葉宇涵 劉忠臣 齊忠權(quán) 莊國(guó)洪 殷 平

(福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，福州350004)

·生物治療·

TIPE3干擾質(zhì)粒對(duì)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用及相關(guān)機(jī)制探討①

葉宇涵 劉忠臣②③齊忠權(quán)④莊國(guó)洪④殷 平⑤

(福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，福州350004)

目的：通過(guò)TIPE3干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480結(jié)腸癌細(xì)胞，驗(yàn)證干擾TIPE3表達(dá)對(duì)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響并探討相關(guān)機(jī)制。方法：構(gòu)建TIPE3-shRNA-pSIREN-RetroQ干擾質(zhì)粒，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法成功將干擾質(zhì)粒導(dǎo)入SW480細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR、Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒的干擾效率。應(yīng)用CCK-8方法檢測(cè)SW480細(xì)胞生存率。AnnexinV-FITC/PI流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。使用Western blot檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)分子的表達(dá)情況。結(jié)果：成功設(shè)計(jì)、構(gòu)建和篩選具有生物活性且干擾效率最佳的TIPE3-shRNA-pSIREN-RetroQ干擾質(zhì)粒。CCK-8檢測(cè)證實(shí)干擾SW480結(jié)腸癌細(xì)胞TIPE3表達(dá)可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。流式結(jié)果顯示，TIPE3-shRNA3干擾組的凋亡率為(27.99±1.087)%，顯著高于正常細(xì)胞組(12.10±2.213)%及轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組(11.44±0.277 0)%。證實(shí)了降低TIPE3表達(dá)可以增加SW480對(duì)aDR5ScFv所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感性。Western blot結(jié)果顯示干擾TIPE3表達(dá)可以活化caspase3蛋白，降低p-AKT、p-PDK1、PCNA等分子的表達(dá)。結(jié)論：干擾TIPE3的表達(dá)對(duì)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞具有促進(jìn)凋亡，抑制增殖的作用。

TIPE3shRNA；結(jié)腸癌；凋亡；增殖

腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白8(Tumor necrosis factor-α induced protein 8，TNFAIP8或稱(chēng)TIPE)家族是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一組蛋白質(zhì)，具有維持免疫平衡、調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)的作用[1]。哺乳動(dòng)物TNFAIP8家族包括四個(gè)成員，即TIPE、TIPE1、TIPE2與TIPE3[2]，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上具有高度同源性，均包含7個(gè)高度保守的α螺旋(α0～α6)以及由α螺旋組成的疏水性空腔[3]。TIPE3(又稱(chēng)TNFAIP8L3)作為磷脂酰肌醇通路中的第二信使轉(zhuǎn)移蛋白促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[4]。TIPE3在N端具有獨(dú)特的19 個(gè)氨基酸序列，稱(chēng)為N 端結(jié)構(gòu)域(NT)，TIPE 家族的其他成員沒(méi)有該結(jié)構(gòu)域，刪除這段序列 TIPE3 將從促增殖蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換為促死亡蛋白[5]。

TIPE3在食管癌、卵巢癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)[5,6]，降低TIPE3表達(dá)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的研究有助于進(jìn)一步揭示TIPE3在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制。因此我們構(gòu)建TIPE3-shRNA-pSIREN-RetroQ干擾質(zhì)粒，降低TIPE3在結(jié)腸癌中的表達(dá)來(lái)研究TIPE3對(duì)其生長(zhǎng)的影響，進(jìn)而了解TIPE3在腫瘤增殖、凋亡中的作用，為結(jié)腸癌治療的分子治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 T4 DNA Ligase、BamHⅠ限制性?xún)?nèi)切酶、EcoR Ⅰ限制性?xún)?nèi)切酶、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、DL5000 DNA marker購(gòu)自寶生生物工程(大連)有限公司；PCR 產(chǎn)物膠回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司； ExFectTMTransfection Reagent購(gòu)自 Vazyme公司；CCK購(gòu)于北京全式金有限公司；流式凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于BD公司；PCR 引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；質(zhì)粒測(cè)序由上海英駿公司完成；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)廈門(mén)英偉生物技術(shù)有限公司； TIPE3抗體購(gòu)自藥明康德新藥開(kāi)發(fā)有限公司；caspase3、caspase3-cleaved、AKT、pAKT、PDK、pPDK抗體購(gòu)于abcam公司。

