變后植株細(xì)胞壁中纖維素含量降低，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致莖稈機(jī)械強(qiáng)度降低和植株發(fā)育異常[7]。BC10參與細(xì)胞壁多糖的形成，突變導(dǎo)致莖稈和葉片的脆性增加，莖稈機(jī)械強(qiáng)度降低[8]；BC3/DRP2B 編碼1個(gè)經(jīng)典的發(fā)動(dòng)蛋白OsDRP2B，突變后莖稈機(jī)械強(qiáng)度顯著降低[9-10]；OsCesA4、OsCesA7和OsCesA9直接影響纖維素合成，突變后莖稈機(jī)械強(qiáng)度顯著下降[11-15]；BC1編碼類COBRA蛋白，BC12/KIF4編碼驅(qū)動(dòng)蛋白，基因突變后會(huì)影響纖維素微纖絲排列和沉積，莖稈機(jī)械強(qiáng)度顯著下降[16-17]；BC15/OsCTL1編碼1個(gè)膜相關(guān)的類幾丁質(zhì)酶蛋白，基因突變后細(xì)胞壁中纖維素含量降低[18]；CEF1/OsMYB103L突變影響水稻次生壁合成，導(dǎo)致纖維素合成減少以及機(jī)械強(qiáng)度降低等[19]。通過克隆這些水稻控制莖稈機(jī)械強(qiáng)度的基因，我們對(duì)莖稈機(jī)械強(qiáng)度遺傳機(jī)制及細(xì)胞壁合成途徑有了一定的認(rèn)識(shí)。因此，進(jìn)一步發(fā)掘脆稈突變體，并利用這些材料開展研究有助于完善對(duì)莖稈機(jī)械強(qiáng)度遺傳機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為解析復(fù)雜的倒伏性狀提供一個(gè)很好的切入點(diǎn)。

利用60Co-γ誘變粳稻品種武育粳3號(hào)，在其后代中獲得1份脆稈突變體, 命名為bc1-wu3。我們仔細(xì)觀察了該突變體的表型和莖稈細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，并測定了莖稈細(xì)胞細(xì)胞壁中相關(guān)糖組分的含量,分析了突變體脆性產(chǎn)生的理化基礎(chǔ)；通過遺傳分析并利用圖位克隆的技術(shù)確定了控制該脆性性狀的候選基因。序列和表達(dá)分析推斷bc1-wu3突變基因是BC1基因的新等位基因。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

2012年，在粳稻品種武育粳3號(hào)60Co-γ誘變的群體中，發(fā)現(xiàn)了1份植株莖稈變脆的突變體，將其命名為bc1-wu3。經(jīng)多代連續(xù)種植，突變體脆性表型能穩(wěn)定遺傳。2014年在揚(yáng)州以秈稻品種Kasalath為父本與突變體bc1-wu3雜交獲得F1，2014年冬季在海南種植F1及相應(yīng)親本，成熟期收獲F1植株自交種子。2015年正季在江蘇揚(yáng)州種植組合bc1-wu3/ Kasalath的F2群體及對(duì)應(yīng)親本。

1.2表型鑒定

2015年正季將突變體bc1-wu3和野生型（WT）武育粳3號(hào)種植于揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地，小區(qū)種植，3次重復(fù)，管理與一般大田相同。期間調(diào)查WT與突變體的生育期，并在全生育期期間田間觀察突變體與野生型的脆性表型。成熟后隨機(jī)從小區(qū)中央選取10株考查株高、分蘗數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、粒長和粒寬等性狀。

1.3莖稈機(jī)械強(qiáng)度測定

水稻植株抽穗25 d后，在野生型和突變體小區(qū)中央各選取10株正常生長發(fā)育的植株，利用莖稈強(qiáng)度測定儀（浙江托普儀器有限公司，DYY-1型）測定主莖穗倒2節(jié)間莖稈的機(jī)械強(qiáng)度。

