楊敬寧 張 素 羅羽莎 陳 俊

(湖北醫(yī)藥學(xué)院免疫學(xué)教研室，十堰442000)

DAPT調(diào)節(jié)Treg/Th17細(xì)胞免疫平衡抑制動脈粥樣硬化①

楊敬寧 張 素 羅羽莎 陳 ?、冖?/p>

(湖北醫(yī)藥學(xué)院免疫學(xué)教研室，十堰442000)

目的：觀察Notch信號抑制劑分泌酶抑制劑(γ-DAPT)對動脈粥樣硬化小鼠病理改變及Treg/Th17細(xì)胞免疫平衡的影響。方法：將24只ApoE 基因敲除C57BL小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和DAPT組。空白組用普通飼料飼養(yǎng)，模型組和DAPT組用高脂飼料飼養(yǎng)。飼養(yǎng)5 周后，DAPT組小鼠以100 mg/(kg·d)皮下注射 DAPT(溶于DMSO中)，其余兩組皮下注射等量DMSO。5 周后，采用病理染色分析各組小鼠動脈病理改變，ELISA檢測血漿中IL-17水平，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠脾臟Treg/Th17細(xì)胞比例。結(jié)果：HE染色結(jié)果顯示，模型組有明顯粥樣斑塊形成和泡沫細(xì)胞形成，DAPT組動脈病變程度比粥樣動脈硬化模型組明顯減輕。正常組、模型組和DAPT組各組血漿中IL-17水平分別為(293.94±28.59)、(454.05±172.68)和(335.40±89.57)pg/ml；DAPT降低AS小鼠血漿IL-17水平(P<0.05)。空白組、模型組和DAPT組各組小鼠Treg 細(xì)胞百分比分別為(3.80± 0.56)%、(2.54± 0.38)%和(4.73± 0.64)%；DAPT降低AS小鼠血漿IL-17水平(P<0.05)。空白組、模型組和DAPT組各組小鼠Th17細(xì)胞亞群分別為(3.46±0.23)%、(4.52±0.85)%和(1.38±0.37)%。結(jié)論：DAPT降低AS小鼠血漿IL-17的水平，抑制Th17細(xì)胞亞群分化，而促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，通過改變Treg/Th17細(xì)胞免疫平衡從而減輕動脈粥樣硬化。

動脈粥樣硬化；Notch 信號；DAPT；流式細(xì)胞術(shù)

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是心腦血管疾病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，是冠心病、腦梗死、外周血管病的主要原因。越來越多的證據(jù)表明AS是慢性炎癥性疾病，固有免疫和獲得性免疫炎癥機(jī)制參與了此疾病的發(fā)展和發(fā)生過程[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞失衡在AS致病過程中發(fā)揮了重要作用，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)和輔助性T細(xì)胞17(Th17)尤為重要。

Notch信號途徑?jīng)Q定細(xì)胞分化、增殖和凋亡，同樣，參與T細(xì)胞的分化調(diào)控。(3,5-二氟苯乙?；?-L-丙氨酰基-L-2-苯基甘氨酸叔丁酯(N-(N-[3,5-difluorophenacetyl]-L-alanyl)-S-phenylglycine t-butyl ester，DAPT)為Notch信號下游分子γ-分泌酶的抑制劑，可抑制Notch 信號通路。本研究探索Notch 通路抑制劑DAPT對AS 病變的影響及對AS 小鼠Treg/Th17平衡的影響，為AS 治療和預(yù)防提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 ApoE基因敲除C57BL 小鼠24 只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，SPF級，雌性，5～6周齡，體重15 g，飼養(yǎng)于湖北醫(yī)藥學(xué)院動物中心。

1.1.2 試劑 DAPT購自Selleck公司，離子霉素(Ionomycin,Ion)、佛波酯(Phorbol myristatr,PMA)，莫能霉素(Monesin)自Sigma公司，小鼠CD3、CD4、CD25、Foxp3、IL-17等抗體購自Biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 建立AS小鼠動物模型 ApoE基因敲除C57BL小鼠共24只，隨機(jī)分組?？瞻捉M使用普通飼料飼養(yǎng)，模型組和DAPT組使用高脂飼料(含2%膽固醇及10%豬油)飼養(yǎng)5周。從第6 周開始，空白組和模型組均接受隔天皮下注射DMSO 140 μl/只；DAPT組接受隔天皮下注射10 mmol/L DAPT 160 μl/只(DMSO 溶解)。注射時長為5周。