1.1.2 載體和菌種 shRNA 載體pSIREN-RetroQ 由廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院金光輝老師饋贈(zèng)，DH5α菌株購(gòu)于北京全式金公司，引物及干擾片段由廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院高淑彬老師設(shè)計(jì)，上海 Sangon 合成，人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞SW480、人腎胚細(xì)胞HKE293細(xì)胞株由廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院抗癌研究中心保存。

1.2 方法

1.2.1 TNFAIP8干擾質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1.1 RNA 干擾片段的設(shè)計(jì)與合成 取pSIREN-RetroQ為shRNA 載體。轉(zhuǎn)化提取質(zhì)粒pSIREN-RetroQ后,用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ對(duì)質(zhì)粒 pSIREN-RetroQ進(jìn)行雙酶切，雙酶切后采用TIANGEN Universal DNA 純化回收試劑盒純化回收DNA溶液。

登陸 GeneBank 查找并獲取人源性 TIPE3基因序列，從TIPE3的ORF 中選擇評(píng)分最高的靶序列位點(diǎn)三處，分別命名為T(mén)IPE3 shRNA1；TIPE3 shRNA2；TIPE3 shRNA3(GCGAGATCTTTGATGAGCT；ACAAGACTCATCCCCTTAT；GAGCAAAATAGCCAGCAAA)。利用SiRNA Construct Builder 軟件，構(gòu)建TIPE3 干擾片段序列(含黏性末端)。將該序列送至上海Sangon 合成DNA單鏈,退火形成互補(bǔ)片段。酶切后的膠回收的質(zhì)粒和退火片段用T4連接酶連接。

1.2.1.2 TIPE3-shRNA-pSIREN-RetroQ重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、鑒定及測(cè)序 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)中。經(jīng)培養(yǎng)后挑取飽滿(mǎn)單克隆菌落進(jìn)行培育。并進(jìn)行初篩、復(fù)篩以排除假陽(yáng)性克隆的出現(xiàn)。重組質(zhì)粒的初篩鑒定引物具體序列如下(設(shè)計(jì)的引物送上海Songon合成)：Forward primer=GGGCAGGAAGAGGGCCTAT;TIPE3-shRNA1 reverse primer=ACGCGTAAA-AAAGCGAGA;TIPE3-shRNA2 reverse primer=ACG-CGTAAAAAAACAAGA;TIPE3-shRNA3 reverse primer=ACGCGTAAAAAAGAGCAA;復(fù)篩采用質(zhì)粒手冊(cè)中的通用引物MSCV_primer和MSCV_rev_primer。

行菌液 PCR 鑒定陽(yáng)性克隆，所得產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，在Bio-Rad凝膠成像儀上鑒定。將陽(yáng)性菌落送上海英俊公司測(cè)序。

1.2.2 重組干擾質(zhì)粒的干擾效率檢測(cè)及最佳干擾效率質(zhì)粒的篩選

1.2.2.1 檢測(cè)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞SW480 細(xì)胞株TIPE3表達(dá)情況 復(fù)蘇HT-29、SW480細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%后收集細(xì)胞，制備RNA樣品,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,行PCR檢測(cè)TIPE3在兩株結(jié)腸癌細(xì)胞中的基因水平表達(dá)情況。β-actin上游引物5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′；下游引物：5′-G GGCACGAAGGCTCATCATT-3′。TIPE3上游引物：5′-CGCAGCATGGA TTCGGATT-3′；下游引物：5′-TCAAAGATCTCGCTGCTGGTGT-3′。PCR 反應(yīng)條件為：(1)94℃、5 min；(2)94℃、0.5 min；(3)56℃、0.5 min；(4)72℃、0.5 min；(5)72℃、5 min；其中(2)～(4)循環(huán)35次。產(chǎn)物存于4℃。所得產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，在Bio-Rad凝膠成像儀上鑒定。行Western blot檢測(cè)TIPE3在兩株結(jié)腸癌細(xì)胞中蛋白水平的表達(dá)情況。PBS洗滌2次。棄上清，取細(xì)胞沉淀，加入含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液裂解細(xì)胞并提取蛋白。行 SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，滴加一抗(1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜，滴加二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，ECL顯色。用已知高表達(dá)TIPE3的HEK293細(xì)胞作為對(duì)照[6]。