1.4細(xì)胞學(xué)觀察

參考Song等[20]及蔡建秀等[21]的方法，利用掃描電鏡（日本，S-3000N/Hitachi）觀察及分析WT和突變體種子穎殼背面的細(xì)胞大小。抽穗后取發(fā)育時(shí)期相近的WT和突變體倒2節(jié)間中間部位2～4 mm小段，經(jīng)2.5%戊二醛的PBS緩沖液4℃下固定48 h后再用1%鋨酸溶液固定過夜。固定后的樣品經(jīng)PBS緩沖液漂洗，乙醇和丙酮脫水后依次用倫敦白膠樹脂（London Resin White，Sigma公司）與乙醇以1∶3、1∶1和3∶1的體積比混合浸透，最后用純樹脂繼續(xù)浸透48 h，并于模塊中包埋，60℃下聚合24 h。樣品修塊后以80 nm超薄切片，放置于銅網(wǎng)上，觀察前用醋酸鈾和檸檬酸鉛復(fù)染。樣品在掃描電鏡上觀察。對(duì)不同切片樣品的觀察不少于2次，每次觀察的細(xì)胞數(shù)量不少于10個(gè)。

1.5莖稈細(xì)胞細(xì)胞壁組分含量測定

水稻植株成熟后，隨機(jī)從每個(gè)小區(qū)中央分別選取10株野生型和突變體，取倒2節(jié)間測定莖稈細(xì)胞細(xì)胞壁成分，參考Xiong等[9]的方法進(jìn)行測定。

1.6分子標(biāo)記開發(fā)及基因定位

利用混池法（bulked segregant analysis, BSA），在bc1-wu3/Kasalath衍生的F2分離群體中隨機(jī)選取正常與脆稈單株葉片各10株混成2個(gè)池，采用CTAB法[20]提取水稻葉片基因組DNA。SSR 分子標(biāo)記信息來源于Gramene(http：//www. gramene. org/)，InDel標(biāo)記根據(jù)NCBI(http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/)數(shù)據(jù)庫中提供的9311與日本晴序列差異開發(fā)，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成（表1）。選取武育粳3號(hào)與Kasalath之間存在多態(tài)性的189對(duì)SSR分子標(biāo)記擴(kuò)增上述DNA，以獲得連鎖標(biāo)記。PCR體系(20 μL)如下:模板DNA 1.0 μL，10×PCR緩沖液2.0 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，2 mmol/L dNTP 2.0 μL，0.3 μmol/L引物2.0 μL，Taq酶0.5 U，加ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR擴(kuò)增條件如下:95℃下預(yù)變性5 min；94℃下變性40 s，50～60℃下退火40 s（溫度因引物不同而異），72℃下延伸40 s，32個(gè)循環(huán)；72℃下延伸10 min，18℃下保溫。PCR產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠中分離，經(jīng)溴化乙錠染色后在凝膠成像儀（BIO-RAD公司，Gel DocTmXR+ imaging system）上成像。

表1 本研究中使用的PCR引物Table 1. PCR primers used in this study.

1.7候選基因分析

根據(jù)基因精細(xì)定位結(jié)果，查閱在水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫(http：//rice genome annotation project)相應(yīng)區(qū)間內(nèi)的所有開放閱讀框(ORF)，分析可能的候選基因。根據(jù)候選基因全長基因組DNA序列，設(shè)計(jì)測序引物，分別對(duì)野生型和突變體的基因組進(jìn)行擴(kuò)增并測序。測序結(jié)果通過DNASTAR軟件進(jìn)行比對(duì)，確定突變位點(diǎn)。

1.8RT-PCR

利用天根公司的RNA提取試劑盒（RNA prep pure Plant Kit）提取武育粳3號(hào)及突變體bc1-wu3莖稈中的總RNA，并用TaKaRa公司的去除基因組逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[Primer Scripttm RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)]反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一條鏈。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析bc1-wu3基因在武育粳3號(hào)及突變體bc1-wu3莖稈中的表達(dá)量。用內(nèi)參基因Actin進(jìn)行歸一化處理，利用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)所用試劑為TaKaRa公司的定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTM)，所用儀器為CFX96實(shí)時(shí) PCR儀（BIO- RAD公司生產(chǎn)）。實(shí)時(shí)qPCR體系包括cDNA模板2 μL、SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μL、正反向引物各0.4 μL（終濃度0.2 μmol/L）、ddH2O補(bǔ)足20 μL。每個(gè)樣品生物學(xué)重復(fù)3次，技術(shù)性重復(fù)3次。PCR擴(kuò)增采用兩步法，程序如下:95℃下30 s；95℃下5 s，60℃下30 s，39個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析:95℃下10 s，65℃下5 s，95℃下5 min。

