何正言，梅浩，鐘志年

（廣東省韶關(guān)市第一人民醫(yī)院，廣東韶關(guān) 512000）

葛根異黃酮聯(lián)合維生素D對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松的防治效果

何正言，梅浩，鐘志年

（廣東省韶關(guān)市第一人民醫(yī)院，廣東韶關(guān) 512000）

目的探討葛根異黃酮聯(lián)合維生素D對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松的防治效果及最佳劑量。方法選擇3月齡清潔級(jí)Wistar雄性大鼠60只，按治療方法的不同分為對(duì)照組、維生素D組、低劑量聯(lián)合組、中劑量聯(lián)合組和高劑量聯(lián)合組，各12只。去勢(shì)造模成功3個(gè)月后開(kāi)始灌胃給藥，其中對(duì)照組不用藥，維生素D組予維生素D 0.2 mg／kg，低劑量聯(lián)合組予葛根異黃酮25 mg／kg＋維生素D 0.2 mg／kg，中劑量聯(lián)合組予葛根異黃酮50 mg／kg＋維生素D 0.2 mg／kg，高劑量聯(lián)合組予葛根異黃酮100 mg／kg＋維生素D 0.2 mg／kg。各組大鼠均每周二和每周四灌藥1次，總給藥時(shí)間為6個(gè)月。實(shí)驗(yàn)期末斷頭處死大鼠，測(cè)量股骨長(zhǎng)度及質(zhì)量，并檢測(cè)骨鈣含量和股骨骨密度。結(jié)果股骨長(zhǎng)度，中、高劑量聯(lián)合組均顯著高于對(duì)照組、維生素D組及低劑量聯(lián)合組（P＜0.05），低劑量聯(lián)合組與對(duì)照組、維生素D組比較均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；骨質(zhì)量和骨鈣含量，低、中、高劑量聯(lián)合組均顯著高于對(duì)照組、維生素D組（P＜0.05），中、高劑量聯(lián)合組顯著高于低劑量聯(lián)合組（P＜0.05）；中、高劑量聯(lián)合組股骨長(zhǎng)度、骨質(zhì)量、骨鈣含量比較均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論中、低劑量葛根異黃酮聯(lián)合維生素D對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松的防治效果較理想。

骨質(zhì)疏松癥；葛根異黃酮；維生素D；去勢(shì)大鼠；防治效果

骨質(zhì)疏松癥為老年人高發(fā)的骨代謝性疾病，以骨量流失和骨組織結(jié)構(gòu)破壞為主要特征，隨著骨質(zhì)病理改變的逐漸加重，患者骨骼脆性增加，極易發(fā)生骨折且不易愈合，影響患者生活質(zhì)量[1]。當(dāng)前，骨質(zhì)疏松癥治療以服用鈣劑、維生素D及防骨量流失藥物為主，但療效欠佳[2]。中醫(yī)在補(bǔ)腎健骨方面的研究中，發(fā)現(xiàn)了較多健骨壯骨中藥材及經(jīng)典方劑，在骨質(zhì)疏松癥防治方面取得了較好的療效。葛根是中醫(yī)治療項(xiàng)背僵痛的一味良藥，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其提取物葛根異黃酮具有雌激素樣作用，可有效減少骨鈣流失[3－4]。為此，本研究中選擇60只3月齡清潔級(jí)Wistar雄性大鼠作為受試對(duì)象，對(duì)不同劑量葛根異黃酮聯(lián)合維生素D灌藥后的股骨長(zhǎng)度、骨質(zhì)量、骨鈣含量和骨密度進(jìn)行了對(duì)比分析?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物、儀器與試藥

1.1.1 動(dòng)物

選擇3月齡清潔級(jí)Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，合格證號(hào)為SCXK（粵）2006－0005。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物室，環(huán)境溫度為20～25℃，所有大鼠購(gòu)入后先適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，去勢(shì)手術(shù)前后均自由飲水、攝食。本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 儀器

