郭勇暉 朱 偉 王艷芳 丁細霞 陳政良 富 寧

(南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，廣州510515)

IgG型抗登革病毒NS1抗體介導(dǎo)被動系統(tǒng)性過敏反應(yīng)的研究①

郭勇暉 朱 偉②王艷芳②丁細霞②陳政良 富 寧②

(南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，廣州510515)

目的：明確登革病毒Ⅰ型(Dengue virus serotype 1,DENV1)非結(jié)構(gòu)蛋白1(Non-structure protein 1， NS1)與其IgG型抗體的免疫復(fù)合物(Immune complexes，ICs)能否誘導(dǎo)機體產(chǎn)生被動系統(tǒng)性過敏反應(yīng)(Passive systmic anaphylaxis，PSA)，為闡明登革出血熱與登革休克綜合征(DHF/DSS)的發(fā)病機制提供依據(jù)。方法：從本課題組現(xiàn)有的多株抗NS1單克隆抗體中，篩選能夠與純化NS1結(jié)合并形成免疫復(fù)合物進而誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生被動系統(tǒng)性過敏反應(yīng)(PSA)和被動皮膚過敏反應(yīng)(Passive cutaneous anaphylaxis，PCA)的單抗或單抗組合；并觀察體內(nèi)氯化釓(GdCl3)和血小板活化因子受體(PAFR)拮抗劑CV-3988處理對PSA的影響。結(jié)果：用親和層析純化的DENV1 NS1，從本室制備的20株IgG型抗DENV1 NS1單抗中僅篩選出2組單抗組合制備免疫復(fù)合物(NS1-IgG ICs)能成功誘導(dǎo)小鼠的PCA和PSA反應(yīng)，而其他抗體或抗體組合并無此反應(yīng)；用GdCl3抑制單核巨噬細胞或CV-3988阻斷PAFR處理可抑制或減輕小鼠PSA反應(yīng)。結(jié)論：DENV1 NS1結(jié)合兩個IgG型單抗組合的免疫復(fù)合物可誘發(fā)PSA與PCA，但并非所有的抗NS1單抗或抗體組合與NS1結(jié)合都能誘發(fā)PSA，推測與識別表位不同有關(guān)；初步證明DENV1 NS1-IgG ICs 誘發(fā)PSA的主要效應(yīng)細胞是巨噬細胞，主要效應(yīng)分子是PAF。

IgG；NS1；免疫復(fù)合物；被動系統(tǒng)性過敏反應(yīng)(PSA)；登革休克綜合征；被動皮膚過敏反應(yīng)(PCA)

