夏金華 夏建川 謝麗燕 廖傳英

(廣州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院,廣州510450)

丹參酮ⅡA對樹突狀細胞表型的影響及對功能的調(diào)控

夏金華 夏建川①謝麗燕 廖傳英

(廣州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院,廣州510450)

目的：提取小鼠骨髓樹突狀細胞(DCs)，體外給予丹參酮ⅡA干預，觀察藥物刺激后DCs功能的改變，從而探討丹參酮ⅡA在免疫系統(tǒng)中的作用機制。 方法：提取小鼠的骨髓DCs，體外給予10 ng/ml GM-CSF及IL-4的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，并在第5天，磁珠分選得到純度90%以上的樹突狀細胞，體外給予一定濃度的丹參酮ⅡA及LPS刺激，收集細胞及上清，運用流式細胞技術(shù)檢測DCs表型，ELISA方法檢測細胞上清TNF-α、 IL-12含量變化，同種混合淋巴細胞反應(yīng)檢測樹突狀細胞刺激淋巴細胞增殖及分化的能力。 結(jié)果：在丹參酮ⅡA濃度為500 ng/ml時，藥物對DCs抑制作用達到最大，因此選取該濃度為實驗作用濃度；即在500 ng/ml作用下，實驗組與對照組相比，DCs表達MHCⅡ、CD86及CD80水平均顯著降低(P<0.05)；實驗組DCs分泌的TNF-α及IL-12含量均顯著降低(P<0.05)；實驗組DCs刺激淋巴細胞增殖反應(yīng)能力明顯降低(P<0.05)；實驗組DCs刺激T淋巴細胞分泌IL-4含量明顯高于對照組，IFN-γ含量明顯低于對照組(P<0.05)。 結(jié)論：丹參酮ⅡA可以通過降低LPS誘導的DCs成熟狀態(tài)，來參與免疫系統(tǒng)或自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。

樹突狀細胞；丹參酮ⅡA；脂多糖；成熟

作為從中國中草藥丹參中的提取物，丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA)在機體內(nèi)具有多種藥理作用，包括改善體內(nèi)微循環(huán)、清除體內(nèi)自由基、抗癌抗氧化、抗菌消炎等[1]。鑒于其廣泛的藥物作用，在臨床與科研方面已開展了多種研究，尤其針對其調(diào)節(jié)免疫功能方面得到了高度的重視。已有研究將其應(yīng)用于免疫疾病方面，取得了較大的進展。作為體內(nèi)最重要的抗原提呈細胞，樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)在免疫系統(tǒng)及自身免疫性疾病中起著重要作用，其不同的成熟狀態(tài)可顯著影響疾病的進展[2]。因此，本研究提取小鼠骨髓DCs，體外給予丹參酮ⅡA刺激，觀察丹參酮ⅡA對DCs成熟功能的影響，從而從細胞領(lǐng)域探討丹參酮ⅡA的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57小鼠，雌性，8～10周，購于廣州省醫(yī)學實驗動物中心[合格證編號：SYXK(粵)2013-0085]。

