陳曉飛，劉琪琦，周偉，張五星，李穎

1.解放軍第309醫(yī)院，北京 100091；2.軍事醫(yī)學科學院，北京 100850

人腺病毒及其分型方法研究進展

陳曉飛1，2，劉琪琦2，周偉1，張五星1，李穎1

1.解放軍第309醫(yī)院，北京 100091；2.軍事醫(yī)學科學院，北京 100850

人腺病毒是引起嬰幼兒急性呼吸道感染的主要病原體，還可引起其他系統(tǒng)感染。在臨床表現(xiàn)方面與其他病原微生物的感染比較相似，僅根據(jù)臨床表現(xiàn)診斷疾病比較困難，需要實驗室的診斷證實。腺病毒的致病譜根據(jù)血清型的不同而不同，而其血清型是由分子結(jié)構(gòu)中高變區(qū)的特異抗原決定的，特定血清型與疾病的嚴重程度、臨床表現(xiàn)密切相關(guān)，所以腺病毒的檢測分型尤為重要。本文就腺病毒的分子結(jié)構(gòu)、流行特點及檢測分型方法進行簡要綜述。

人腺病毒；分子結(jié)構(gòu)；分型方法

腺病毒最早是在人體的扁桃體組織中發(fā)現(xiàn)的，經(jīng)培養(yǎng)、鑒定后，確定為一種新病毒[1]。腺病毒感染多發(fā)于嬰幼兒和軍隊，近年來，腺病毒引起的呼吸道感染時有暴發(fā)，疫情具有發(fā)展快、感染性強的特點，病情嚴重者危及生命[2]，影響了嬰幼兒和士兵的健康。因此，我們要做好腺病毒感染的預防控制工作，同時也對腺病毒的檢測及分型提出了更高的要求。

1 腺病毒的分子生物學特點

腺病毒是一種無包膜球形DNA病毒顆粒，直徑65～90 nm。腺病毒的分子結(jié)構(gòu)主要包括兩部分：一是由蛋白構(gòu)成的外層衣殼，包含240個六鄰體蛋白和頂角的12個五鄰體蛋白，六鄰體蛋白是型特異性蛋白，而五鄰體蛋白是群特異性蛋白，每個五鄰體上伸出一條具有血凝特性的纖突，從而使病毒顆粒類似于通訊衛(wèi)星樣構(gòu)型；二是衣殼內(nèi)包裹的雙鏈DNA遺傳物質(zhì)，整個基因組長約38 kb[3]，根據(jù)復制時間將DNA分為早期轉(zhuǎn)錄基因和晚期轉(zhuǎn)錄基因，早期轉(zhuǎn)錄基因表達調(diào)節(jié)蛋白，晚期轉(zhuǎn)錄基因表達結(jié)構(gòu)蛋白[4]。

根據(jù)文獻報道確定了68個腺病毒型別[5]。依據(jù)生物學特性的不同，國際病毒學分類委員會（ICTV）將1～52血清型劃分為A～G共7個亞屬[6]，A、F和G主要引起消化道感染、腹瀉，C、E和部分B亞屬主要引起呼吸道疾病，其他B亞屬主要引起尿路感染，D亞屬主要引起角膜炎和結(jié)膜炎[7]。53～68型是通過高通量測序技術(shù)確定的新型腺病毒，都是由2個或多個腺病毒株重組產(chǎn)生的[8-11]，且多發(fā)生在同一種屬的不同型別之間，A、B、C、D亞屬中均有重組發(fā)生[12]。由于新毒株的感染特性和母病毒株不同[13-14]，這些病毒必須進行全基因組測序和重組分析才能明確其生物學特性和基因特征。