1.2.2.2 人結(jié)腸腺癌細(xì)胞SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染及檢測(cè)干擾效率 采用ExFectTMTransfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑將TIPE3-shRNA-pSIREN-RetroQ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 SW480 細(xì)胞。選擇細(xì)胞狀態(tài)好且處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的SW480細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染對(duì)象。將Transfection Reagent加入分別含pSIREN-RetroQ、GFP-pSIREN-RetroQ、TIPE3-shRNA-pSIREN-RetroQ等質(zhì)粒的不完全培養(yǎng)基中制備成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。轉(zhuǎn)染復(fù)合物與 SW480細(xì)胞混勻后將之置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h后利用熒光顯微鏡觀察GFP-pSIREN-RetroQ轉(zhuǎn)染效率。取各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備RNA樣品,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,行PCR對(duì)TIPE3的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證和分析。行Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染TNFAIP8-shRNA-pSIREN-RetroQ重組質(zhì)粒的SW480細(xì)胞TIPE3干擾效率及TIPE3蛋白的表達(dá)。

1.2.3 CCK檢測(cè)轉(zhuǎn)染TIPE3-shRNA-pSIREN-RetroQ干擾質(zhì)粒SW480 細(xì)胞的存活率 行CCK檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)情況：取3.0×103細(xì)胞接種到96孔板中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h后，加入10%Cell Counting Kit-8(CCK-8)的完全培養(yǎng)基，4 h后，置于450nm波長(zhǎng)測(cè)其吸光度。

1.2.4 AnnexinV-FITC/PI流式細(xì)胞檢測(cè)aDR5ScFv誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染TIPE3干擾質(zhì)粒SW480 細(xì)胞的凋亡情況。用流式法檢測(cè) aDR5ScFv誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況。在消化前4 h加入終濃度150 μg/ml 的 aDR5ScFv培養(yǎng)基。用不含EDTA的0.25%的胰酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)1×106個(gè)細(xì)胞，用遇冷的PBS 1 000 r/min，4℃離心10 min棄上清洗滌2次后，100 μl binding buffer重

懸細(xì)胞，分別加入5 μl的PI和Annexin V-FITC 避光室溫孵育15 min，在1 h內(nèi)上機(jī)完成檢測(cè)。

1.2.5 檢測(cè)轉(zhuǎn)染TIPE3干擾質(zhì)粒的SW480 細(xì)胞相關(guān)分子pro-caspase3、cleaved caspase3、AKT、p-AKT、PDK、p-PDK、PCNA等表達(dá)活化 將轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒48 h后的SW480細(xì)胞提取蛋白，另設(shè)正常細(xì)胞組，空載細(xì)胞組，行Western blot檢測(cè)caspase3、AKT、PDK、PCNA等相關(guān)分子的表達(dá)情況。探討TIPE3干擾質(zhì)粒影響細(xì)胞增殖、凋亡的可能機(jī)制。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)使用SPSS13.0、GraphPad Prism5和Excel軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TIPE3-shRNA-pSIREN-RetroQ 干擾質(zhì)粒陽(yáng)性克隆初篩、復(fù)篩鑒定 從連接轉(zhuǎn)化后所得菌落制備PCR模板，以初篩引物進(jìn)行菌液PCR初篩鑒定。取初篩為陽(yáng)性的菌種作為PCR模板，以質(zhì)粒pSIREN-RetroQ的通用引物MSCV_primer和MSCV_rev_primer為引物，進(jìn)行復(fù)篩，將篩選為陽(yáng)性的菌種送上海英俊公司測(cè)序。復(fù)篩鑒定1、2為T(mén)IPE3-shRNA1陽(yáng)性克隆。鑒定3、4為T(mén)IPE3-shRNA2陽(yáng)性克隆。鑒定5、6為T(mén)IPE3-shRNA3陽(yáng)性克隆。復(fù)篩鑒定的PCR產(chǎn)物大小為410 bp(圖1)。