1.1.2 實驗試劑 丹參酮ⅡA購于蓋德化工網(wǎng)，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)購于Sigma公司，重組細胞因子GM-CSF及IL-4購于Peprotech公司，CD11C磁珠購于美天旎公司，CD11C、MHCⅡ、CD86及CD80流式抗體購于eBioscience公司，細胞因子IL-12、TNF-α、IL-4、IFN-γ檢測試劑盒購于Biolegend公司，MTS細胞增殖試劑盒購于Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 DCs的培養(yǎng) 頸椎脫位法處死小鼠，浸泡于75%酒精5 min，然后置于超凈臺操作。無菌操作下取出小鼠的股骨，用1 ml注射器抽取RPMI1640溶液沖洗股骨骨髓腔，收集沖洗液，離心，用RPMI1640溶液清洗，紅細胞裂解液常溫裂解3 min，再應(yīng)用含10%血清的RPMI1640溶液中和裂解液，離心，RPMI1640清洗細胞備用。無菌條件下制備DCs完全培養(yǎng)基，即應(yīng)用含10%血清的RPMI1640溶液并添加GM-CSF及IL-4細胞因子(使終濃度均為10 ng/ml)。將離心所得的細胞重懸于DCs完全培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)(即為第1天)。第3天全量換液，棄去懸浮細胞，添加新的培養(yǎng)基再次置于孵箱培養(yǎng)。每隔1 d半量換液，直至培養(yǎng)第5天后，收集懸浮細胞，經(jīng)CD11C磁珠分選，得到純度>90%的細胞，并應(yīng)用CD11C流式抗體標記，鑒定合格后，進行后續(xù)實驗。在第5天收集純化后的細胞應(yīng)用完全培養(yǎng)基重懸(使細胞密度為5×105)，取3 ml鋪于6孔板中，置于孵箱靜置培養(yǎng)24 h，然后將培養(yǎng)孔均分為2組。一組為實驗組，其在第6天先給予最佳濃度的丹參酮 Ⅱ A預處理24 h，然后在第7天給予LPS(1 μg/ml)再次刺激24 h；一組為對照組，在第6天向細胞培養(yǎng)孔中先加入等量(與丹參酮 Ⅱ A同等體積)的PBS溶液，然后在第7天給予LPS(1 μg/ml)再次刺激24 h。兩組均收集細胞及培養(yǎng)上清，進行相關(guān)檢測。

1.2.2 ELISA方法檢測藥物最佳濃度 取純化的細胞應(yīng)用完全培養(yǎng)基重懸，使細胞密度為5×105，取3 ml鋪于6孔板中，向孔板中加入不同濃度的丹參酮ⅡA，使其終濃度為100、300、500、700、900 ng/ml，將孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，再加入LPS(1 μg/ml)刺激24 h。于培養(yǎng)結(jié)束后取上清進行TNF-α細胞因子檢測，并選擇抑制TNF-α作用較強，而用量較小的濃度作為藥物最佳作用濃度。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞表型 收集實驗組及對照組細胞，清洗后重懸于PBS溶液中，向細胞懸液里加入MHC Ⅱ、CD86及CD80及同種型抗體，4℃孵育30 min。應(yīng)用流式細胞儀檢測，F(xiàn)lowjo軟件分析。

1.2.4 細胞因子檢測 取實驗組及對照組細胞培養(yǎng)上清，應(yīng)用ELISA方法檢測IL-12及TNF-α的含量，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.2.5 混合淋巴細胞反應(yīng) 取C57小鼠脾臟，碾磨后上過濾網(wǎng)，用PBS清洗后，應(yīng)用含10%血清的RPMI1640溶液重懸，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后，棄去貼壁細胞，取懸浮細胞即為T淋巴細胞備用。取刺激后的DCs應(yīng)用絲裂霉素C(25 μg/ml)刺激30 min，PBS清洗后，調(diào)整細胞濃度為1×106ml-1，取100 μl置于96孔板中。應(yīng)用含10%血清的RPMI1640溶液重懸淋巴細胞，調(diào)整細胞為1×106ml-1，取100 μl置于孔板中，使每孔終濃度為200 μl，并置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，實驗分成兩部分，一部分向96孔板每孔添加20 μl的MTS溶液，再置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，然后應(yīng)用酶標板讀取光密度值，以光密度值來代表淋巴細胞增殖能力；另一部分，取細胞上清檢測相關(guān)細胞因子IL-4、IFN-γ分泌情況。

2 結(jié)果

2.1 DCs純度鑒定 未經(jīng)磁珠分選的細胞，CD11C純度較低，經(jīng)磁珠分選后的細胞，CD11C純度可達90%以上，見圖1，符合實驗要求。

2.2 藥物最佳作用濃度 DCs由不同藥物濃度的丹參酮ⅡA刺激后，與未刺激組相比，當藥物濃度為100、300、500、700及900 ng/ml時，TNF-α分泌量均顯著降低(P<0.05)，但當藥物濃度為500、700及900 ng/ml時，實驗組細胞因子TNF-α分泌量變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，因此選取500 ng/ml為藥物作用最佳濃度，具體見圖2。

2.3 DCs表面分子表達 與對照組相比，實驗組DCs表達MHCⅡ、CD86及CD80水平均顯著降低(P<0.05)，結(jié)果見圖3及表1。

圖1 流式細胞術(shù)分析并純化DCsFig.1 Evaluation and purify of DCs by fluorescence-activated cell sorting system

