宋明銘 王佳奇 黃寶亮 高銘彤 李婧毓 丁傳波 鄭毅男 劉文叢 徐曉華
(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),長春130118)
精氨酸單糖苷(AF)對免疫抑制小鼠免疫功能的影響①
宋明銘 王佳奇 黃寶亮 高銘彤 李婧毓 丁傳波 鄭毅男 劉文叢 徐曉華
(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),長春130118)
目的:研究精氨酸單糖苷(Arginyl-fructose,AF)對環(huán)磷酰胺(CTX)誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠免疫功能的影響。方法: ICR小鼠100只,隨機分成5組,即正常對照組(N),免疫抑制模型組(M),免疫抑制AF低、中、高劑量組(M-L、M-M、M-H)。試驗組連續(xù)給藥28 d。免疫抑制組,每周前3天,腹腔注射80 mg/kg環(huán)磷酰胺,形成免疫抑制。末次給藥12 h解剖后,測定免疫器官指數(shù),AF對脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化及增殖、巨噬細胞吞噬功能、特異性IgG抗體、血清中TNF-α 、IL-2含量的影響。并通過實時熒光定量PCR檢測TNF-α 、IL-2 基因表達的差異。結(jié)果:AF能夠顯著提高小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù),促進脾淋巴細胞的自然轉(zhuǎn)化與增殖,增強巨噬細胞吞噬功能,顯著提高小鼠血清中特異性IgG抗體含量,可顯著提高小鼠血清中TNF-α、IL-2含量,實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,TNF-α、IL-2 mRNA能夠良好表達。結(jié)論:AF能拮抗CTX免疫功能低下小鼠的免疫抑制作用。
精氨酸單糖苷;ICR小鼠;免疫;熒光定量PCR
精氨酸單糖苷(Arginyl-fructose,AF),是鄭毅男等[1]首次從鮮參加工成紅參的過程中獲得,為美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物的非褐變部分,是精氨酸與葡萄糖羥醛脫水縮合的產(chǎn)物[2,3],分子量為337.3。AF純品為白色粉末,極易溶于水,不溶于甲醇等有機溶劑。實驗研究表明,AF具有抗氧化[4,5]、抗腫瘤[6]、促進微循環(huán)等功能[7],而且具有抑制葡萄糖苷酶、抗糖尿病等作用[8]。
李敏珍等[9]報道,紅參類藥物有增強機體免疫功能作用。Yool等[10]報道,紅參能夠平衡體內(nèi)免疫系統(tǒng),調(diào)節(jié)免疫機能,抵抗疾病侵襲。AF在紅參中含量豐富,所以通過此次試驗,探討AF是否在紅參的免疫活性中發(fā)揮作用。
1.1 儀器、材料、試劑 萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司);LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津公司);熒光定量PCR儀電泳儀(北京六一);MX3000 RT-PCR儀(美國 Stratagene);PCR儀(美國SBP公司);瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計;TGL-20B高速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);凝膠成像儀(美國BIORAD公司);MK3型酶標儀(美國Thermo Electron公司)。
IL-2和TNF-α試劑盒(美國R&D公司,長春百金生物科技公司分裝)。高純總RNA快速提取試劑盒、2×Power Taq PCR Master Mix、Bio Take super RT Kit、2×SYBP Real-time PCR premixture(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)。
精氨酸單糖苷AF,自制,純度大于95%,臨用時用純凈水配制成低、中、高劑量所需濃度;4周齡ICR小鼠,SPF級(18~22 g),購自吉林省億斯實驗動物中心。
1.2 方法
1.2.1 動物分組與劑量 100只ICR小鼠,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機分成5組,每組20只,即正常對照組(N),免疫抑制模型組(M),免疫抑制 AF低劑量組(M-L,20 mg/kg),免疫抑制AF中劑量組(M-M,40 mg/kg),免疫抑制 AF 高劑量組(M-H,80 mg/kg)。各組每日按10 ml/kg體重給小鼠灌胃給藥,每天給藥1次,連續(xù)給藥28 d。M、M-L、M-M及M-H組,每周前3 d,腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX,80 mg/kg),形成免疫抑制。