已知受到登革病毒感染威脅的全球人群近39億，每年感染患者達5千萬～1億，重癥患者約50萬人[1-4]。我國南方近年感染率增高，僅廣東省2014年就達45 000例[5]。登革感染的主要臨床表現(xiàn)是自限性的登革熱(Dengue fever,DF)，其中的重癥感染如登革出血熱與登革休克綜合征(DHF/DSS)約占DF患者的5%～10%[6]，發(fā)生率雖低但死亡率高。但重癥登革的發(fā)病機制尚未完全闡明。目前對致命性的DSS已有大量研究并提出若干可能的原因，如抗體依賴增強效應(yīng)(ADE)[7]，細胞因子風(fēng)暴[8]，補體依賴的細胞毒[9]反應(yīng)等。近年，IgG而不是IgE抗體引發(fā)的過敏性休克研究備受關(guān)注，我們推測過敏性休克可能是導(dǎo)致DSS原因之一。因此，我們的關(guān)注點是非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)與其IgG型抗體結(jié)合形成的免疫復(fù)合物是否能夠引起休克。因重癥登革患者的血清動力學(xué)恰恰具備抗NS1的IgG抗體介導(dǎo)過敏休克反應(yīng)的條件，即血清中含有較高濃度的NS1蛋白及相應(yīng)的IgG抗體水平[10-12]。鑒于國際上僅有個別實驗室具有可感染登革的特殊成年小鼠，本文擬通過小鼠模型明確純化天然DENV1 NS1蛋白與其IgG型抗體的免疫復(fù)合物能否誘導(dǎo)機體產(chǎn)生PSA，并初步揭示PSA反應(yīng)的主要效應(yīng)細胞與效應(yīng)分子，為闡明DHF/DSS的發(fā)病機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8～10 周齡的SPF級雌性BALB/c小鼠，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 試劑 DENV1(Hawaii株)由本實驗室保存；Vero細胞由武漢病毒所惠贈；胎牛血清(FBS)、MEM培養(yǎng)基和慶大霉素購于美國Life technologies公司；一次性0.22 μm濾器、超濾膜夾購自美國Merck Millipore；CNBr-activated Sepharose 4B購自美國GE公司；預(yù)染蛋白相對分子量標(biāo)準(zhǔn)購自美國Thermo Fisher Scientific；ECL 底物購自美國BioRad；GdCl3、PAFR拮抗劑CV-3988購自美國Sigma-Aldrich；20株抗DENV NS1 IgG型單克隆抗體均由本實驗室制備[13,14]。其他所用試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 DENV1感染濃縮上清制備 Vero細胞用含10%FBS和50 μg/ml慶大霉素的MEM培養(yǎng)基置37℃培養(yǎng)至細胞密度約80%，PBS洗滌細胞3遍，然后用含DENV1病毒的無血清MEM培養(yǎng)基于34℃感染2 h，去上清并加入含2%FBS的MEM培養(yǎng)基，34℃培養(yǎng)4 d后收獲上清，12 000 r/min離心30 min后經(jīng)0.22 μm濾器過濾，取上清，通過超濾系統(tǒng)濃縮5～10倍(Labscale System，美國Merck Millipore)，即為DENV1感染濃縮上清。

1.2.2 親和層析純化DENV1 NS1蛋白 用DENV NS1高親和力單抗3B1交聯(lián)溴化氰活化的Sepharose 4B制備親和層析柱[15]， DENV1濃縮上清以1 ml/min 低速通過親和柱2次，充分洗滌后，堿洗脫并中和收集DENV1 NS1蛋白。蛋白純度及免疫反應(yīng)性用考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE及Western blot鑒定；純化蛋白濃度用BCA法定量。

1.2.3 以DENV1 NS1-IgG ICs構(gòu)建小鼠PSA模型 IgG型DENV1 NS1抗體以單株抗體(100 μg)或以兩株組合(50 μg+50 μg)抗體分別與DENV1 NS1純化蛋白(10 μg)混合(以生理鹽水配成200 μl總體積)，37℃孵育30 min形成免疫復(fù)合物(NS1-IgG ICs)，經(jīng)尾靜脈注射BALB/c小鼠，并用數(shù)字體溫儀(Mode BAT-12,美國 Physitemp)測定攻擊后0～90 min內(nèi)小鼠直腸溫度的變化，用于評估過敏性休克的嚴(yán)重程度。

1.2.4 用NS1-IgG ICs構(gòu)建小鼠PCA模型 以DENV NS1小鼠單抗或抗體組合20 μg與DENV1 NS1 5 μg混合，于37℃孵育30 min形成的免疫復(fù)合物直接注射小鼠足墊，5 min后經(jīng)尾靜脈注射200 μl含0.5% 伊文氏蘭的生理鹽水，5 min后觀察小鼠足掌藍染程度。

1.2.5 GdCl3對NS1-IgG ICs誘導(dǎo)小鼠PSA的影響 分別以每只小鼠尾靜脈注射1 mg(總體積200 μl)GdCl3，以等體積生理鹽水為對照，每個實驗組3只小鼠，重復(fù)2次)，24 h后按1.2.3步驟利用NS1-IgG ICs構(gòu)建小鼠PSA模型，并觀察GdCl3對NS1-IgG ICs誘導(dǎo)小鼠PSA的影響。