2 腺病毒的流行特點

腺病毒感染可引發(fā)呼吸系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及眼部疾病，如肺炎、腹瀉、膀胱炎、結(jié)膜炎等[15]。腺病毒的傳染源主要是腺病毒感染者，顯性感染者發(fā)病初期感染性最強，隱性感染者傳染作用較大，危害較大。腺病毒的傳播途徑主要是飛沫傳播，感染者的呼吸道分泌物可在空氣中保持半小時，另外還可經(jīng)糞口傳播和接觸傳播。腺病毒的易感人群有兩類：一是免疫力低下的嬰幼兒。嬰幼兒腺病毒感染可引起嚴重的肺炎或支氣管炎，甚至有致命的危險。錢淵等[16]對北京地區(qū)呼吸道腺病毒感染兒童的研究，發(fā)現(xiàn)以腺病毒3、7型為主，其次是11、14型。腺病毒55型是腺病毒11和14型重組而成的新型腺病毒，2006年在陜西首次出現(xiàn)，造成1名患兒死亡[17-18]。二是生活在聚居環(huán)境的新兵，根據(jù)全軍傳染病專業(yè)委員會編寫的《腺病毒感染診療指南》，部隊多起腺病毒疫情的病原為腺病毒55、7和14型[19]。腺病毒感染導致的急性呼吸道疾病是基層部隊冬春常見的傳染病，2011～2013年我國部分地區(qū)軍營中共發(fā)生8期腺病毒感染疫情。2012年腺病毒55型在河北保定和北京軍營開始傳播。醫(yī)學統(tǒng)計表明，新兵腺病毒感染率通常超過50%，其中20%～40%發(fā)展為肺炎且須住院治療。

3 腺病毒的分型方法

病毒分離法、免疫學方法和分子生物學方法是用于臨床和實驗室檢測的傳統(tǒng)方法。病毒分離法通常被認為是診斷腺病毒感染的金標準。常用A549和HeLa細胞培養(yǎng)臨床標本中的腺病毒，除血清型40和41外，其他血清型在人上皮細胞系上生長良好，會導致細胞圓縮，出現(xiàn)核內(nèi)包涵體聚集成串等病變現(xiàn)象，通過觀察這些特征性細胞致病作用（CPE）來分離腺病毒。該方法耗時長（通常要21 d），需要良好的技術(shù)和典型的細胞病變，不能大規(guī)模應用于臨床快速、準確的檢測。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）用于定性和（或）定量檢測人血清和血漿中抗腺病毒的IgA/IgG抗體，它包括對人體致病的所有血清型，用于診斷和鑒別診斷腺病毒的急性感染。以上兩種方法均不能區(qū)分具體血清型別。但由于腺病毒血清型眾多、致病譜廣、全球范圍內(nèi)流行[20]，且有與其他病毒混合感染的趨勢[21-22]，需要檢測具體的血清型別。中和試驗和血凝抑制試驗是常用的分型方法。中和試驗通過直接檢測腺病毒六鄰體蛋白的抗原決定簇，血凝抑制試驗則根據(jù)五鄰體蛋白的抗原決定簇檢測結(jié)果判定血清型[23]。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR擴增法、基因測序和生物芯片在腺病毒的分型鑒別中更具優(yōu)勢。

3.1 PCR擴增法

PCR擴增法是目前應用最多的一種分子診斷方式，包括常規(guī)PCR、多重PCR、巢式PCR、熒光定量PCR。它主要以腺病毒特異基因hexon的高度可變區(qū)為基礎(chǔ)，根據(jù)不同血清型基因核酸序列特點設(shè)計引物和探針，在特定的反應體系和反應條件下，通過擴增特異性目的片段進行分型。可以在數(shù)小時分析出結(jié)果，快速地對腺病毒進行血清型鑒定。多重PCR對腺病毒符合感染的診斷效果較好，熒光定量PCR在型別檢測的同時還能對病毒量進行判斷。

3.2 環(huán)介導等溫擴增法

環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型核酸擴增技術(shù)，針對靶基因的6個不同區(qū)域設(shè)計4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，于60～65℃恒溫環(huán)境，經(jīng)起始階段和擴增循環(huán)階段，實現(xiàn)核酸不停地自我循環(huán)合成。它具有靈敏度高、特異性好、操作簡單的特點[24-26]。由于腺病毒的疾病譜較廣，可以利用LAMP技術(shù)進行針對性檢測[27]，如Ziros等[28]檢測了腺病毒40和41型，李凡等[29]檢測了腺病毒3、7和14型，趙娜等[30]檢測了腺病毒7、14和55型。但LAMP技術(shù)也存在對引物設(shè)計要求較高，不能實現(xiàn)高通量的不足。