MNT－150型游標(biāo)卡尺（德國(guó)美耐特公司）；JJ200型電子分析天平（美國(guó)雙杰電子有限公司）；原子吸收分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SD－1000 C型骨礦物儀。

1.1.3 試藥

葛根異黃酮（純度95.0%，杭州東岸醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)為20150618）；維生素D滴劑（青島雙鯨藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20113033，批號(hào)為20151012，規(guī)格為每粒含維生素D 400 U）。

1.2 處理方法

60只大鼠按治療方式的不同分為對(duì)照組，維生素D組，低、中、高劑量聯(lián)合組，各12只。常規(guī)腹腔麻醉后，無(wú)菌條件下完成去勢(shì)手術(shù)，術(shù)后5 d內(nèi)常規(guī)抗感染，自由飲水、攝食。待大鼠去勢(shì)造模成功，恢復(fù)飼養(yǎng)3個(gè)月后開(kāi)始灌胃給藥。其中，對(duì)照組不用藥，維生素D組予維生素D 0.2 mg／kg，低劑量聯(lián)合組予葛根異黃酮25 mg／kg＋維生素D 0.2 mg／kg，中劑量聯(lián)合組予葛根異黃酮50 mg／kg＋維生素D 0.2 mg／kg，高劑量聯(lián)合組予葛根異黃酮100 mg／kg＋維生素D 0.2 mg／kg。各組大鼠均于每周二和每周四灌藥1次，總給藥時(shí)間為6個(gè)月。除對(duì)照組外，維生素D組及低、中、高劑量聯(lián)合組均將葛根異黃酮＋生理鹽水稀釋至0.5%的溶液灌胃，維生素D直接灌胃，無(wú)需稀釋，試驗(yàn)期間各組大鼠均在相同飼養(yǎng)條件下喂養(yǎng)普通飼料。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

試驗(yàn)期末斷頭處死大鼠，取左側(cè)股骨，用游標(biāo)卡尺測(cè)量股骨長(zhǎng)度，用電子分析天平稱定質(zhì)量；用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定骨鈣含量。股骨骨密度（BMD）用SD－1000C骨礦物儀和Micro－CT測(cè)量，分別測(cè)定股骨中心和遠(yuǎn)心骨密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 股骨長(zhǎng)度

結(jié)果見(jiàn)表1。中、高劑量聯(lián)合組股骨長(zhǎng)度均顯著高于對(duì)照組、維生素D組及低劑量聯(lián)合組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量聯(lián)合組與對(duì)照組、維生素D組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 股骨骨質(zhì)量和骨鈣含量

結(jié)果見(jiàn)表1。低、中、高劑量聯(lián)合組股骨骨質(zhì)和骨鈣含量均顯著高于對(duì)照組、維生素D組，中、高劑量聯(lián)合組均顯著高于低劑量聯(lián)合組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。中、高劑量聯(lián)合組股骨長(zhǎng)度、骨質(zhì)量、骨鈣含量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠股骨長(zhǎng)度、骨質(zhì)量、骨鈣含量比較（±s，n＝12）

表1 各組大鼠股骨長(zhǎng)度、骨質(zhì)量、骨鈣含量比較（±s，n＝12）

注：與對(duì)照組或維生素D組比較， P＜0.05；與低劑量聯(lián)合組比較，＃P＜0.05。表2同。

組別對(duì)照組維生素D組低劑量聯(lián)合組中劑量聯(lián)合組高劑量聯(lián)合組股骨長(zhǎng)度（cm）3.29±0.24 3.33±0.19 3.32±0.21 4.18±0.26 4.20±0.19骨質(zhì)量（g）0.49±0.06 0.60±0.05 0.71±0.03 0.73±0.03＃0.73±0.04＃骨鈣含量（mg／g）140.25±12.14 178.69±10.36 231.04±12.17 250.36±11.26＃252.14±13.14＃