1.2.6 PAF受體(PAFR)拮抗劑對NS1-IgG ICs誘導(dǎo)小鼠PSA的影響 分別以200 μg CV-3988(含5%乙醇，總體積200 μl 生理鹽水)或等體積生理鹽水靜脈注射小鼠，30 min后觀察NS1-IgG ICs誘導(dǎo)小鼠PSA效果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0分析，結(jié)果中各組間小鼠直腸溫變化采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 純化DENV1 NS1蛋白的純度及免疫反應(yīng)性 對獲得的純化DENV1 NS1蛋白進行SDS-PAGE電泳及Western blot鑒定，上樣蛋白分別進行100℃加熱10 min或不加熱處理，SDS-PAGE結(jié)果顯示DENV1 NS1蛋白在未加熱處理時大小約100 kD，加熱變性后約48 kD，可見加熱變性處理后形成單體結(jié)構(gòu)，不加熱處理的蛋白為二聚體結(jié)構(gòu)，條帶位置與預(yù)期結(jié)果相符(圖1A)。 Western blot鑒定結(jié)果顯示，兩種處理后的蛋白條帶均可以與DENV1 NS1特異性單抗3B1反應(yīng)(圖1B)，證明所獲純化蛋白具有天然結(jié)構(gòu)。

2.2 NS1-IgG ICs誘導(dǎo)小鼠PSA 用20株單抗或抗體組合與NS1蛋白制備ICs進行小鼠體內(nèi)攻擊，結(jié)果顯示：只有5D25+3B1和5D25+3C65這兩個抗體組合分別與不同濃度DENV1 NS1蛋白形成各組免疫復(fù)合物，分別靜脈攻擊BALB/c小鼠能誘導(dǎo)PSA反應(yīng)，結(jié)果見圖2，可見其PSA反應(yīng)程度與DENV1 NS1蛋白濃度相關(guān)。5D25+3B1的效果略優(yōu)于5D25+3C65組合。值得注意的是這兩個抗體組合均可在體外形成雙抗體夾心ELISA，提示該特征有助于抗體Fc段在體內(nèi)與巨噬細胞表面FcγR結(jié)合形成交聯(lián)(cross-linking)。

圖1 純化DENV1 NS1蛋白的SDS-PAGE及Western blot 鑒定Fig.1 Identification of purified DENV1 NS1 protein by SDS-PAGE and Western blot

圖2 NS1-IgG ICs誘導(dǎo)小鼠PSA模型的建立Fig.2 Establishment of PSA model by challenge with NS1-IgG ICsNote: A.NS1-IgG ICs formed by DENV1 NS1 with mAb 5D25 and 3B1;B.NS1-IgG ICs formed by DENV1 NS1 with mAb 5D25 and 3C65.

圖3 NS1-IgG ICs誘導(dǎo)小鼠PCAFig.3 Establishment of PCA model by challenge with NS1-IgG ICs

2.3 NS1-IgG ICs可誘導(dǎo)小鼠PCA 以5D25+3B1和5D25+3C65抗體組合分別與DENV1 NS1蛋白形成免疫復(fù)合物，并皮下注射小鼠兩足墊，以生理鹽水為對照，5 min后給予小鼠靜脈注射200 μl含0.5% 伊文氏蘭-生理鹽水，可見注射NS1-IgG ICs后的小鼠足掌出現(xiàn)明顯的藍染即血漿滲透現(xiàn)象，而另一只注射生理鹽水的足掌則無此效應(yīng)(圖3)，證明NS1-IgG ICs可誘導(dǎo)小鼠PCA反應(yīng)。而其他單抗或單抗組合均無此反應(yīng)，提示NS1-IgG ICs誘導(dǎo)PSA與PCA是平行的。