1.9數(shù)據(jù)分析

利用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1突變體表型特征及農(nóng)藝性狀分析

在大田生長條件下，與野生型相比，突變體bc1-wu3的株型變化不明顯（圖1-A），但其葉片、葉鞘、莖稈在整個(gè)生育期均表現(xiàn)出脆性（圖1-B、C）；bc1-wu3的穗長、粒長均顯著降低，較野生型分別降低了10.80%和1.97%；粒寬顯著增加，增加比例為6.34%(圖1-D、E、F， 表2)；突變體其他性狀，如抽穗期、株高、分蘗數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重等與WT無顯著差異 （表2）。利用掃描電鏡觀察WT和突變體種子的穎殼，結(jié)果表明，突變體種子穎殼背面細(xì)胞的寬度較WT顯著增加，而細(xì)胞長度則顯著縮短，表明突變體種子穎殼細(xì)胞大小的變化引起突變體粒型發(fā)生相應(yīng)變化（圖2）。

圖1 野生型(WT)與突變體bc1-wu3表型的比較Fig. 1. Comparison of the phenotypes between wild type(WT) and bc1-wu3.

表2 野生型(WT)和突變體bc1-wu3的農(nóng)藝與產(chǎn)量性狀Table 2. Agronomic and yield traits of wild type(WT) and bc1-wu3.

2.2突變體莖稈機(jī)械強(qiáng)度測定及莖稈橫切面細(xì)胞學(xué)觀察

莖稈機(jī)械強(qiáng)度測定結(jié)果表明，突變體bc1-wu3的莖稈機(jī)械強(qiáng)度較野生型下降79.32%，呈現(xiàn)極顯著差異（圖3）；莖稈橫切面細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果表明，突變體莖稈的厚壁細(xì)胞層數(shù)較野生型減少（圖4-A～B），厚壁細(xì)胞細(xì)胞壁極顯著變?。▓D4-C～E）。以上結(jié)果表明，莖稈細(xì)胞形態(tài)上的變化，特別是厚壁細(xì)胞層數(shù)的減少及厚壁細(xì)胞細(xì)胞壁變薄會(huì)降低水稻莖稈的機(jī)械強(qiáng)度。

2.3突變體莖稈細(xì)胞細(xì)胞壁中糖組分含量分析

莖稈細(xì)胞細(xì)胞壁糖組分含量測定結(jié)果表明(表3)，突變體bc1-wu3莖稈細(xì)胞細(xì)胞壁中纖維素含量較WT呈現(xiàn)極顯著下降，下降比例為38.77%；木糖、葡萄糖及阿拉伯糖含量則顯著增加，增加比例分別為42.86%、21.11%和26.21%；其他中性糖的含量變化幅度較小，差異不顯著。

2.4突變體脆稈性狀的遺傳分析及基因精細(xì)定位

Kasalath與突變體bc1-wu3配置的F1植株表型正常，F(xiàn)2群體出現(xiàn)明顯的表型分離，其中正常株3014株，脆性株987株。經(jīng)卡方測驗(yàn)，正常株與脆性株符合3∶1分離比（χ2=1.24＜χ20.05,1=3.84）, 結(jié)果說明突變體bc1-wu3脆性性狀受1對(duì)隱性核基因控制。

圖2 野生型(WT)與突變體bc1-wu3種子穎殼細(xì)胞形態(tài)的比較Fig. 2. Comparison of the size of grain glume cell between wild type(WT) and bc1-wu3.