2.3 股骨中心和遠(yuǎn)心骨密度

結(jié)果見(jiàn)表2。低、中、高劑量聯(lián)合組股骨中心和遠(yuǎn)心骨密度均顯著高于對(duì)照組和維生素D組，中、高劑量聯(lián)合組均顯著高于低劑量聯(lián)合組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中、高劑量聯(lián)合組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠股骨中心和遠(yuǎn)心的骨密度比較（±s，g／cm2，n＝12）

表2 各組大鼠股骨中心和遠(yuǎn)心的骨密度比較（±s，g／cm2，n＝12）

組別對(duì)照組維生素D組低劑量聯(lián)合組中劑量聯(lián)合組高劑量聯(lián)合組中心骨密度0.18±0.02 0.21±0.01 0.24±0.03 0.28±0.02＃0.29±0.03＃遠(yuǎn)心骨密度0.19±0.02 0.21±0.03 0.26±0.02 0.31±0.03＃0.32±0.04＃

3 討論

葛根異黃酮是用于女性產(chǎn)后、更年期時(shí)補(bǔ)充雌激素的一類中藥提取物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其可調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞活性，并促進(jìn)其增殖，進(jìn)而維持骨量的穩(wěn)定[3－4]；還可激活骨細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2 （BMP－2）的活性，維持骨細(xì)胞鈣質(zhì)和蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，防治骨質(zhì)流失效果較好。目前，關(guān)于葛根異黃酮聯(lián)合維生素D治療骨質(zhì)疏松療效的研究相對(duì)不足，尤其是其對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松的防治效果尚有待探討[5－6]。

本研究結(jié)果顯示，中、高劑量聯(lián)合組股骨長(zhǎng)度均顯著高于對(duì)照組、維生素D組及低劑量聯(lián)合組（P＜0.05），而低劑量聯(lián)合組與對(duì)照組、維生素D組比較均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；而骨質(zhì)量和骨鈣含量方面，低、中、高劑量聯(lián)合組均顯著高于對(duì)照組和維生素D組（P＜0.05），且中、高劑量聯(lián)合組均顯著高于低劑量聯(lián)合組，但中、高劑量聯(lián)合組股骨長(zhǎng)度、骨質(zhì)量、骨鈣含量比較均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）?？梢?jiàn)，中、高劑量葛根異黃酮改善股骨長(zhǎng)度、骨質(zhì)量、骨鈣含量的效果均較好，且顯著優(yōu)于低劑量聯(lián)合組，更有利于改善骨質(zhì)疏松癥。動(dòng)物試驗(yàn)報(bào)道顯示，葛根異黃酮中、高劑量（25 mg／kg 或50 mg／kg）聯(lián)合維生素D 0.2 mg／kg對(duì)去勢(shì)大鼠股骨長(zhǎng)度、骨質(zhì)量、骨鈣含量的促增長(zhǎng)效果較明顯，與本研究中低劑量聯(lián)合組試驗(yàn)效果較為相似，提示葛根異黃酮中、高劑量（25 mg／kg或50 mg／kg）聯(lián)合維生素D較合理[7－8]。低、中、高劑量聯(lián)合組骨中心骨密度和遠(yuǎn)心骨密度均顯著高于對(duì)照組及維生素D組（P＜0.05）；且中、高劑量聯(lián)合組骨中心骨密度和遠(yuǎn)心骨密度均顯著高于低劑量聯(lián)合組（P＜0.05），但中、高劑量聯(lián)合組比較均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）?？梢?jiàn)，中劑量葛根異黃酮改善骨密度效果更理想。

相關(guān)研究顯示，葛根異黃酮可介導(dǎo)內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌性的單鏈多肽等雌激素引起的骨生成反應(yīng)，同時(shí)還可促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞合成和分泌胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF－1），而IGF－1可刺激骨細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞的分化和增殖，進(jìn)而促進(jìn)骨生成，修復(fù)骨質(zhì)疏松癥骨量流失，同時(shí)可促進(jìn)骨生長(zhǎng)，糾正骨代謝失衡，對(duì)于骨質(zhì)疏松的發(fā)生與發(fā)展有良好的抑制作用[9－10]。