圖2 不同藥物濃度DCs細胞因子分泌變化Fig.2 Cytokine secretion of DCs with different concentrations of tanshinone Ⅱ±s,n=5)Note: Vs the unstimulated group,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖3 DCs表面共刺激分子表達變化Fig.3 Phenotype expression of DCs in each group

GroupsCD80CD86MHCⅡExperimentalgroup15.4±5.91)45.2±5.91)35.1±6.81)Controlgroup40.9±5.662.6±5.151.7±6.5

Note：Vs the control group,1)P<0.05.

2.4 DCs細胞因子分泌 與對照組相比，實驗組DCs分泌的TNF-α及IL-12含量均顯著降低(P<0.05)，具體見表2。

2.5 DCs刺激淋巴細胞增殖反應(yīng) 與對照組相比，實驗組DCs刺激淋巴細胞增殖反應(yīng)能力明顯降低(P<0.05)，具體見表3。

GroupsIL-12TNF-αExperimentalgroup208.6±5.21)201.8±5.21)Controlgroup340.6±5.6360.8±4.9

Note：Vs the control group,1)P<0.05.

GroupsODExperimentalgroup1.6±0.41)Controlgroup3.2±0.3

Note：Vs the control group,1)P<0.05.

GroupsIL-4IFN-γExperimentalgroup343.4±4.71)145.9±6.11)Controlgroup205.8±4.3315.4±6.4

Note：Vs the control group,1)P<0.05.

2.6 DCs刺激T淋巴細胞分化 實驗組與對照組相比，DCs刺激T淋巴細胞分泌IL-4含量明顯高于對照組，IFN-γ含量明顯低于對照組，各組差異均存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)，具體見表4。

3 討論

DCs作為目前功能最強的專職抗原提呈細胞，具有獨特的誘導T細胞活化的能力，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的“橋梁”。DCs在體內(nèi)多以未成熟狀態(tài)存在，抗原提呈能力較強，但刺激T細胞的能力較弱，表現(xiàn)為多種表面因子及炎性細胞因子分泌較少[3]。當病菌等外來微生物刺激后，即可激活成活化狀態(tài)，可高表達多種表面分子，如CD86、CD80、MHCⅡ等，高分泌多種細胞因子，如TNF-α、IL-12，誘導幼稚的T細胞分化成熟，促進T細胞活化，從而激活免疫應(yīng)答[4]。隨著 DCs研究的深入，發(fā)現(xiàn)該細胞的抗原呈遞能力及成熟狀態(tài)，可直接干預機體的免疫調(diào)節(jié)，影響機體穩(wěn)態(tài)[5]。LPS作為最常見刺激DCs活化的物質(zhì)，可較大程度地上調(diào)DCs的多種共刺激分子，體外模擬炎性因子刺激狀態(tài)。研究已證實，成熟的DCs可以誘導并加重多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，如多發(fā)性硬化、類風濕性關(guān)節(jié)炎[6,7]。因此選擇藥物抑制DCs成熟狀態(tài)已經(jīng)成為改善多種免疫性疾病的突破口。

作為丹參藥物活性提取物之一，丹參酮ⅡA具有廣泛的生理作用，包括清除多種細菌，抑制炎癥；減少自由基和脂質(zhì)過氧化物的形成，并促進抗氧化物質(zhì)的合成；抑制多種膠原、透明質(zhì)酸的合成，從而抑制肝臟纖維化，保護肝功能；促進氧自由基的代謝，降低自由基水平，保護腦神經(jīng)元，對腦血管疾病也有一定的治療作用[8]。因其廣泛的藥理作用，丹參酮ⅡA在臨床的應(yīng)用也極為廣泛。丹參酮ⅡA可應(yīng)用于心肌炎、心臟手術(shù)、多種心律失常等心臟疾病，腦血管病及抗腫瘤的治療等。并且最新研究表明，丹參酮ⅡA可以減弱關(guān)節(jié)炎的免疫反應(yīng)，改善多發(fā)性硬化疾病動物模型-自身免疫性脫髓鞘疾病的癥狀[9,10]。然而有關(guān)丹參酮ⅡA對DCs功能的調(diào)節(jié)卻仍鮮有研究。