2.2 TIPE3-shRNA-pSIREN-RetroQ測(cè)序結(jié)果比對(duì) 測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件比對(duì)，與設(shè)計(jì)靶序列一致(圖2)。

圖1 重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆復(fù)篩鑒定Fig.1 Rescreen positive recombinant plasmid clonesNote: 1，2.Positive clones of TIPE3-shRNA1;3，4.Positive clones of TIPE3-shRNA2;5，6.Positive clones of TIPE3-shRNA3.

圖2 TIPE3-shRNA-pSIREN-RetroQ重組質(zhì)粒的測(cè)序圖譜和序列比對(duì)Fig.2 Sequence comparison of TIPE3-shRNA-pSIREN-RetroQ recombinant plasmid

2.3 檢測(cè)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞SW480細(xì)胞株TIPE3表達(dá)情況 通過(guò)PCR及Western blot比較人腎胚細(xì)胞HEK293、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、SW480中TIPE3表達(dá)特點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道TIPE3在HEK293細(xì)胞高表達(dá)，與HEK293細(xì)胞相比，TIPE3在人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、SW480也為高表達(dá)，且在表達(dá)上沒(méi)有差異。由此，我們選擇SW480作為干擾細(xì)胞株(圖3)。

2.4 人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系SW480 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48 h后，轉(zhuǎn)染了GFP-pSIREN-RetroQ質(zhì)粒的SW480細(xì)胞，在100倍熒光顯微鏡下觀察，視野下大量綠色熒光蛋白表達(dá)。對(duì)比自然光光鏡下SW480細(xì)胞數(shù)量，可見(jiàn)轉(zhuǎn)染GFP-pSIREN-RetroQ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率達(dá)70%。相對(duì)較高的轉(zhuǎn)染效率為后面對(duì)所構(gòu)建干擾質(zhì)粒干擾效果的檢測(cè)提供有力基礎(chǔ)(圖4)。

2.5 TIPE3-shRNA-pSIREN-RetroQ質(zhì)粒干擾效率檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的SW480細(xì)胞，提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,檢測(cè)TIPE3的基因表達(dá)情況。與正常細(xì)胞(泳道1)相比，轉(zhuǎn)染TIPE3-shRNA1、TIPE3-shRNA2、TIPE3-shRNA3質(zhì)粒(泳道2～4)的SW480細(xì)胞，TIPE3的表達(dá)量均降低，且轉(zhuǎn)染TIPE3-shRNA3 質(zhì)粒干擾效率最高(圖5)。轉(zhuǎn)染48 h后提取SW480細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)。TIPE3-shRNA3干擾組中TIPE3表達(dá)量明顯降低，低于空載質(zhì)粒和TIPE3-shRNA1/2干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。泳道1～5分別為正常細(xì)胞、pSIREN-RetroQ、TIPE3-shRNA1、TIPE3-shRNA2和TIPE3-shRNA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。綜上測(cè)試結(jié)果，構(gòu)建的TIPE3-shRNA3-pSIREN-RetroQ干擾質(zhì)粒在蛋白和RNA水平均能較好地干擾TIPE3的表達(dá)(圖6)。

圖3 SW480、HT-29與HEK293細(xì)胞TIPE3表達(dá)情況的比較 Fig.3 Comparison of expression of TIPE3 in HEK293,SW480 and HT-29Note: A.RT-PCR;B.Western blot；1.HEK293 cell;2.SW480 cell;3.HT-29 cell.

圖4 同一視野下熒光顯微鏡觀察GFP-pSIREN-RetroQ 轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞Fig.4 SW480 cell observed by fluorescence after GFP-pSIREN-RetroQ transfection at same field of visionNote: A.Observation under natural light;B.Observation under blue light.