2.4 GdCl3處理對NS1-IgG ICs誘導(dǎo)小鼠PSA的影響 應(yīng)用GdCl3預(yù)處理小鼠24 h后用NS1-IgG(5D25+3B1)ICs觸發(fā)小鼠PSA反應(yīng)，結(jié)果顯示GdCl3處理可以明顯抑制甚至完全消除小鼠的PSA反應(yīng)(圖4)。已知GdCl3可以抑制單核巨噬細胞[16]，由此提示單核巨噬細胞是NS1-IgG ICs誘導(dǎo)小鼠PSA反應(yīng)的主要效應(yīng)細胞。

圖4 GdCl3對NS1-IgG(5D25+3B1)ICs誘導(dǎo)小鼠PSA的影響Fig.4 Effects of GdCl3 on PSA induced by NS1-IgG(5D25+3B1)ICsNote: **.P<0.01,comparing with control group.

圖5 PAFR拮抗劑CV-3988對NS1-IgG(5D25+3B1)ICs誘導(dǎo)小鼠PSA的影響Fig.5 Effects of antagonists CV-3988 on PSA induced by NS1-IgG(5D25+3B1)ICsNote: **.P<0.01,comparing with control group.

2.5 PAF拮抗劑CV-3988對NS1-IgG ICs誘導(dǎo)小鼠PSA的影響 如圖5所示，用PAF拮抗劑CV-3988 處理可以顯著減輕NS1-IgG(5D25+3B1)ICs誘導(dǎo)小鼠PSA反應(yīng)，提示PAF是NS1-IgG ICs誘導(dǎo)小鼠PSA反應(yīng)的主要效應(yīng)分子。

3 討論

本研究擬通過IgG型抗NS1單克隆抗體或抗體組合與NS1抗原形成的免疫復(fù)合物從而誘發(fā)小鼠被動系統(tǒng)性過敏反應(yīng)(PSA)，揭示重癥登革休克綜合癥(DSS)可能的發(fā)生機制。實驗結(jié)果證實兩個IgG型單克隆抗體組合即5D25+3B1和5D25+3C65可以誘發(fā)PSA與被動皮膚過敏反應(yīng)(PCA)。進而以能引起小鼠肛溫顯著下降的NSl-IgG(5D25+3B1)免疫復(fù)合物(ICs)，建立NS1-IgG ICs觸發(fā)PSA模型，用GdCl3和PAF拮抗劑CV-3988初步證明此PSA反應(yīng)的效應(yīng)細胞是單核巨噬細胞，主要效應(yīng)分子是PAF。

以往人們多關(guān)注再次感染不同血清型登革病毒時的抗體依賴增強作用(Antibody-dependent enhance,ADE)，尤其是登革E蛋白抗體或抗病毒多克隆血清的ADE作用，認(rèn)為是ADE促進了病毒的大量復(fù)制而加重病情[7,17,18]。本研究結(jié)果顯示IgG型抗NS1抗體結(jié)合NS1可以導(dǎo)致被動過敏休克，恰恰臨床重癥登革熱的血清動力學(xué)表現(xiàn)具備了存在高水平NS1與抗NS1 IgG型抗體的條件[10-12]，提示NS1-IgG免疫復(fù)合物引發(fā)過敏性休克是重癥登革休克可能的發(fā)病機制之一。

