麥月施，夏志軍(中國醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，沈陽110159)

?

伴宮頸增大的盆腔臟器脫垂患者宮頸周圍立體環(huán)結(jié)構(gòu)中膠原蛋白表達(dá)變化及機(jī)制

麥月施，夏志軍
(中國醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，沈陽110159)

目的 觀察伴宮頸增大的盆臟器脫垂患者宮頸周圍立體環(huán)結(jié)構(gòu)中膠原蛋白水平變化并探討其機(jī)制。方法 選擇因盆腔臟器脫垂行全子宮切除手術(shù)治療的患者40例為脫垂組，宮頸直徑>3 cm者20例，宮頸直徑≤3 cm者20例；同期因良性疾病行全子宮切除術(shù)且無盆腔臟器脫垂及尿失禁的患40例作為對照組，宮頸直徑>3 cm者20例，宮頸直徑≤3 cm者20例。選取術(shù)中切除的子宮旁靠近宮頸端的主、骶韌帶，采用免疫組化SP方法定性測量轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、纖溶酶原激活劑抑制劑1(TIMP-1)、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白。結(jié)果 對照組宮頸直徑>3 cm者較宮頸直徑≤3 cm者TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)增多(P均<0.05)。脫垂組宮頸直徑>3 cm者較宮頸直徑≤3 cm者TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)增多(P<0.05)。脫垂組宮頸直徑≤3 cm者較對照組宮頸直徑≤3 cm者TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)減少(P均<0.05)，對照組宮頸直徑>3 cm者較脫垂組宮頸直徑>3 cm者TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)增多(P均<0.05)。脫垂組宮頸直徑>3 cm者較對照組宮頸直徑≤3 cm者TGF-β1、TIMP-1表達(dá)減少(P均<0.05)，脫垂組宮頸直徑>3 cm者與對照組宮頸直徑≤3 cm者Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 伴宮頸增大的盆腔臟器脫垂患者宮頸周圍立體環(huán)結(jié)構(gòu)中膠原蛋白表達(dá)含量無明顯改變，其機(jī)制與膠原蛋白合成較少、降解增加，最終引起膠原纖維比例失調(diào)，導(dǎo)致子宮支持結(jié)構(gòu)薄弱、子宮位置改變。

盆腔臟器脫垂；宮頸周圍立體環(huán)；Ⅰ型膠原蛋白；Ⅲ型膠原蛋白；宮頸肥大

女性盆腔臟器脫疾病是臨床常見的一種婦科疾病，嚴(yán)重影響女性生活質(zhì)量，包括盆腔臟器脫垂、尿失禁、便秘、性功能障礙及慢性疼痛等。盆腔臟器脫垂是盆底肌肉和筋膜組織薄弱導(dǎo)致盆腔器官下降引發(fā)的的器官位置及功能異常[1]。盆腔臟器脫垂患者通常因外陰腫物，陰道流血或排尿困難就診[2]。臨床工作中發(fā)現(xiàn)盆腔臟器脫垂患者常伴有子宮頸增大體征。本研究通過觀察伴宮頸增大的盆臟器脫患者宮頸周圍立體環(huán)結(jié)構(gòu)中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)變化，探討其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月～2016年3月中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院確診盆腔臟器脫垂并行全子宮切除手術(shù)治療的患者40例(脫垂組)，宮頸直徑>3 cm者20例，年齡(54.7±8.31)歲，孕次(3.05±1.57)次，產(chǎn)次(1.6±0.76)次，BMI(24.52±3.01)kg/m2，宮頸直徑≤3 cm者20例，年齡(55.1±9.67)歲，孕次(3.25±1.94)次，產(chǎn)次(1.65±0.76)次，BMI(25.59±3.29)kg/m2。選擇同期因良性疾病(子宮肌瘤12例、子宮腺肌癥13例、宮頸上皮內(nèi)瘤變CIN Ⅲ15例，排除合并盆腔臟器脫垂及尿失禁疾病)行全子宮切除手術(shù)治療的患者40例為對照組，宮頸直徑>3 cm者20例，年齡(51.2±5.78)歲，孕次(3.05±1.9)次，產(chǎn)次(1.35±0.74)次，BMI(23.99±3.77)kg/m2；宮頸直徑≤3 cm者20例，年齡(54.1±4.47)歲，孕次(2.45±1.23)次，產(chǎn)次(1.25±0.64)次，BMI(23.71±3.66)kg/m2。兩組年齡、孕產(chǎn)次、BMI具有可比性。兩組均排除惡性疾病、膠原疾病高雌激素疾病的干擾，近3個(gè)月未經(jīng)過雌激素治療。