表3 野生型(WT)與突變體bc1-wu3莖稈細(xì)胞細(xì)胞壁中糖組分含量比較Table 3. Comparison of the sugar composition contents of culms between wild type(WT) and bc1-wu3. mg/g

圖3 野生型(WT)和突變體bc1-wu3的莖稈機(jī)械強(qiáng)度Fig. 3. Culm strength of wild type(WT) and bc1-wu3.

為定位該脆性基因，利用均勻分布于水稻12條染色體上的380對(duì)SSR標(biāo)記及STS標(biāo)記，篩選出189對(duì)在bc1-wu3與Kasalath之間顯示多態(tài)性的標(biāo)記。利用上述多態(tài)標(biāo)記，運(yùn)用BSA法對(duì)該基因進(jìn)行連鎖分析。結(jié)果表明(圖5)， bc1-wu3基因與第3染色體上的標(biāo)記RM6676和STS3-86.6連鎖。利用94株脆性單株驗(yàn)證了這兩對(duì)標(biāo)記，且在RM6676處檢測到2個(gè)交換單株。在標(biāo)記STS3-86.6處檢測到1株交換單株，由交換單株信息可知，該基因位于這2對(duì)標(biāo)記之間。隨后利用這2對(duì)標(biāo)記對(duì)893株F2脆性單株進(jìn)行檢測，在標(biāo)記RM6676處找到13株交換單株，在標(biāo)記STS3-86.6處找到10株交換單株。為進(jìn)一步精細(xì)定位該基因，在標(biāo)記RM6676與STS3-86.6之間設(shè)計(jì)了15對(duì)InDel標(biāo)記，其中有5對(duì)標(biāo)記在bc1-wu3與Kasalath之間顯示出多態(tài)（表1）。利用這5對(duì)標(biāo)記和26株交換單株，最終將突變基因bc1-wu3定位于InDel標(biāo)記MK12與MK18之間，物理距離為57 kb。根據(jù)水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫信息，這一區(qū)段位于日本晴克隆AC120538上(圖5)。

圖4 野生型(WT)和突變體bc1-wu3莖稈細(xì)胞結(jié)構(gòu)Fig. 4. Scanning electron micrographs of the culm phenotype of wild type(WT) and bc1-wu3.

圖5 bc1-wu3基因精細(xì)定位及候選基因序列分析Fig. 5. Fine mapping of bc1-wu3 gene and sequence analysis of the candidate gene.

圖6 BC1基因在水稻莖稈中的表達(dá)量Fig. 6. Expression analysis of the BC1 gene in culm of rice.

2.5候選基因預(yù)測

根據(jù)水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫注釋信息可知，InDel標(biāo)記MK12與MK18之間包含10個(gè)開放閱讀框(LOC_Os03g30220～LOC_Os03g30300)，該區(qū)段內(nèi)包含1個(gè)已克隆的與細(xì)胞壁合成相關(guān)的基因BC1(BRITTLE CULM1)[17]，BC1基因突變導(dǎo)致莖稈機(jī)械強(qiáng)度降低。基于此，首先對(duì)該基因的ORF進(jìn)行測序(表1)。測序結(jié)果表明，突變體bc1-wu3中該基因在第2外顯子內(nèi)(CDS 659處)有1個(gè)堿基的替換(G-T)，引起編碼的氨基酸由半胱氨酸(Cysteine)變?yōu)楸奖彼?Phenylalanine)(圖5)。由 RT-PCR結(jié)果可知，突變體bc1-wu3莖稈中BC1基因的表達(dá)量比野生型顯著低(圖6)。因此，我們推測bc1-wu3基因?yàn)锽C1的新等位基因。

3 討論

水稻莖稈的機(jī)械強(qiáng)度作為水稻的重要農(nóng)藝性狀，直接關(guān)系到水稻的產(chǎn)量[23]。已有研究表明，控制水稻莖稈機(jī)械強(qiáng)度的機(jī)制復(fù)雜，任何一種細(xì)胞壁成分上的改變或者調(diào)節(jié)因子的變化都會(huì)直接或間接地影響莖稈的機(jī)械強(qiáng)度[3-4,24]。目前，一系列脆稈基因的克隆對(duì)揭示水稻控制莖稈機(jī)械強(qiáng)度的遺傳機(jī)制起了重要的作用，但其遺傳機(jī)制還有待進(jìn)一步完善[25]。