我們采用的注射ICs誘導(dǎo)被動過敏休克反應(yīng)是基于本課題組用36組抗原-抗體反應(yīng)誘導(dǎo)PSA的前期工作[19],證明提前3 h注射單抗后注射抗原與直接注射ICs效果基本相同，PCA反應(yīng)也是如此。因此本次直接采用了體外制備NS1-IgG ICs。前期工作曾證實并非所有特異性相同的單克隆抗體或抗體組合都能誘發(fā)PSA，而是需要兩個不同抗體分子識別抗原分子上的不同表位，或兩個單一抗體識別抗原分子上的重復(fù)表位，這樣其Fc段才有可能與FcγR形成交聯(lián)進而引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)?；谇捌谘芯康慕?jīng)驗，我們從20株單抗或單抗組合中只篩選到兩個抗體組合5D25+3B1和5D25+3C65，成功地誘導(dǎo)出PSA與PCA，其他8株抗體及6個抗體組合均未能成功。5D25、3B1和3C65這三株單抗單獨使用時均不能誘導(dǎo)PSA與PCA。它們構(gòu)成兩個組合的另一特點是能夠在體外組成兩個雙抗體夾心ELISA，提示我們在尋找能夠誘導(dǎo)PSA抗體組合的時候可將能否形成雙抗體夾心ELISA作為初篩標(biāo)準(zhǔn)，我們前期36個抗原-抗體反應(yīng)體系中19個能在體外形成雙抗體夾心ELISA的抗體或抗體組合中有14個能夠誘導(dǎo)PSA[19]。與我們制備的多株單抗比較，登革DSS患者血清含針對NS1不同表位的多克隆抗體，只要有足夠的IgG抗體與NS1濃度就似乎具備了誘導(dǎo)PSA的基本條件。我們推測DSS發(fā)生率極低，除在NS1蛋白高峰期能否具備高水平IgG抗體這個必需條件外，也許與特定表位是否是誘導(dǎo)該抗體反應(yīng)的優(yōu)勢表位有關(guān)。本實驗室制備并保存了149株針對不同血清型特異性及交叉反應(yīng)的登革NS1的單克隆抗體[13,14,20]，有條件在后續(xù)工作中繼續(xù)去鑒定這些抗體與抗體組合并確定有關(guān)表位。

至于NS1-IgG ICs引發(fā)的PSA是否依賴補體，因暫時沒有補體缺陷動物而未能證實，但我們前期工作曾用補體第三成分(C3)敲除小鼠證實用卵黏蛋白(OVM)及其單抗誘導(dǎo)的PSA反應(yīng)與野生型無區(qū)別，即這種IgG介導(dǎo)的PSA是補體非依賴性的[21]。

為明確NS1-IgG ICs誘導(dǎo)PSA的效應(yīng)細胞與主要效應(yīng)分子，我們用抑制單核巨噬細胞的經(jīng)典方法GdCl3處理小鼠，證實巨噬細胞是NS1-IgG ICs誘導(dǎo)PSA的主要效應(yīng)細胞。我們前期工作曾用抗Mar-1、anti-Gr1抗體、GdCl3、毒性脂質(zhì)體(Clodronate liposome，氯磷酸鹽脂質(zhì)體)、環(huán)磷酰胺分別清除BALB/c與C57BL/6兩種小鼠嗜堿粒細胞、中性粒細胞及單核/巨噬細胞或阻斷其功能，發(fā)現(xiàn)清除嗜堿性粒細胞、中性粒細胞、單核細胞等各類血細胞對OVM-IgG 單抗誘導(dǎo)的PSA的發(fā)生與嚴(yán)重程度無明顯影響，只有GdCl3和毒性脂質(zhì)體分別清除巨噬細胞才顯著抑制PSA反應(yīng)。為確認(rèn)該現(xiàn)象是否具有普遍性，我們又用5種不同的抗原-IgG抗體復(fù)合物誘導(dǎo)經(jīng)毒性脂質(zhì)體處理的小鼠并獲得同樣結(jié)果。證明巨噬細胞是IgG誘導(dǎo)被動過敏途徑的主要效應(yīng)細胞。本研究只用GdCl3處理BALB/c小鼠，其抑制效果極為顯著，幾乎是完全抑制，這與我們的前期工作相符。