2.6 CCK-8檢測(cè)TIPE3-shRNA-pSIREN-RetroQ干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞的生長(zhǎng) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證干擾TIPE3的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的影響，分別在轉(zhuǎn)染后24、48 h對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞行CCK-8檢測(cè)，結(jié)果表明無(wú)論是24 h還是48 h ，與正常的細(xì)胞相比，空載組的細(xì)胞存活率遠(yuǎn)高于實(shí)驗(yàn)組不同干擾序列組，表明干擾TIPE3后細(xì)胞生長(zhǎng)能力受限。且48 h時(shí)，TIPE3-shRNA3表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制作用，細(xì)胞存活率與TIPE3蛋白干擾時(shí)間成負(fù)相關(guān)。說(shuō)明構(gòu)建的TIPE3干擾質(zhì)粒具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，并呈時(shí)間依賴(lài)性(圖7)。

圖5 應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)構(gòu)建質(zhì)粒的干擾效果 Fig.5 Detection of interference of recommend plasmid by RT-PCRNote: 1.Normal SW480 cell;2.SW480 cell transfected with pSIREN-RetroQ empty control plasmid;3.SW480 cell transfected with TIPE3-shRNA1 plasmid;4.SW480 cell transfected with TIPE3-shRNA2 plasmid;5.SW480 cell transfected with TIPE3-shRNA3 plasmid.

圖6 TIPE3-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞蛋白水平表達(dá)的檢測(cè)Fig.6 Detection of protein expression of TNFAIP8L3-shRNA plasmid transfected SW480 cellsNote: 1.Normal SW480 cell;2.SW480 cell transfected with pSIREN-RetroQ empty control plasmid;3.SW480 cell transfected with TIPE3-shRNA1 plasmid;4.SW480 cell transfected with TIPE3-shRNA2 plasmid;5.SW480 cell transfected with TIPE3-shRNA3 plasmid.

圖7 CCK-8檢測(cè)shRNA干擾TIPE3表達(dá)對(duì)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞存活率的影響Fig.7 CCK-8 detect shRNA impact of SW480 cell survival rateNote: A.24 h;B.48 h,*.P< 0.05;**.P<0.01;***.P< 0.000 1.

圖8 流式檢測(cè)aDR5ScFv誘導(dǎo)SW480細(xì)胞的凋亡Fig.8 Flow cytometry detect aDR5ScFv induced SW480 cells apoptosisNote: ***.P< 0.000 1.

2.7 流式檢測(cè) TIPE3-shRNA3-pSIREN-RetroQ 干擾質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)aDR5ScFv(抗人死亡受體5單鏈抗體)可以通過(guò)結(jié)合DR5受體誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[7,8]。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明終濃度 150 μg/ml的 aDR5ScFv 作用6 h后，正常SW480細(xì)胞凋亡率為(12.10±2.213)%，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的SW480細(xì)胞凋亡率為(11.44±0.277)%，TIPE3-shRNA3干擾組的凋亡率為(27.99±1.087)%。與前兩者相比干擾組細(xì)胞凋亡增加明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而正常SW480細(xì)胞組與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的SW480細(xì)胞組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。比較正常組、空載組、干擾組細(xì)胞早期凋亡(Q3象限)發(fā)現(xiàn)，三者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖中未顯示)。說(shuō)明構(gòu)建的TIPE3干擾質(zhì)粒能夠提高結(jié)腸癌細(xì)胞SW480對(duì)aDR5ScFv的敏感性，主要通過(guò)增加中晚期凋亡促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用(圖8)。

圖9 Western blot檢測(cè)caspase3、PDK1、AKT、PCNA等蛋白的表達(dá)Fig.9 Detection of expression of caspase3，PDK1，AKT and PCNA by Western blotNote: 1.Normal SW480 cell;2.SW480 cell transfected with empty control plasmid;3.SW480 cell transfected respectively with TIPE3-shRNA3 plasmid.