3.3 基因測序法

測序是對基因序列最準確、直觀的表達。隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，測序速度提高，成本有所降低，有望用于診斷。通過對腺病毒基因組中變異最大的區(qū)域，即編碼六鄰體蛋白、五鄰體蛋白和纖維蛋白的區(qū)域進行測序，可以快速準確地確定其型別。目前，測序主要應用在兩個方面：一是流行病學調(diào)查。Tohma等對40例腺病毒樣本的六鄰體蛋白編碼區(qū)測序，確定為3型和7型腺病毒[31]。二是腺病毒新型別的確定。新型重組型腺病毒（52～67型）都是基于全基因組測序分析而確定的[32]，Robinson認為DNA測序及生物信息學分析是識別腺病毒新型別的主要方法。

3.4 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是伴隨人類基因組計劃的實施而發(fā)展起來的，它以高通量、高靈敏度、高特異、微型化和平行化的特點，被逐漸用于病毒的基因分型，其原理是把病毒分型探針固定在基片上制成芯片，與PCR產(chǎn)物雜交，觀察信號強弱進行分型?；蛐酒夹g(shù)操作簡單、檢測樣本量大，它的運用將大大提高腺病毒分型效率[33-34]。

綜上所述，腺病毒所致的疾病譜較廣，不僅可以引起呼吸道疾病和腸道疾病，還可引起全身其他系統(tǒng)的疾病，這與其型別有密切關(guān)系。近來，由于重組變異產(chǎn)生了許多新型腺病毒并且導致混合感染的增多，因此需要快速準確的分型檢測方法。與病毒分離和免疫學方法相比，分子生物學方法具有快速、高靈敏度、高特異性的優(yōu)勢，被廣泛用于腺病毒的分型檢測。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的基因測序和基因芯片技術(shù)具有高通量的特點，可以快速準確地檢測大量樣本，在腺病毒疫情暴發(fā)后可為疾病治療爭取時間，提高應對突發(fā)疫情的能力，也可指導臨床診斷及監(jiān)測預后。

[1]Rowe W P,Huebner R J,Gilmore L K,et al.Isola?tion of a cytopathogenic agent from a human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture[J].Proc Soc Exp Biol Med,1953,84(3):570-573.

[2]高雪芬,樊婷,左素俊.一起聚集性腺病毒肺炎疫情的流行病學調(diào)查[J].中國公共衛(wèi)生管理,2012,28(6):761-762.

[3]范航.新發(fā)病毒性傳染病病原體高通量測序數(shù)據(jù)分析[D].北京:軍事醫(yī)學科學院,2016.

[4]Rux J J,Burnett R M.Adenovirus structure[J].Hnm Gene Ther,2014,15(12):1167-1176.

[5]馮曉妍,吳敏.人腺病毒感染流行病學研究進展[J].醫(yī)學動物防制,2016,32(5):518-520.

[6]Chattier C,Degryse E,Gantzer M,et al.Efficient gen?eration of recombinant adenovirus vectors by homolo?gous recombination in Escherichia coli[J].J Virol,1996,70(3):4805-4810.

[7]Hiroi S,Izumi M,Takahash K,et al.Isolation and characterization of a novel recombinant human adenovi?rus species D[J].J Med Microbiol,2012,61(8):1097-1120.

[8]Liu E B,Wadford D A,Seto J,et al.Computational and serologic analysis of novel and known viruses in species human adenovirus D in which serology and ge?nomic do notcorrelate[J/OL].PLoS One,2012,7(3):e33212.

[9]Singh G,Robinson C M,Shoaled D,et al.Overreli?ance on the hexon gene,leading to misclassification of human adenovirus[J].J Virol,2012,86(8):4693-4695.

[10]Zhou X B,Robinson C M,Rajaiya J,et al.Analysis of human adenovirus type 19 associated with epidem?ic keratoconjunctivitis and its reclassification as adeno?virus type 64[J].Immunol Microb,2012,53(60):2804-2811.

[11]Yuki M,Hideaki S,Atsukko K, et al.Novel human adenovirus strain,Bangladesh[J].Emerg InfectDis,2012,18(5):846-848.

[12]Robinson C M,Singh G,Henquell C,et al.Computa?tional analysis and identification of an emergent hu?man adenovirus pathogen implicated in a respiratory fatality[J].J Virol,2011,409(2):141-147.

[13]Walsh M P,Chintakuntlawar A,Robinson C M,et al.Evidence of molecular evolution driven by recombina?tion events influencing tropism in a novel human ade?novirus that causes epidemic keratoconjuntivitis[J].PLoS One,2009,4(6):5635.