1.2 主、骶韌帶中 I、Ⅲ型膠原蛋白、TGF-β1、TIMP-1表達(dá)強(qiáng)度測定 對照組、脫垂組分別隨機(jī)選取術(shù)中切除的子宮旁靠近宮頸端的主、骶韌帶，約0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm，每例2塊，放入-80 ℃的液氮瓶中保存，后固定于4%的甲醛溶液中，石蠟包埋后切片。切片脫蠟，分別將標(biāo)本玻片置于二甲苯、無水乙醇、梯度乙醇中，20 min/次。PBS或蒸餾水中5 min?？乖迯?fù)，將標(biāo)本玻片置于修復(fù)液(檸檬酸0.2 g+檸檬酸鈉1.5 g+500 mL蒸餾水)中，高溫(95 ℃)8 min孵育5 min,再高溫1 min孵育10 min，冷卻至室溫，PBS沖洗5 min×3次。封閉內(nèi)源性過氧化物酶：將標(biāo)本玻片置于3%過氧化氫中20 min,再用PBS沖洗5 min×3次。封閉非特異抗原：標(biāo)本玻片置于5%～10%血清中20 min，后甩干后加稀釋好的一抗(Ⅰ型膠原蛋白 1∶600、Ⅲ型膠原蛋白 1∶400、TGF-β11∶200、TIMP-1 1∶150，稀釋液為PBS)過夜。染色：PBS沖洗5 min×3次，再加入二抗工作液放置于室溫中20 min，PBS沖洗5 min×3次，然后加連親和素過氧化物酶20 min，PBS沖洗5 min×3次。DAB工作液鏡下顯色，待出現(xiàn)陽性時(shí)流水終止，蘇木素復(fù)染2 min。流水返藍(lán)10 min。脫水封片：將玻片依次置于梯度乙醇，無水乙醇，二甲苯，5 min/次，最后中性樹膠封片。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)： 按照Birner等[3]報(bào)道的方法，免疫組化結(jié)果據(jù)染色細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)和染色深度采用半定量分析法進(jìn)行評分。根據(jù)陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)評分：<5%計(jì)0分；<10%計(jì)1分；10%50%計(jì)2分；50%100%計(jì)3分。根據(jù)染色強(qiáng)度評分：不著色計(jì)0分；淡黃色計(jì)1分；棕黃色計(jì)2分；棕褐色計(jì)3分。以上兩組評分相乘積作為表達(dá)強(qiáng)度。分為4級：陰性(-)為0～1分；弱陽性(+)為2～4分；中陽性(++)為5～8分；強(qiáng)陽性(+++)為9～12分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、TIMP-1均為分泌蛋白，分布于細(xì)胞質(zhì)中，除此之外，TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白還分布于細(xì)胞外基質(zhì)中。對照組中Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、TGF-β1、TIMP-1均可見顏色較背景顏色深，呈黃色至深黃色，分布較密集。脫垂組顏色較背景顏色淺，呈淡黃色或淺色，分布稀疏、散亂。對照組宮頸直徑≤3 cm者中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)強(qiáng)度-、+、++、+++者分別為0、4、14、2例，宮頸直徑>3 cm者分別為0、2、9、9例；脫垂組宮頸直徑≤3 cm者中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)強(qiáng)度-、+、++、+++者分別為2、10、8、0例，宮頸直徑>3 cm者分別為0、6、14、0例。對照組宮頸直徑≤3 cm者中Ⅲ型膠原蛋白 表達(dá)強(qiáng)度-、+、++、+++者分別為0、6、10、4例，宮頸直徑>3 cm者分別為0、2、8、10例；脫垂組宮頸直徑≤3 cm者中Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)強(qiáng)度-、+、++、+++者分別為2、15、3、0例，宮頸直徑>3 cm者分別為0、8、12、0例。對照組宮頸直徑≤3 cm者中TGF-β1表達(dá)強(qiáng)度-、+、++、+++者分別為0、4、13、3例，宮頸直徑>3 cm者分別為0、1、11、8例；脫垂組宮頸直徑≤3 cm者中TGF-β1表達(dá)強(qiáng)度-、+、++、+++者分別為3、15、2、0例，宮頸直徑>3 cm者分別為1、10、9、0例。對照組宮頸直徑≤3 cm者中TIMP-1表達(dá)強(qiáng)度-、+、++、+++者分別為0、4、10、6例，宮頸直徑>3 cm者分別為0、3、3、14例；脫垂組宮頸直徑≤3 cm者中TIMP-1表達(dá)強(qiáng)度-、+、++、+++者分別為3、15、2、0例，宮頸直徑>3 cm者分別為0、11、8、1例。對照組宮頸直徑>3 cm與≤3 cm者TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。脫垂組宮頸直徑>3 cm與≤3 cm者TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。脫垂組宮頸直徑≤3 cm者較對照組宮頸直徑≤3 cm者TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)減少(P均<0.05)，對照組宮頸直徑>3 cm者較脫垂組宮頸直徑>3 cm者TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)增多(P均<0.05)。脫垂組宮頸直徑>3 cm者較對照組宮頸直徑≤3cm者TGF-β1、TIMP-1表達(dá)減少(P均<0.05)，脫垂組宮頸直徑>3 cm者與對照組宮頸直徑≤3cm者Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