1.2.2 小鼠免疫器官臟器指數(shù)測定 末次給藥12 h后,眼球取血,離心機4 500 r/min分離血清,處理后的血清保存在-20℃冰箱,待用。將小鼠處死后進行系統(tǒng)的解剖,取出脾臟和胸腺,用9%生理鹽水進行漂洗,濾紙吸干后稱重,計算脾指數(shù)及胸腺指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器重量(g)× 100/體重(g)。
1.2.3 脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗 給藥第21天后,每組隨機抽取10只小鼠,脫臼處死,置75%酒精中浸泡5 min,無菌取脾臟,加入RPMI1640,300目鋼網(wǎng)研磨,吸取脾細胞懸液于1.5 ml離心管中,離心10 min(1 500 r/min,4℃),棄上清液。于上述離心管中加入ACK Lysis Buffer,再次離心10 min(1 500 r/min,4℃),棄上清液。再加入RPMI1640,細胞計數(shù),配成2×106ml-1脾細胞懸液。試驗分為3組,第1組為對照組即脾淋巴自然轉(zhuǎn)化組;第2組加入ConA(5 μg/ml,100 μl),刺激T細胞轉(zhuǎn)化;第3組加入LPS(10 μg/ml,100 μl),刺激B細胞轉(zhuǎn)化。將各組細胞依次加到 96 孔板中,每孔加入100 μl脾細胞懸液,每孔設(shè)立3個復(fù)孔。細胞培養(yǎng)條件為:5%CO2培養(yǎng)箱,37℃,48 h。培養(yǎng)48 h后,每孔內(nèi)加入MTT(5 mg/ml)20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,離心(2 000 r/min,10 min),吸取上清液,加入150 μl的DMSO充分溶解結(jié)晶,酶標儀490nm條件下,測定各孔OD值。
1.2.4 體外脾淋巴細胞增殖試驗 ICR小鼠,脫臼處死,取脾方法如1.2.3所述。試驗分為空白組、陰性對照組、陽性對照組及AF加藥組(濃度分別為:1、2、4、6、8、10 μg/ml)。每組設(shè)立3個復(fù)孔,空白組加入培養(yǎng)基100 μl,其他組別加入細胞懸液100 μl于96孔板中。培養(yǎng)1 h后,于空白及陰性對照組各加入培養(yǎng)基100 μl,陽性對照組加入ConA(50 μg/ml,10 μl),加藥組加入相應(yīng)濃度AF。培養(yǎng)條件與其余步驟,如1.2.3所述。
1.2.5 腹腔巨噬細胞吞噬功能的檢測 ICR小鼠,脫臼處死,置75 %酒精中浸泡5 min,無菌條件下剪開腹部,使腹膜壁暴露,用75 %乙醇沖洗腹壁。之后無菌抽取1 ml消毒空氣及4 ml冷PBS注入腹腔,最后抽取腹腔懸液,離心2次(1 500 r/min 4℃,10 min),每次離心后棄去上清液,用PBS洗滌。末次洗滌后,再加入RPMI1640,細胞計數(shù),配成2×106ml-1脾細胞懸液。吸取100 μl細胞懸液于96孔板的各孔,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37℃、2 h),貼壁細胞即為巨噬細胞,未貼壁用37℃PBS洗去。
試驗設(shè)置AF加藥組(濃度分別為:1、2、4、6、8、10 μg/ml)與空白對照組。每組設(shè)立3個復(fù)孔,空白對照組加入培養(yǎng)基200 μl,其他分別加入不同濃度的AF 200 μl于96孔板中。5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37℃、24 h),棄去上清液,用37℃ PBS 200 μl/孔洗3遍,加入0.075%中性紅溶液200 μl/孔,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min棄去上清液,用37℃ PBS 200 μl/孔洗3遍,每孔加200 μl細胞裂解液(1 mol/L醋酸∶無水乙醇=1∶1)培養(yǎng)1 h,540nm測其吸光度值。吞噬中性紅增加率(%)=(A給藥-A對照)/A對照×100%。
1.2.6 血清TNF-α、IL-2含量測定 取分裝好的小鼠血清,常溫解凍,嚴格按照ELISA說明書操作,點入96孔板,酶標儀測定后,進行數(shù)據(jù)處理分析。
1.2.7 特異性IgG抗體的檢測 取分裝好的小鼠血清,常溫解凍,ELISA法測定小鼠特異性IgG抗體水平。
1.2.8 熒光定量RT-PCR測定