1.2.2 IL-17 的檢測 ApoE基因敲除C57BL小鼠于第10周采集眼球靜脈血，分離血漿于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?yīng)用酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測各組小鼠外周血上清中IL-17的濃度。外周血離心后收集的上清，采用預(yù)包被ELISA kit 檢測IL-17的表達(dá)水平，參照說明書進(jìn)行具體操作，最后經(jīng)酶標(biāo)儀在450 nm處讀取吸光度值，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算其濃度值。

1.2.3 病理染色分析動脈病理改變 小鼠于第10周麻醉后，顯微鏡下分離主動脈，將取出的材料放入多聚甲醛4%中固定2～4 h后移至30%蔗糖中4℃冰箱保存過夜。經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片。常規(guī)方法行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下拍照分析。

1.2.4 脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞FACS檢測 取脾臟研磨獲得細(xì)胞懸液，利用小鼠淋巴細(xì)胞分離液通過密度梯度離心法得到單個核細(xì)胞。取1×106單個核細(xì)胞用100 μl PBS重懸，加入CD4和CD25抗體，混勻后室溫避光孵育30 min，反應(yīng)后洗滌，再加入1 ml的固定、穿膜劑，混勻后室溫避光15 min，反應(yīng)后洗滌，加入100 μl穿膜劑重懸細(xì)胞，再加人20 μl Foxp3抗體，室溫避光孵育30 min，洗滌細(xì)胞后加入300 μl冷PBS重懸細(xì)胞，應(yīng)用FACS Calibur型流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 脾臟Th17細(xì)胞FACS檢測 取脾臟研磨獲得細(xì)胞懸液，利用小鼠淋巴細(xì)胞分離液通過密度梯度離心法得到單個核細(xì)胞。取1×106單個核細(xì)胞懸液，加入離子霉素(1 μg/ml)、和PMA(100 ng/m1)，混勻后37 ℃、5% CO2條件下孵育，1 h后加入莫能霉素(1 μl/ml)繼續(xù)培養(yǎng)，5 h后離心收集細(xì)胞，100 μl PBS重懸，分別加入20 μl 的CD3和CD4抗體，混勻后室溫避光孵育30 min，反應(yīng)后洗滌，再加入200 μl的固定、穿膜劑A，混勻后室溫避光15 min，反應(yīng)后洗滌，加入100 μl固定、穿膜劑B重懸細(xì)胞，再加人20 μl IL-17抗體，室溫避光孵育30 min，洗滌細(xì)胞后加入300 μl冷PBS重懸細(xì)胞，應(yīng)用FACS Calibur型流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 小鼠主動脈形態(tài)及病理改變 HE染色結(jié)果顯示，空白組(圖1A)動脈內(nèi)膜連續(xù)完整，模型組(圖1B)與空白組相比動脈內(nèi)膜不規(guī)則增厚，AS斑塊明顯向管腔內(nèi)突起，周圍纖維組織也逐漸增多，并在斑塊表面形成纖維帽，具有典型脂質(zhì)核心，脂質(zhì)核心區(qū)和纖維帽浸潤于散在的炎性細(xì)胞中，內(nèi)皮下間隙大量巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞聚集，泡沫細(xì)胞體積大，胞質(zhì)呈空泡狀，動脈中膜平滑肌細(xì)胞穿增生并攝取脂質(zhì)，內(nèi)膜隆起及變形，粥樣斑塊形成。DAPT組(圖1C)動脈病變程度比粥樣動脈硬化模型組明顯減輕，動脈內(nèi)膜沒有增厚，亦沒有大量泡沫細(xì)胞聚集，但血管內(nèi)皮明顯脫落。

2.2 DAPT對動脈粥樣硬化小鼠血漿IL-17的影響 為明確干預(yù)Notch信號通路是否影響Th17細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-17的水平，我們應(yīng)用ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中IL-17的水平。正常組、模型組和DAPT組各組血清中IL-17水平見圖2，分別為(293.94±28.59)、(454.05±172.68)和(335.40±89.57)pg/ml，模型組與正常組相比，血清IL-17水平明顯升高(P<0.05)，DAPT組與模型組相比，血清IL-17水平明顯降低(P<0.05)。由此可見IL-17參與了AS炎癥發(fā)生，DAPT抑制Notch信號通路降低AS小鼠血清IL-17的水平。

圖1 小鼠主動脈病理形態(tài)改變(H&E染色，×200)Fig.1 Pathological changes of aorta in mice(H&E,×200)Note: A.Blank group;B.Model group;C.DAPT group.