目前報(bào)道的脆性突變體可分為兩類，第一類是脆稈突變體，表現(xiàn)為莖稈、葉片、葉鞘等器官的機(jī)械強(qiáng)度降低，如突變體bc1、bc3、bc6、bc7、bc12、 bc14、bc15等，第二類為脆節(jié)突變體，其只在葉和莖的發(fā)育節(jié)點(diǎn)上表現(xiàn)出脆性，莖稈和葉片等組織的機(jī)械強(qiáng)度并沒有發(fā)生顯著變化，如bc5[27]。脆稈突變體往往會(huì)伴隨著其他農(nóng)藝性狀的改變，如bc10、bc11、bc12、bc14、cef1、dwf1[28]、fld1等，這些突變體均表現(xiàn)出植株矮化，小穗育性降低等；bc10、bc6、bc88、dwf1等突變體的分蘗數(shù)均顯著下降；突變體dwf1的千粒重極顯著下降。但在脆稈突變體中也有除了莖稈強(qiáng)度降低外，其他主要農(nóng)藝性狀沒有明顯變化，如突變體bc1、bc15。本研究中，突變體bc1-wu3的莖稈、葉片、葉鞘等組織的機(jī)械強(qiáng)度極顯著下降，是一個(gè)典型的脆稈突變體。相比其他脆稈類突變體，bc1-wu3基因除了引起植株莖稈的機(jī)械強(qiáng)度極顯著降低外，還引起突變體的穗長、粒長和粒寬的變化,有趣的是粒型變化并沒有引起籽粒千粒重改變。掃描電鏡結(jié)果表明，bc1-wu3突變體穎殼細(xì)胞大小的改變引起籽粒的長和寬的改變。類似粒型的變化之前沒有報(bào)道，相關(guān)研究結(jié)果豐富了對(duì)脆稈基因功能的認(rèn)識(shí)。

遺傳分析及RT-PCR結(jié)果表明，bc1-wu3基因?yàn)锽C1基因的新等位基因。目前已報(bào)道的BC1基因的等位基因有2個(gè)[17]，這兩個(gè)突變體與本研究中鑒定的突變體bc1-wu3相比，在脆性表型上存在差異，雖然三者莖稈機(jī)械強(qiáng)度均降低，但突變體bc1-wu3莖稈機(jī)械強(qiáng)度降低更明顯，降低比例為79.32%。就BC1基因而言，3個(gè)突變體中BC1基因變異位點(diǎn)不同，突變體bc1-1中，發(fā)現(xiàn)在425處密碼子中有一個(gè)單堿基(T)插入(TTC→TTTC)，產(chǎn)生a+1的移碼突變；bc1-101等位基因突變則是由于第1外顯子236和237密碼子處有4個(gè)堿基的缺失(AGGTGC→AC)，這個(gè)缺失引起了移碼突變，從而導(dǎo)致在292密碼子處產(chǎn)生終止密碼子，這兩類突變均導(dǎo)致氨基酸鏈長度發(fā)生改變；而bc1-wu3中突變形式僅為1個(gè)氨基酸的替換，氨基酸鏈的長度沒有變化，說明該突變位點(diǎn)為BC1基因發(fā)揮功能的重要位點(diǎn)。雖然Liu等[26]已對(duì)BC1參與纖維素合成的作用機(jī)制及水稻次生壁形成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了研究，但并沒有報(bào)道該位點(diǎn)。因此，該位點(diǎn)在BC1基因發(fā)揮功能時(shí)起何種作用有待進(jìn)一步研究。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)盡管突變體中bc1-wu3基因編碼的氨基酸鏈長度沒有變化，但其莖稈機(jī)械強(qiáng)度卻變化最明顯，推測原因可能是由于突變體背景不同引起的。