1.2.8.1 組織中RNA提取 ①取出各組小鼠保存在液氮中的脾臟組織,在DEPC水處理后的研缽中充分研磨至粉末狀。②1 ml Trizol于1.5 ml離心管中,再加入少許脾臟粉末,振蕩器充分混勻后,靜置5 min;③加200 μl氯仿于上述離心管中,蓋緊,用手顛倒混勻后,室溫放置10 min,12 000 r/min離心15 min 4℃;④吸出上清液于新的1.5 ml離心管中,加500 μl異丙醇,混勻,室溫靜置10 min后,12 000 r/min 4℃離心10 min,保留沉淀。⑤加75%冷乙醇1 ml于上述沉淀離心管中,充分洗滌沉淀,7 500 r/min 4℃離心5 min,棄上清;⑥室溫干燥RNA至半透明狀;⑦向離心管中加20 μl DNase/RNase-Free Deionized Water溶解沉淀,-80℃凍存。RNA提取圖,見圖1。
1.2.8.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA TNF-α、IL-2的基因序列從數(shù)據(jù)庫NCBI獲得,參照查詢的基因序列使用Primer5.0軟件設(shè)計TNF-α 、IL-2定量引物,反轉(zhuǎn)錄引物使用試劑盒中的隨機引物,熒光定量引物序列見表1。
按照東洋紡試劑盒說明書步驟,進行反轉(zhuǎn)錄試驗,得到cDNA產(chǎn)物,于-80℃保存。反轉(zhuǎn)錄加樣體系見表2。
1.2.8.3 實時熒光定量反應(yīng) 以GAPDH為內(nèi)參引物,采用熒光染料SYBR-GreenⅠ檢測TNF-α 、 IL-2在小鼠脾臟組織中相對表達量,每個樣品3個重復(fù)。擴增反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性5 min;95℃反應(yīng)10 s,60℃反應(yīng)30 s,40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,記錄溶解曲線和擴增曲線,每孔樣本的Ct值,使用2-ΔΔCt方法計算。反應(yīng)體系見表3。
圖1 RNA提取圖Fig.1 Picture of RNA extraction
表1 熒光定量引物序列
Tab.1 Sequences of fluorescence quantitative primers
SymbolSequence(5'-3')m-qPCR-TNF-α-F2CTTCTCATTCCTGCTTGTGGCm-qPCR-TNF-α-R2CTTGGTGGTTTGCTACGACGm-IL-2-F1ACCGATTTCTGGCTAGTGAGGm-IL-2-R1GCAGTTGTTTCTGTGGGTTGTm-GAPDH-FCGGCAAATTCAACGGCACAm-GAPDH-RCACCAGTAGACTCCACGACAT
2.1 AF對小鼠免疫器官臟器指數(shù)的影響 與M組比較,N、M-L、M-M組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均存在顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),M-H組無明顯變化,見表4。
2.2 AF對脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響 從圖2可知,T淋巴細胞轉(zhuǎn)化刺激劑為ConA,與M組比較,M-L組具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),M-M組存在顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),M-H組與M組無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。B淋巴細胞轉(zhuǎn)化的刺激劑為LPS,與M組比較,M-L組具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),M-M組存在顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),M-H組與M組差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。
2.3 AF對體外脾淋巴細胞增殖的影響 不同濃度AF對小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響,如圖3所示。隨著AF濃度的增加,脾淋巴細胞的增殖活性逐漸增強。與陰性對照組比較,AF濃度為6、8、10 μg/ml時,呈現(xiàn)極顯著性(P<0.01)。
2.4 AF對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 如表5所示,AF能顯著促進小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅。與對照組比較,AF濃度為6、8、10 μg/ml時,呈現(xiàn)極顯著性(P<0.01)。AF濃度為4 μg/ml時,存在顯著性(P<0.05)。