圖2 各組小鼠IL-17水平Fig.2 Plasma level of IL-17 in each group of miceNote: A.Blank group;B.Model group;C.DAPT group.

2.2 DAPT對動脈粥樣硬化小鼠脾臟Treg/Th17細(xì)胞平衡的影響 為明確Notch信號通路在動脈粥樣硬化小鼠Treg/Th17細(xì)胞失衡中的作用，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組中小鼠脾臟Treg/Th17細(xì)胞亞群的變化。結(jié)果如圖3所示：空白組、模型組和DAPT組小鼠Treg 細(xì)胞百分比分別為(3.80± 0.56)%、(2.54± 0.38)%和(4.73± 0.64)%。DAPT組與空白組和模型組相比，Treg細(xì)胞百分比明顯升高(P<0.05)，說明通過DAPT 抑制Notch 信號通路能夠調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化小鼠Treg亞群變化。

空白組、模型組和DAPT組各組小鼠Th17細(xì)胞亞群分別為(3.46±0.23)%、(4.52±0.85)%和(1.38±0.37)%，模型組與空白組相比，Th17細(xì)胞亞群明顯升高(P<0.05)，DAPT組與模型組相比，Th17細(xì)胞亞群明顯降低(P<0.05)，提示通過DAPT抑制Notch信號通路能夠降低動脈粥樣硬化小鼠Th17細(xì)胞比例。

3 討論

AS是一種常見慢性、漸進(jìn)性動脈疾病，盡管對于AS的原因及發(fā)生機(jī)制有多種學(xué)說闡述[3-8]，但并未能真正完全闡明。近來研究表明[1,4]，炎癥在AS的脂質(zhì)條紋的形成、病變到斑塊破裂整個過程都起著非常重要作用。在引起炎癥的細(xì)胞中，主要包括巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T細(xì)胞。其中，T細(xì)胞最為關(guān)鍵，調(diào)控炎癥的主要是Th17細(xì)胞亞群和Treg，前者具有促進(jìn)AS發(fā)展的作用，后者則能抑制其他免疫細(xì)胞的功能，發(fā)揮抑制免疫炎癥反應(yīng)作用[9,10]。

Notch 基因編碼一類高度保守的細(xì)胞表面受體，通過相鄰細(xì)胞之間的相互影響決定細(xì)胞分化、增殖和凋亡[11]。哺乳動物Notch 受體包括四種(Notch 1-4)，其配體分為兩個家族：Jagged 家族(Jagged1,Jagged2)和Delta樣家族[12]。當(dāng)配體與受體胞外區(qū)結(jié)合后，發(fā)生酶切，然后經(jīng)γ-分泌酶進(jìn)行組成性酶切，激活相關(guān)基因的表達(dá)。DAPT為γ-分泌酶抑制劑，能抑制Notch 信號傳遞。已發(fā)現(xiàn)ox-LDL 能顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞中Notch1受體的表達(dá)，提示Notch 信號通路與動脈粥樣硬化有關(guān)[13]。研究表明，ox-LDL 通過TLR2、TLR4 活化巨噬細(xì)胞，并促進(jìn) Notch 配體Jagged1 快速表達(dá)，活化巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生大量的促炎因子[14]。 研究表明Notch 信號參與調(diào)控Treg細(xì)胞分化和參與調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的增殖[15-19]，但也有研究報(bào)道阻斷Delta樣分子4介導(dǎo)的Notch 信號可促進(jìn)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生[20]。由此可見，不同的Notch配體結(jié)合不同的受體后轉(zhuǎn)導(dǎo)的Notch 信號產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)不同。另一方面，許多研究表明Notch1 激活與人類和小鼠Th17 細(xì)胞分化有關(guān)，Delta樣分子1與Notch 3結(jié)合的信號促進(jìn)Th17 、Th1細(xì)胞的分化[21，22]。近來研究表明，人樹突狀細(xì)胞高表達(dá)Delta樣分子4結(jié)合Notch 受體促進(jìn)Th17 、Th1細(xì)胞的分化[23]。