本研究可以看出，即便在LPS刺激下，一定濃度的丹參酮ⅡA(500 ng/ml)仍可以較大程度地抑制LPS導致的DCs的表面因子MHCⅡ、CD86及CD80的升高，丹參酮ⅡA刺激組的DCs分泌的TNF-α及IL-12含量也明顯降低。在刺激T淋巴細胞增殖和分化方面，丹參酮ⅡA可通過DCs抑制了LPS導致的細胞增殖。并且，經(jīng)過丹參酮ⅡA預處理的DCs可刺激T細胞分泌較多的TH2型細胞因子(IL-4)，較少量的Th1型細胞因子(IFN-γ)，提示丹參酮ⅡA可通過干預DCs誘導T淋巴細胞向Th2炎性細胞方向偏移，說明了該藥物可抑制LPS誘導的DCs的成熟狀態(tài)，從而調(diào)節(jié) Th1/Th2平衡來參與機體疾病的發(fā)生發(fā)展。已有動物實驗顯示，丹參酮ⅡA可減緩關(guān)節(jié)炎及多發(fā)性硬化的免疫反應(yīng)[9,10]，但具體機制未知。本研究初步闡明了丹參酮ⅡA可通過抑制DCs功能及成熟度，從而影響T細胞分化，使T細胞向Th2方向偏移，導致體內(nèi)抑炎性因子分泌增多，炎性因子分泌減少，從而起到減緩自身免疫性疾病的作用，表明丹參酮ⅡA可以通過調(diào)控DCs的功能來干預自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，丹參酮ⅡA可以降低LPS誘導的DCs表面共刺激分子表達及細胞因子分泌，降低T淋巴細胞增殖，通過調(diào)控DCs的成熟狀態(tài)來干預機體免疫系統(tǒng)，從而參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。

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[收稿2016-08-12 修回2016-11-08]

(編輯 倪 鵬)

A novel role for tanshinone ⅡA in modulation of dendritic cells maturation and function

XIAJin-Hua，XIAJian-Chuan，XIELi-Yan,LIAOChuan-Ying.

GuangzhouHealthScienceCollege,Guangzhou510450,China

Objective:Bone marrow-derived dendritic cells(DCs) were extracted and gave tanshinone ⅡA to intervene,and we observed the change of DCs function,which investigate the effects of tanshinone ⅡA in immune system. Methods: Extract bone marrow-derived DCs,and cells were cultured in complete medium with 10 ng/ml GM-CSF and IL-4.On day 5,magnetic cell sorting was used to purify DCs,and the purify must be up to 90%.Then,a certain concentration of tanshinone ⅡA or LPS was gave to the cell culture,and cells and supernatant were collected for following experiments.We used flow cytometry to detect phenotype ,and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) was used to detect cytokine production of TNF-α and IL-12.Also,allogeneic mixed lymphocyte reaction was used to detect the ability of DCs to induce T cell proliferation and polarization. Results: When the concentration of tanshinone ⅡA was 500 ng/ml,the inhibition of secretion of TNF-α was maximal.So we chose that concentration.Compared with the control group,DCs in experimental group had reduced expression of CD80,CD86 and MHCⅡ(P<0.05).Compared with the control group,DCs in experimental group displayed the reduced level of IL-12 and TNF-α(P<0.05).Compared with the control group,DCs in experimental group had reduced ability to induce T cell proliferation(P<0.05).Compared with the control group,DCs in experimental group induced T cell to secret increased level of IL-4,and reduced level of IFN-γ(P<0.05).Conclusion: Tanshinone ⅡA can inhibit the dendritic cells maturation induced by LPS,which takes part in immune system and autoimmune diseases.

Dendritic cells;Tanshinone ⅡA;LPS;Maturation

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.012

夏金華(1964年-)，男，碩士，副教授，主要從事腫瘤免疫治療、細胞因子與自身免疫病方面的研究。

R392.12

A

1000-484X(2017)03-0374-04

①中山大學附屬腫瘤醫(yī)院,廣州510060。