2.5 AF對小鼠血清中細胞因子TNF-α、IL-2的影響 如圖4所示,與M組比較,N組血清中TNF-α含量顯著上升(P<0.01),呈極顯著性,M-L、M-M組血清中TNF-α含量升高(P<0.05),M-H組TNF-α含量與M組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與M組相比,M、M-L組血清中IL-2含量明顯升高(P<0.05),M-M組IL-2含量升高(P<0.05),M-H組IL-2 含量與M組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
2.6 AF對小鼠特異性IgG抗體的影響 結(jié)果顯示,M、M-L、M-M組小鼠獲得的免疫應(yīng)答良好,與M組小鼠比較,抗體水平極顯著性提高(P<0.01),M-H組無明顯變化,見圖5。
表2 反轉(zhuǎn)錄加樣體系
Tab.2 Reverse transcription reaction system
ReagentSampleadditionTotalRNA7.0μlPrimermix0.5μlRTenzymemix0.5μl5×RTbuffer2.0μlTotal10.0μl
表3 RT-PCR反應(yīng)體系
Tab.3 Real-time PCR reaction system
ReagentSampleadditionSYBRgreenmix12.5μlH2O9.5μlF0.5μlR0.5μlTotal25.0μl
GroupsDose(mg/kg)nThymusweight(mg)Thymusindex(mg/g,%)Spleenweight(g)Spleenindex(mg/g,%)Normalgroup-1555.42±0.012)0.18±0.012)0.18±0.062)0.65±0.052)Modelgroup801522.63±0.010.10±0.020.13±0.020.40±0.02M-Lgroup201552.95±0.012)0.16±0.022)0.16±0.171)0.52±0.092)M-Mgroup401541.72±0.022)0.14±0.022)0.15±0.030.64±0.062)M-Hgroup801531.15±0.020.11±0.020.13±0.040.44±0.10
Note:1)P<0.05,2)P<0.01,compared with model.
圖2 AF對小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響Fig.2 Effect of AF on transformation of mouse spleen cellsNote: *.P<0.05,**.P<0.01,compared with model.
圖4 AF對小鼠血清中細胞因子TNF-α 、IL-2的影響Fig.4 Effects of AF on serum TNF-α and IL-2 in miceNote: *.P<0.05,**.P<0.01,compared with model.
GroupsDosage(μg/ml)A540Increasingrate(%)Control-0.343±0.02-AF10.343±0.020.087AF20.343±0.030.117AF40.349±0.031)1.672AF60.405±0.052)18.17AF80.435±0.022)26.82AF100.472±0.032)37.52
Note:1)P<0.05,2)P<0.01,compared with normal.
圖3 AF對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響Fig.3 Effect of AF on proliferation of mouse spleen cellsNote: **.P<0.01,compared with normal.
圖5 AF對小鼠特異性IgG抗體的影響Fig.5 Effects of AF on serum IgG in miceNote: *.P<0.05,**.P<0.01,compared with model.
2.7 AF對小鼠脾臟組織中TNF-α、IL-2 mRNA表達的影響 熒光定量PCR結(jié)果顯示,TNF-α、IL-2熔解曲線為單一峰,擴增曲線均為典型S型,基線平整。M-L組TNF-α、IL-2 mRNA表達分別為(7.73±0.16)、(10.63±0.34),M-M組TNF-α、IL-2 mRNA表達分別為(2.6±0.03),(5.43±0.23),顯著高于M組[(1.83±0.72)、(2.45±0.02)](P<0.01、P<0.05),如圖6。
圖6 AF對小鼠脾臟組織中TNF-α 、IL-2 mRNA表達的影響Fig.6 Effects of AF on TNF-α,IL-2 mRNA expression in miceNote: *.P<0.05,**.P<0.01,compared with model.