本研究利用ApoE基因敲除C57BL小鼠制備AS模型，結(jié)果顯示AS小鼠較正常小鼠Treg細(xì)胞比例減少(P<0.05)，而AS小鼠血漿IL-17的水平和Th17細(xì)胞比例較空白對照組升高(P<0.05)。用DAPT抑制Notch 信號途徑干預(yù)AS小鼠后，Treg細(xì)胞比例增加(P<0.05)，而Th17 細(xì)胞比例和血漿IL-17的水平均減少(P<0.05)。上述結(jié)果表明，Notch 信號促進(jìn)Th17 分化，抑制Notch 信號則抑制Th17 分化，這與以前研究報(bào)道結(jié)果一致[21-23]。同時，DAPT促進(jìn)了Treg細(xì)胞比例增加。 本研究HE染色結(jié)果顯示，應(yīng)用DAPT后，C57BL小鼠AS減輕，可能與DAPT降低Th17細(xì)胞比例和增加Treg細(xì)胞比例有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)AS小鼠IL-17的水平較空白對照組升高，而DAPT可以降低AS小鼠血清IL-17的水平，說明IL-17參與AS發(fā)病，這與以前研究結(jié)果一致[24，25]。IL-17參與AS的發(fā)生發(fā)展，是重要損傷因素之一，但同時有研究表明IL-17可有助于粥樣硬化斑塊穩(wěn)定[26]，有一定保護(hù)作用。由于IL-17是Th17細(xì)胞特征性細(xì)胞因子之一，Th17細(xì)胞是IL-17的主要來源，因此，DAPT降低AS小鼠血漿IL-17的水平可能是其降低Th17細(xì)胞比例導(dǎo)致的結(jié)果。但是IL-17有多個來源，除了Th17細(xì)胞外，還包括γδ T細(xì)胞、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞[26]，所以，DAPT降低AS小鼠血漿IL-17的水平可能還有其他通路，有待于進(jìn)一步研究。

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[收稿2016-10-11 修回2016-11-18]

(編輯 張曉舟)

DAPT regulates Treg/Th17 cells immune balance to inhibit atherosclerosis

YANGJing-Ning，ZHANGSu，LUOYu-Sha,CHENJun.

DepartmentofImmunology,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China

Objective:To observe the effect of Notch signal inhibitor DAPT (γ-secretase inhibitor)on the pathological changes of atherosclerosis mice and the immune balance of Treg/Th17.Methods: 24 ApoE knockout C57BL mice were randomly divided into blank group,model group and DAPT group.The blank group were fed with normal diet,the model group and the experimental group were fed with high fat diet.After 5 weeks of feeding,the mice in the experimental group were injected with DAPT[100 mg/(kg·d)，resuspended in DMSO],and the other two groups were injected with the equivalent amount of DMSO.After another 5 weeks,pathological changes of the mice in each group were analyzed by HE staining.ELISA was used to detect the level of IL-17 in plasma,and the proportion of splenic Treg/Th17 cells in each group was detected by flow cytometry.Results: HE staining results showed that the model group had obvious plaque formation and foam cell formation,which showed that the AS model was successfully prepared.The degree of arterial disease in the DAPT group was significantly less than that in the model group.The plasma levels of IL-17 in the blank group,model group and DAPT group were(293.94± 28.59),(454.05± 172.68) and (335.40± 89.57) pg/ml，respectively .The percentages of Treg cells in the blank group,model group and DAPT group were(3.80± 0.56)%,(2.54± 0.38)% and(4.73± 0.64)%,respectively.The Th17 cell subsets of mice in the blank group,model group and DAPT group were (3.46±0.23)%,(4.52±0.85)% and (1.38±0.37)%，respectively .Conclusion: DAPT decreased the plasma level of IL-17 in AS mice,inhibited the differentiation of Th17 cell subsets,and promoted the differentiation of Treg,and reduced the atherosclerosis by changing the Treg/Th17 cells immune balance.

Atherosclerosis;Notch signal;DAPT;Flow cytometry

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.005

①本文受湖北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2014CFB650)和湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃(B2015495)資助。

楊敬寧(1971年-)，男，碩士，教授，主要從事心血管免疫的研究，E-mail:yangjjnn@163.com。

R541.4

A

1000-484X(2017)03-0343-04

②湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院心血管內(nèi)科，十堰442008。

③通訊作者，E-mail：chenjun0121@126.com。