2.8 Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡、增殖相關(guān)蛋白分子的表達(dá)情況 應(yīng)用Western blot檢測(cè)caspase家族成員：pro-caspase3與cleaved caspase3的表達(dá)情況。結(jié)果可見(jiàn)，與正常細(xì)胞組及空載細(xì)胞組比較，SW480細(xì)胞干擾組其cleaved caspase3明顯升高。caspase3作為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，活化的cleaved caspase3表達(dá)增高表明降低TIPE3表達(dá)可以促進(jìn)了細(xì)胞凋亡(圖9A)。并且在Total PDK1、AKT表達(dá)無(wú)明顯差異的情況下，干擾質(zhì)粒組p-PDK1、p-AKT蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯下調(diào)，而正常細(xì)胞組與空載質(zhì)粒組表達(dá)量沒(méi)有明顯差異。結(jié)果提示干擾TIPE3表達(dá)可能降低PDK1、AKT磷酸化，進(jìn)而抑制磷脂酰肌醇信號(hào)通路，使結(jié)腸癌細(xì)胞增殖減少。同時(shí)細(xì)胞增殖狀態(tài)的PCNA蛋白減少明顯，進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制(圖9B)。

3 討論

超過(guò)50%的人類(lèi)腫瘤細(xì)胞有異常的磷脂酰肌醇信號(hào)活化，雖然一大部分原因可以由PTEN、Ras或者PI3KCA的突變做出解釋[9,10]，但肯定存在其他的機(jī)制上調(diào)了該信號(hào)的活化。TIPE3作為磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以使腫瘤細(xì)胞中的磷脂酰肌醇信號(hào)的異?；钴S，能夠直接調(diào)節(jié)Ptdlns(3,4,5)P3、Ptdlns(4,5)P2的含量，闡述了另外一種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，可為腫瘤治療提出了新的靶點(diǎn)。但現(xiàn)在對(duì)TIPE3的研究成果很少，PubMed中針對(duì)TIPE3的試驗(yàn)研究有且只有2篇。TIPE3對(duì)腫瘤的增殖、遷移、侵襲的機(jī)制有待進(jìn)一步探討，為了更好地研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，我們構(gòu)建了TIPE3-shRNA-pSIREN-RetroQ干擾質(zhì)粒。

shRNA是常被用于沉默靶基因的短發(fā)夾RNA序列[11]，有與內(nèi)源性mRNA一致的兩個(gè)短反向重復(fù)序列，是RNA干擾的靶點(diǎn)。我們成功構(gòu)建了質(zhì)粒TIPE3-shRNA1-pSIREN-RetroQ、TIPE3-shRNA2-pSIREN-RetroQ和TIPE3-shRNA3-pSIREN-RetroQ。由于載體不具有綠色熒光標(biāo)記，我們用具有GFP標(biāo)簽的GFP-pSIREN-RetroQ質(zhì)粒作為判斷轉(zhuǎn)染效率的標(biāo)準(zhǔn)。我們通過(guò)RT-PCR、Western blot篩選發(fā)現(xiàn)，TIPE3-shRNA2和TIPE3-shRNA3都可以干擾TIPE3的表達(dá)，而TIPE3-shRNA3質(zhì)粒具有最佳的干擾效率，可以顯著降低TIPE3在細(xì)胞中的表達(dá)。所以，我們將應(yīng)用TIPE3-shRNA3質(zhì)粒干擾TIPE3在SW480中的表達(dá)來(lái)探討TIPE3對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

我們通過(guò)CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在24 h與48 h的時(shí)間點(diǎn)，與正常細(xì)胞相比，空載組的細(xì)胞存活率達(dá)到90%；轉(zhuǎn)染了不同干擾序列的細(xì)胞組與正常細(xì)胞組及空載組相比差異顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)RT-PCR、Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞存活率與24 h相比差異明顯。以上結(jié)果表明干擾TIPE3表達(dá)具有抑制腫瘤細(xì)胞生存的作用。文獻(xiàn)報(bào)道TIPE3促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[5]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道TIPE3在腫瘤生長(zhǎng)方面起正向調(diào)控作用相符。干擾該基因表達(dá)，腫瘤生存受到抑制。