脆稈突變體除了可作為研究植物控制莖稈機(jī)械強(qiáng)度機(jī)制的遺傳材料外，還可以直接用于谷稈兩用性特種稻的選育[29]。已有研究表明，脆性水稻與一般水稻相比更有利于微生物快速附著和降解，利于飼養(yǎng)動(dòng)物對(duì)食物的消化和吸收，對(duì)改善飼養(yǎng)動(dòng)物肌肉品質(zhì)有重要作用[30-31]。吳超等[32]已從水稻轉(zhuǎn)基因的材料中選出了2個(gè)適合作為谷稈兩用特種稻的育種材料，為谷稈兩用特種水稻選育工作提供了重要的親本。但是脆稈水稻在直接利用中會(huì)出現(xiàn)一些問題，如因葉片、葉鞘、莖稈等組織的機(jī)械強(qiáng)度的降低，使得人工拔秧時(shí)秧苗易折斷，因此會(huì)增加用種量；收割時(shí)籽粒容易脫離，產(chǎn)量容易損失等[27]。因此，選育適當(dāng)脆性材料是實(shí)現(xiàn)谷稈兩用型特種稻的選育成功的關(guān)鍵。本研究中定位的脆性基因bc1-wu3可為選育谷稈兩用型水稻提供分子理論基礎(chǔ)?？傊喽捦蛔凅w不論是在研究水稻莖稈的機(jī)械強(qiáng)度遺傳機(jī)制上還是水稻生產(chǎn)利用中均有較大的應(yīng)用空間。

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Identification and Gene Cloning of the Brittle Culm Mutant bc1-wu3 in Rice

XU Zuopeng, ZHONG Chongyuan, ZHANG Lijia, LIU Qiaoquan*
(Key Laboratory of Plant Functional Genomics, Ministry of Education / Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, College of Agriculture, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China；*Corresponding author, E-mail： qqliu@yzu.edu.cn)

【Objective】Culm strength, an important agronomic trait, is related to lodging resistance of rice. The research of brittle culm mutants and genes has great significance to demonstrate the regulation of genetic mechanism of culm mechanical strength and breed lodging resistance varieties.【Method】In this study, a brittle culm mutant, named bc1-wu3(brittle culm 1 from Wuyujing 3), was obtained from the japonica variety Wuyujing 3 after60Co-γ induced mutagenesis. F2population derived from bc1-wu3/Kasalath was used to mapping this corresponding gene by position cloning approach.【Result】The mutant was characterized by the brittle leaf, leaf sheath, and culm during the whole growing stage. Compared with the wild type, the panicle length and grain length of bc1-wu3 decreased significantly, and the grain width presented a significant increase. There was a significant decrease in the cellulose content in culm, the number of sclerenchyma cell layers and the thickness of sclerenchyma cell wall, but the contents of xylose, glucose and arabinose increased significantly in bc1-wu3. Genetic analysis showed that the brittle trait in bc1-wu3 was controlled by one single recessive nuclear gene, and the locus was mapped to a 57 kb genomic region on chromosome 3 between molecular markers M12 and Mk18. In the mapped region the cloned brittle culm gene BC1(LOC_Os03g30250) was included, which might be the candidate gene of bc1-wu3. Sequence analysis revealed that there was a single-base substitution(G-T) in the second exon of BC1 gene in bc1-wu3 mutant, leading to a residue substitution from cysteine to phenylalanine. The data from real-time RT-PCR indicated that there was significant decrease in the expression of BC1 gene in the culm of the mutant. 【Conclusion】Based on these results，we speculate that the bc1-wu3 gene is allelic to BC1 gene. These results would deepen our understanding for the function of BC1and help us to clarify the genetic mechanisms of culm strength.

Oryza sativa L.; brittle culm mutant; BC1 gene; genetic analysis; gene mapping

Q343.5; S511.01

A

1001-7216(2017)02-0157-09

2016-09-30；修改稿收到日期:2016-11-10。

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX08009-024B)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31561143008)；江蘇省高校“青藍(lán)工程”項(xiàng)目。