此外，已知登革病毒可在體外刺激單核細胞產(chǎn)生PAF[22]，而PAF受體敲除小鼠或給予PAR受體阻斷劑能減輕小鼠感染表現(xiàn)以及降低死亡率[23]。也有報道PAF 在人類 IgG 抗體所介導(dǎo)的過敏反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[24]，本研究以 PAF受體拮抗劑 CV-3988 阻斷體內(nèi)PAF的功能，顯著減輕了NS1-IgG ICs所誘發(fā)的PSA反應(yīng)，結(jié)果說明PAF是NS1-IgG ICs誘發(fā)PSA反應(yīng)的主要效應(yīng)分子，阻斷PAF也可能是治療重癥登革的策略與藥物研發(fā)思路之一。

當(dāng)然，重癥登革(DHF/DSS)的發(fā)生機制是復(fù)雜、多因素的，基于我們的149株抗NS1單抗，我們還發(fā)現(xiàn)了少數(shù)單抗可以結(jié)合人和家兔血小板(未發(fā)表)。本研究僅是初步提供了認(rèn)識DSS形成機制的一種可能性，因受限于國內(nèi)無登革感染成年小鼠模型，尚未能進行體內(nèi)感染實驗以模仿體內(nèi)NS1及NS1抗體動力學(xué)與形成PSA的關(guān)系。

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[收稿2016-12-30]

(編輯 倪 鵬)

IgG antibodies against Dengue virus non-structure protein 1 mediate passive systemic anaphylaxis in mice

GUOYong-Hui,ZHUWei,WANGYan-Fang,DINGXi-Xia,CHENZheng-Liang,FUNing.

DepartmentofImmunology,SchoolofBasicMedicalSciences,SouthernMedicalUniversity，Guangzhou510515,China

Objective:To ascertain whether the immune complexes(ICs) formed by Dengue virus 1 non-structure protein 1(DENV1 NS1)and its IgG antibodies could mediate passive systemic anaphylaxis(PSA) and to explain the pathogenesis of Dengue hemorrhagic fever or Dengue shock syndrome(DHF/DSS).Methods: The monoclonal antibodies(mAbs) or mAb cocktails from 20 IgG mAbs of DENV1 NS1 prepared in this lab were screened to initiate PSA and passive cutaneous anaphylaxis(PCA) in mice.Meanwhile,the effects of GdCl3and platelet activating factor(PAF) antagonist CV-3988 on PSA induced by the NS1-IgG ICs were observed.Results: Two groups of monoclonal antibody cocktails with purified NS1 were proved to be capable of provoking PCA and PSA in mice,whereas the other mAbs or mAb cocktails could be not.The murine PSA initiated by NS1-IgG(5D25+3B1) ICs could be significantly inhibited by in vivo treatment with GdCl3or PAF antagonist CV-3988.Conclusion: The NS1-IgG ICs formed with DENV1 NS1 and IgG mAb cocktails can mediate PSA and PCA,but not all of ICs formed by DENV1 NS1 mAbs or mAb cocktails with DENV1 NS1 can induce PSA,indicating that it may be related to the special epitopes of DENV1 NS1.The monocyte/macrophages and PAF may be as major effector cells and the major mediator for PSA induced by NS1-IgG ICs,respectively.

IgG；NS1；Immune complexes；Passive systemic anaphylaxis(PSA)；Dengue shock syndrome；Passive cutaneous anaphylaxis(PCA)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.004

①本文為國家自然科學(xué)基金委員會-廣東省人民政府聯(lián)合基金資助項目(U1132002)。

郭勇暉(1984年-)，男，碩士，主管技師，主要從事急性傳染病病原微生物診斷及感染機制方面研究，同時就職于南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)部，E-mail:kink1984@163.com。

及指導(dǎo)教師：陳政良(1957年-)，男，博士，教授，主要從事天然免疫及免疫性疾病方面的研究，E-mail：zhlchen@fimmu.com。

R373.3+3

A

1000-484X(2017)03-0338-05

②南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)部，廣州 510515。