3 討論

膠原蛋白被認(rèn)為是一種生物力學(xué)強(qiáng)度的主要因素，人體中發(fā)現(xiàn)有28種膠原蛋白，其中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白擁有較好的拉力和彈力[3,4]。Ⅰ型膠原蛋白為最豐富的形式，占70%。Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白是結(jié)締組織的主要成分，Ⅲ型膠原蛋白在疏松結(jié)締組織中常見，構(gòu)成陰道壁的外膜和盆腔器官的周圍結(jié)構(gòu)。異常或合成的膠原蛋白及退化可能會(huì)致陰道壁脫垂[5]。膠原蛋白通過纖連蛋白與蛋白聚糖連接在一起，分子間有廣泛的交聯(lián)，分子間相互交織，構(gòu)成了多層次，多維的復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)。由此兼?zhèn)淇箟毫?、韌性及彈性為一體的功能。

TGF-β1是一類多功能的肽類生長因子，有促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長、增殖及ECM 合成的作用。TGF-β1是促進(jìn)膠原蛋白分化合成的重要因子[6]。TGF-β1主要促進(jìn)以間質(zhì)蛋白為主的膠原蛋白合成，增加膠原蛋白的表達(dá)及Ⅰ型膠原蛋白的穩(wěn)定性。

膠原蛋白的降解通過膠原酶的含量體現(xiàn)，通常膠原酶在組織中含量較低，但在結(jié)締組織降解情況下容易激活，形成活躍狀態(tài)。膠原酶被激活后，降解Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的能力增強(qiáng)，使得膠原蛋白的降解增多。TGF-β1可抑制MMP的分泌及刺激TIMP-1的活性從而抑制膠原蛋白的降解。TIMP-1通過抑制MMP的活性而抑制Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的降解。由此可知TGF-β1、TIMP-1均可通過抑制MMP的活性而抑制膠原酶的活性，從而抑制Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的降解。

宮頸周圍立體環(huán)即宮頸周圍3～4 cm內(nèi)的相關(guān)解剖結(jié)構(gòu)和組織的總稱，是一個(gè)球形的立體結(jié)構(gòu)。其主要包括三條韌帶，七個(gè)間隙，神經(jīng)，血管及陰道兩側(cè)的結(jié)締組織。三大韌帶即主韌帶、骶韌帶、陰道旁組織復(fù)合體[7]。其中主、骶韌帶復(fù)合體屬于陰道支持結(jié)構(gòu)的三個(gè)水平理論中的頂端支持結(jié)構(gòu)，屬于第一水平，由 Delancey[8]于1994年提出。主、骶韌帶是女性盆底主要的支持結(jié)構(gòu)，韌帶中的膠原蛋白是維持子宮在盆腔中位置的最主要的支持元素，維持中盆腔的結(jié)構(gòu)和功能，防止子宮脫垂或后穹窿脫垂(子宮切除術(shù)后)[9]。主、骶韌帶富含結(jié)締組織，以膠原蛋白為主，Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白是結(jié)締組織的主要成分。膠原蛋白被認(rèn)為是一種生物力學(xué)強(qiáng)度的主要因素，人體中發(fā)現(xiàn)有28種膠原蛋白，其中主要為Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白[10]。膠原蛋白粗大，排列緊密，聚集成粗細(xì)不等的束，呈波浪形，彼此交織吻合，具有一定的韌性和穩(wěn)固性，對維持子宮頸在盆腔中的正常解剖位置有重要作用。Ⅰ型膠原蛋白無彈性并提供巨大的耐拉力。Ⅲ型膠原蛋白有彈性，提供很強(qiáng)的靈活性。Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白按比例結(jié)合，提供穩(wěn)固的拉力和彈力系統(tǒng)，維持盆底的結(jié)構(gòu)和支持功能。