目前，骨質(zhì)疏松癥治療藥物中以補(bǔ)充鈣質(zhì)、減少骨質(zhì)流失、促進(jìn)鈣沉積藥物為主，這類藥物僅能補(bǔ)充骨質(zhì)，促進(jìn)鈣沉積，但骨細(xì)胞形成的關(guān)鍵因素——Ⅰ型膠原仍然缺乏，骨質(zhì)較難以形成，骨骼脆性較強(qiáng)，仍易發(fā)生骨折，骨代謝平衡與骨量維持仍然較差[11－12]。

近年來(lái)，有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，葛根異黃酮可促進(jìn)Ⅰ型膠原的合成，還可促進(jìn)20余種膠原／非膠原蛋白質(zhì)、骨代謝局部調(diào)節(jié)因子等成骨細(xì)胞促生物質(zhì)生成，該作用機(jī)制與IGF－1生成、成骨細(xì)胞內(nèi)BMP－2表達(dá)增高等密切相關(guān)。目前已知葛根異黃酮可促進(jìn)Ⅰ型膠原的合成，增強(qiáng)堿性磷酸酶的活性，刺激骨細(xì)胞產(chǎn)生骨鈣素，抑制膠原蛋白酶的活性，從而促進(jìn)鈣沉積，并與Ⅰ型膠原結(jié)合，完成了成骨細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)化，更好地修補(bǔ)破骨細(xì)胞骨吸收形成陷窩，損傷修復(fù)作用較強(qiáng)，真正實(shí)現(xiàn)了骨代謝平衡與骨量維持[13－14]。

本研究中，去勢(shì)大鼠應(yīng)用葛根異黃酮聯(lián)合維生素D治療后，股骨中心骨密度和遠(yuǎn)心骨密度大幅提升，與葛根異黃酮可促進(jìn)Ⅰ型膠原合成、非膠原蛋白質(zhì)合成、骨代謝局部調(diào)節(jié)因子激活，增強(qiáng)堿性磷酸酶的活性、抑制膠原蛋白酶的活性等藥理作用機(jī)制密切相關(guān)，且中、低劑量即可較好地改善骨密度，生物利用度良好，臨床應(yīng)用前景可期。但不同劑量葛根異黃酮改善骨密度效果尚存在一定爭(zhēng)議，主要集中在中、高劑量方面，較多文獻(xiàn)研究認(rèn)為，高劑量改善骨密度效果較理想，但從本研究來(lái)看，中、高劑量葛根異黃酮聯(lián)合維生素D改善骨密度差異性較小，尚有待進(jìn)一步深入研究[15－16]。

綜上所述，中、低劑量葛根異黃酮聯(lián)合維生素D對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松的防治效果較理想，為老年男性骨質(zhì)疏松癥防治帶來(lái)了新的希望。

[1]賀印旎，朱新英，李東陽(yáng).葛根異黃酮聯(lián)合維生素D對(duì)去勢(shì)大鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響[J].南華大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2009，37（2）：153－155.

[2]周艷，扶曉明，賀棟梁，等.不同劑量葛根異黃酮聯(lián)合維生素D對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松的防治[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（23）：3944－3946.

[3]扶曉明，周艷，李梓民，等.葛根異黃酮聯(lián)合維生素D防治骨質(zhì)疏松的協(xié)同效應(yīng)（英文）[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（11）：2083－2086.

[4]鄭紅星，祁珊珊，曾海濤.葛根異黃酮聯(lián)合VitD3對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織構(gòu)造的影響[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2016，22（7）：832－836.

[5]虞慧娟.葛藤異黃酮分散片抗大鼠骨質(zhì)疏松作用及機(jī)理的研究[D].濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[6]孔蓓蓓，劉連起，王新祥.近十年葛根防治骨質(zhì)疏松癥的研究進(jìn)展[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2012，5（3）：226－230.