本研究顯示,ICR小鼠給藥28 d后,顯著提高了免疫抑制小鼠脾臟及胸腺指數(shù);M-L組顯著促進脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化,體外脾淋巴細胞增殖,顯著促進小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能;M-L、M-M組小鼠特異性IgG抗體明顯高于M組;免疫抑制小鼠血清中,腫瘤壞死因子TNF-α及IL-2的含量顯著提高。且通過實時熒光定量PCR檢測,TNF-α及IL-2 mRNA水平明顯增高。
本試驗以體內(nèi)給藥研究方式結(jié)合實時熒光定量PCR等體外試驗進行研究,結(jié)果表明,AF可減輕CTX造成的免疫器官萎縮現(xiàn)象。從免疫應(yīng)答來看,本試驗中免疫抑制AF低劑量組、免疫抑制AF中劑量組小鼠特異性IgG抗體水平明顯高于免疫抑制模型組小鼠,Guy等[11]研究表明,特異性IgG抗體是血清主要的抗體成分,可清除有害補體片段,抑制炎癥反應(yīng)在機體免疫中起保護作用。本研究的IgG水平表明,AF能提高免疫抑制小鼠免疫應(yīng)答能力。劉佳[12]和趙定亮[13]報道,IL-2能促進T、B淋巴細胞的增殖與分化,可誘導(dǎo)殺傷細胞(LAK)的產(chǎn)生??梢栽鰪姍C體免疫監(jiān)視功能。譚兵[14]和李衛(wèi)[15]報道,TNF-α能夠抵抗微生物入侵和調(diào)節(jié)機體免疫的功能。此次試驗,用ELISA試劑法,檢測出AF免疫抑制組小鼠血清中IL-2、TNF-α含量顯著提高。同時,采用熒光定量PCR,檢測TNF-α及IL-2 mRNA水平。以上試驗結(jié)果表明,AF具有較強的免疫增強能力,能拮抗CTX免疫功能低下小鼠的免疫抑制作用。但本次試驗,只是免疫研究中的一部分,應(yīng)進一步探討研究,以充分證實試驗結(jié)果。
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[收稿2016-02-23 修回2016-04-25]
(編輯 許四平)
Protective effect of Aginyl-fructose immunosuppression in mice
SONGMing-Ming,WANGJia-Qi,HUANGBao-Liang,GAOMing-Tong,LIJing-Yu,DINGChuan-Bo,ZHENGYi-Nan,LIUWen-Cong,XUXiao-Hua.
JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China
Objective:To study the effect of AF on mice induced by cyclophosphamide.Methods: 100 ICR mice were divided into 5 groups randomly,the normal contral group(N),immunosuppressive model group(M),AF low-dose group(M-L,20 mg/kg),AF middle-dose group(M-M,40 mg/kg),AF high-dose group(M-H,80 mg/kg).Drugs were chronically administered to mice for 28 days,dosage of administration was 10 ml/kg of the mice′s weight.The groups of M,M-L,M-M,M-H received an injection of cyclophosphamide (CTX,80 mg/kg) three times a week to cause immunosuppressive.Organ idex,splenic lymphocyte transformation,phagocytic function,IgG,IL-2,TNF-α were conducted 12 hours after the last administration in mice of each group.Results: AF could improve the thymus index and spleen index in mice significantly,promoting the natural transformation and proliferation of splenic lymph-ocytes,adding phagocytic function,AF could improve the content of IgG,IL-2,TNF-α in serum significantly.The result of Real-time fluorescence quantitative PCR show that TNF-α mRNA,IL-2 could be well expressed.Conclusion: AF can inhibit hypoimmunologic mice induced by CTX.
Arginyl-fructosyl;ICR mice;Immune;Fluorogenic quantitative PCR
10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.006
①本文受吉林省自然科學(xué)基金(20160101017JC)、吉林大學(xué)生創(chuàng)業(yè)資金項目(20160521011HJ)和延邊州科技發(fā)展計劃項目(2015JH01)資助。
宋明銘(1991年-),女,碩士,主要從事為中藥新藥研究與開發(fā)方面的研究,E-mail:15144090081@163.com。
及指導(dǎo)教師:劉文叢(1968年-),男,博士,教授,主要從事中藥新藥研究與開發(fā)方面的研究,E-mail:jwlw6803@126.com。 徐曉華(1968年-),女,副主治醫(yī)師,主要從事糖尿病腎病方面的研究,E-mail:xuxiaohua681002@qq.com。
R151.3
A
1000-484X(2017)03-0347-05