腫瘤的生長(zhǎng)、存活與腫瘤凋亡、腫瘤增殖密不可分。為了驗(yàn)證干擾TIPE3表達(dá)，降低腫瘤生存率是通過(guò)促進(jìn)腫瘤凋亡還是抑制腫瘤增殖發(fā)揮作用，我們選擇具有干擾效果最強(qiáng)的TIPE3-shRNA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)終濃度150 μg/ml 的aDR5ScFv作用6 h，干擾組細(xì)胞的凋亡率增加明顯，與正常細(xì)胞和空載組細(xì)胞相比差異顯著。Western blot結(jié)果顯示，干擾組中caspase3活化增強(qiáng)。caspase家族參與的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中caspase3是主要的凋亡執(zhí)行者[12]。干擾TIPE3在SW480細(xì)胞中的表達(dá)可以增強(qiáng)SW480細(xì)胞對(duì)aDR5ScFv誘導(dǎo)的凋亡敏感性，并且，干擾TIPE3表達(dá)可以通過(guò)激活caspase通路增加SW480細(xì)胞的凋亡。

眾所周知，PDK1/AKT通路作為磷脂酰肌醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要節(jié)點(diǎn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、遷移等[13,14]。Western blot結(jié)果證實(shí)干擾TIPE3表達(dá)可以抑制AKT、PDK磷酸化、降低磷脂酰肌醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少腫瘤細(xì)胞增殖。PCNA作為細(xì)胞增殖蛋白，在結(jié)腸癌分期、預(yù)后判斷具有重要意義[15]，PCNA蛋白表達(dá)下調(diào)，表明細(xì)胞增殖受到抑制，我們的結(jié)果進(jìn)一步證明干擾TIPE3表達(dá)抑制SW480細(xì)胞增殖。

綜上所述，TIPE3對(duì)調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)具有重要作用，主要通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡發(fā)揮效果。干擾其表達(dá)為以后臨床分子靶向治療提供新的思路。

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[收稿2016-10-19 修回2016-12-27]

(編輯 張曉舟)

Effect and mechanism of TIPE3 interference plasmid on SW480 colorectal cancer growth

YEYu-Han,LIUZhong-Chen,QIZhong-Quan,ZHUANGGuo-Hong,YINPing.

TheSchoolofBasicMedicalSciences,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350004,China

Objective:To study the effect of interference TIPE3 on the colon cancer cell growth by transfecting SW480 colon cancer cells with the TIPE3 interference plasmid were detected.Methods: Transfecting the constructed TIPE3-shRNA-pSIREN-RetroQ plasmid to SW480 cells.To determine the highest interference efficiency plasmid,the mRNA and protein levels of recombined plasmid were detected by RT-PCR and Western blot separately and tested the cell proliferation with CCK8.Meanwhile,apoptosis rate of SW480 cells was determined by flow cytometry assay with AnnexinV-FITC/PI.To further determined the effects of recombined plasmid on cell development,the level of protein involved in proliferation and apoptosis were detected by Western blot.Results: The most effecient interference plasmids were successfully constructed.We found that the cell survival rate decreased when interference TIPE3 gene expressing in colorectal cancer cells.Flow cytometry indicated that interefering the expression of TIPE3 would increase the sensitivity of SW480 cell to apoptosis induced by aDR5ScFv.The results of Western blot showed that low expression of TIPE3 would activate caspase3 and downregulate the expression of p-AKT,p-PDK1 and PCNA.Conclusion: Interference TIPE3 could promote apoptosis and inhibit proliferation in SW480 colon cancer cells.

TIPE3 shRNA;Colon cancer;Apoptosis;Proliferation

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.013

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金(81272720)和福建省屬公益類(lèi)科研院所基本科研專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(2016R1102)資助。

葉宇涵(1991年-)，女，在讀碩士，主要從事結(jié)腸癌分子病理學(xué)研究，E-mail：yeyuhan2688@hotmail.com。

及指導(dǎo)教師：莊國(guó)洪(1969年-)，女，博士，副教授，主要從事腫瘤免疫研究，E-mail：zghxmu@163.com。 殷 平(1963年-)，男，博士，教授，主要從事炎癥及腫瘤分子病理學(xué)研究，E-mail：yinping2002@163.com。

R735.3

A

1000-484X(2017)03-0378-06

②共同第一作者。

③同濟(jì)大學(xué)第十人民醫(yī)院普通外科，上海200072。

④廈門(mén)大學(xué)抗癌研究中心，器官移植研究所，廈門(mén)361004

⑤廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，廈門(mén)361004。