[7]陳冠儒.葛根總黃酮對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松的作用及部分機(jī)制的研究[D].合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2014.

[8]羅顯祿.葛根異黃酮對(duì)去卵巢大鼠的抗骨質(zhì)疏松作用及其機(jī)制[J].中國(guó)生化藥物雜志，2012，33（3）：262－264.

[9]王海珍.葛根素應(yīng)用研究進(jìn)展[J].山東中醫(yī)雜志，2013，32（7）：516－519.

[10]龔建文.從P38信號(hào)通路探討中藥骨康方對(duì)去勢(shì)大鼠MSCs成骨分化的機(jī)制研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

[11]趙丕文，牛建昭，David Yue－Wei Lee，等.中藥及其活性成分對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療及其作用機(jī)制[J].中國(guó)中藥雜志，2012，37（12）：1693－1699.

[12]李旭斌.二仙湯對(duì)去勢(shì)后大鼠骨質(zhì)疏松的影響的實(shí)驗(yàn)研究[D].錦州：遼寧醫(yī)學(xué)院，2014.

[13]李珊珊，劉逢芹，鄭世存.異黃酮調(diào)控機(jī)體骨代謝現(xiàn)代研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，17（11）：131－133.

[14]孔蓓蓓.葛根素對(duì)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的作用及作用機(jī)制的研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[15]馬曉耕.葛根對(duì)13～15月齡雌性大鼠子宮、卵巢的影響[D].哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2008.

[16]程斯倩，陳雪，于馨洋，等.葛根異黃酮藥理作用的研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，34（1）：46－49.

Effect of Puerarin Combined with Vitamin D on Osteoporosis in Ovariectomized Rats

He Zhengyan，Mei Hao，Zhong Zhinian

（The First People′s Hospital of Shaoguan，Shaoguan，Guangdong，China512000）

ObjectiveTo investigate the effect of puerarin combined with vitamin D on the prevention and treatment of osteoporosis in ovariectomized rats.M ethods60 male rats of clean grade Wister in March were divided into control group，vitamin D group，low dose group，middle dose group and high dose combination group，12 rats in each group.60 cases of ovariectomized rat model were successfully made.3 months after，the rats in control group were not given any drugs；the vitamin D group was given vitamin D 0.2 mg／kg；the low dose combination group was treated with puerarin isoflavone 25 mg／kg＋vitamin D 0.2 mg／kg；the middle dose combination group was givenpuerariaisoflavone 50mg／kg＋vitaminD 0.2mg／kg；thehigh dosecombinationgroup wasgiven puerariaisoflavone 100 mg／kg＋vitamin D 0.2 mg／kg.The rats in each group were given once every Tuesday and Thursday，the total administration time was 6 months.The rats were sacrificed at the end of the experiment.The femur length and mass were measured.The bone calcium content and bone mineral density were measured.ResultsThe femur length in the middle an high－dose combination group were both obviously longer than the control group and vitamin D group and the low dose group（P＜0.05），but there was no significant difference between the low dose group，the vitamin D group，and the control group（P＞0.05）.The bone mass and bone calcium content in the low，middle and high dose combination groups were obviously higher than the control group and the vitamin D group（P＜0.05）；and the middle and high dose combination group were significantly higher than the low dose group（P＜0.05）.There was no significant differenceinfemurlength，bonemassandbonecalciumcontentbetweenthemiddleandhighdosegroups（P＞0.05）.ConclusionThe effect of middle and low dose of isoflavones combined with vitamin D on osteoporosis in ovariectomized rats is more ideal.

osteoporosis；puerarin；vitamin D；ovariectomized rats；prevention and cure effect

R285.5；R282.71

A

1006－4931(2017)02－0024－03

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.02.007

2016－10－07；

2016－11－28)

何正言（1977－），男，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事骨科疾病的診療工作，（電子信箱）69070496＠qq.com。