本研究結(jié)果顯示，對照組宮頸直徑>3 cm者較宮頸直徑≤3 cm者TGF-β1、TIMP-1、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)增加，宮頸外觀表現(xiàn)增大與膠原蛋白合成增加有關(guān)。TGF-β1、TIMP-1增加，促進(jìn)膠原蛋白的合成，同時(shí)抑制膠原酶對膠原蛋白的降解。脫垂組宮頸直徑≤3 cm者較對照組宮頸直徑≤3 cm者TGF-β1、TIMP-1 、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)下降。首先，TGF-β1表達(dá)下降，膠原蛋白合成降低。其次，TGF-β1對TIMP-1的刺激減弱，致使其活性減弱，對MMP的活性的抑制下降，所以MMP-9活性增加，使得MMP-9/TIMP比例失調(diào)，對膠原酶活性的抑制下降。膠原酶原激活，膠原酶活性升高，膠原蛋白降解增加。膠原蛋白減少影響第一水平結(jié)構(gòu)彈性、韌性及抗壓能力，易引起子宮脫垂。本研究結(jié)果顯示，脫垂組宮頸直徑>3 cm者與對照組宮頸直徑≤3 cm者Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但脫垂組宮頸直徑>3 cm者與對照組宮頸直徑≤3 cm者比較，TIMP1、TCF-β1含量降低，刺激膠原蛋白合成的能力下降。同時(shí)活化MMP的能力減弱，抑制膠原酶活性的能力減弱，膠原酶原被激活，活性增加，降解膠原蛋白能力增加。Ⅲ型膠原蛋白、Ⅰ型膠原蛋白合成逐漸減少，降解逐漸增多，但總體表達(dá)量與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明機(jī)體尚處于一種抗衡的狀態(tài)，膠原蛋白表達(dá)含量尚未下降。機(jī)體需經(jīng)歷一段長時(shí)間的抗衡過程，膠原蛋白表達(dá)比例失調(diào)，最終走向失衡引起膠原蛋白含量下降。膠原蛋白結(jié)構(gòu)及比例改變，易致第一水平支持力量逐漸削弱，對子宮的支持力量減弱，引起中盆腔缺陷。

綜上所述，伴宮頸增大的盆臟器脫垂患者宮頸周圍立體環(huán)結(jié)構(gòu)中膠原蛋白表達(dá)含量無明顯改變，其機(jī)制與膠原蛋白合成減少，降解增加，膠原比例失調(diào)引起盆腔支持結(jié)構(gòu)薄弱，從而引起子宮位置改變。

[1] 郎景和，朱蘭，宋巖峰.盆腔臟器脫垂的中國診治指南(草案)[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2014,49(9)：647-651.

[2] 王曉航,黃宇暉,丁錦麗.子宮脫垂的術(shù)式研究進(jìn)展[J]．醫(yī)學(xué)綜述，2013,19(21):3917-3919．

[3] 陳靜，丁雯倩,朱曉璐.宮頸機(jī)能不全的病因?qū)W研究[J].中國婦產(chǎn)科學(xué)雜志,2014,2(30)：85-88.

[4] Cooper RL,Segal RA,Diegelmann RF, et al. Modeling the effects of systemic mediators on the in ammatory phase of wound healing [J]. J Theor Biol, 2015,21(367)：86-99.

[5] Pomari E, Dalla Valle L. Intracranial sex steroid synthesis and signaling in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts [J]. The FASEB Journal, 2015,29(2):504-524.

[6] Yucel N, Usta A, Guzin K, et al. Immunohistochemical analysis of connective tissue in patients with pelvic organ prolapse[J]. J Mol Hist, 2013,44(1):97-102.

[7] 陳春林.宮頸周圍立體環(huán)的逆行解剖與經(jīng)陰道手術(shù)[J].中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科學(xué)雜志,2009,25(3):169-172.

[8] 周慧娟,李懷芳.原代謝與盆腔臟器脫垂相關(guān)性研究進(jìn)展[J].同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，32(5)：109-113.

[9] 馬雙玲，王魯文,馬學(xué)玲.TGF-β1/CTGF 信號傳導(dǎo)通路在女性壓力性尿失禁發(fā)生中的研究[J].中國婦幼保健，2014,29(11):1763-1766.

[10] Chen HY, LU Y, Qi Y, et al. Relationship between the expressions of mitofusin-2 and procollagen in uterosacral ligament fibroblasts of postmenopausal patients with pelvic organ prolapse[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2014,174(3):141-145.

科技部國家科技支撐計(jì)劃課題(2014BAI05B02)。

夏志軍(E-mail:xiazj@sj-hospital.org)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.034

R681.6

B

1002-266X(2017)25-0098-03

2016-10-20)