[14]Walsh M P,Seto J,Jones M S,et al.Computational analysis identifies human adenovirus type55 as a reemergent acutere spiratory disease pathogen[J].J Clin Microbiol,2010,48(3):991-993.

[15]Lion T.Adenovirus infection in immunocompetent and immunocompromised patients[J].Clin MicrobiolRev,2014,27(3):441-462.

[16]鄧潔,錢淵,趙林清,等．近年北京兒科急性呼吸道感染患兒中腺病毒的型別腔測[J]．中華兒科雜志,2010,48(10):739-743.

[17]王玥.1329例小兒急性呼吸道腺病毒基因檢測及臨床分析[D].長春:吉林大學,2013.

[18]Zhang Q,Seto D,Cao B,et al.Genome sequence of human adenovirus type 55,a re-emergent acute respi?ratory disease pathogen in China[J].J Virol,2012,86(22):12441-12442.

[19]全軍傳染病專業(yè)委員會，新突發(fā)傳染病中西醫(yī)臨床救治課題組.腺病毒感染診療指南[J].解放軍醫(yī)學雜志,2013,7(38):529-534.

[20]Lynch J P,Fishbein M,Echavarria M.Adenovirus[J].Semin Respir Crit Care Med,2011,32(4):494-511.

[21]Lee J,Choi E H,Lee H J.Clinical severity of respi?ratory adenoviral infection by serotypes in Korean chil?dren over 17 consecutive years(1991-2007)[J].J Clin Virol,2010,49(2):115-120.

[22]Zou L,Zhou J,Li H,et al.Human adenovirus infec?tion in children with acute respiratory tract disease in Guangzhou,China[J].APMIS,2012,120(8):683-688.

[23]黃國虹,許文波.腺病毒新型別的研究進展[J].病毒學報,2013,29(3):342-348.

[24]李文桂,陳雅棠.環(huán)介導等溫擴增技術(shù)用于消化道和消化道病毒檢測的研究進展[J].重慶醫(yī)學,2014(20):2662-2665.

[25]Cook J,Aydin-Schmidt B,Gonzalez I J,et al.Loopmediated isothermal amplification(LAMP)for point-ofcare detection of asymptomatic low-density malaria parasite carriers in Zanzibar[J].Malar J,2015,14:43.

[26]吳家林,沙丹,馬廣源,等.沙門氏菌LAMP檢測方法的建立[J].中國病原生物學雜志,2015,10(7):611-614.

[27]曹亮,孫文超,解長占,等.歐洲型PRRSV重組腺病毒疫苗的構(gòu)建及免疫效果評價[J].中國病原生物學雜志,2015,10(11):961-965,975.

[28]Ziros P G,Kokkions P A,Allard A,et al.Develop?ment and evaluation of a loopmediated isothermal am?plification assay for the detection of adenovirus40 and 41[J].Food Environ Virol,2015,7(3):276-285.

[29]李凡,趙林清,鄧潔,等.兒童急性呼吸道感染中腺病毒環(huán)介導等溫擴增技術(shù)檢測方法的建立[J].中華兒科雜志,2013,51(1):52-57.

[30]趙娜,程欣,劉金霞,等.環(huán)介導等溫擴增技術(shù)檢測新兵腺病毒感染研究[J].中國病原生物學雜志,2016,11(2):126-128.

[31]Tohma K,Bayasgalan N,Suzuki A,et al.Detection and serotyping of human adenovirus from patients with influenza-like illness in Mongolia[J].Jpn J Infect Dis,2012,65(4):289-294.

[32]Robinson C M,Seto D,Jones M S,et al.Molecular evolution of human species D adenoviruses[J].Infect Genet Evol,2011,11(6):1208-1217.

[33]陳巖,潘龍.基因芯片技術(shù)研究進展[J].齊齊哈爾醫(yī)學院學報,2011,3(17):2828-2830.

[34]李永強,楊銀輝.病毒的基因芯片分型技術(shù)及其應用[J].微生物學免疫學進展,2008,36(3):56-61.

Research Progress of Adenovirus and its Classification Methods

CHEN Xiao-Fei1,2,LIU Qi-Qi2*,ZHOU Wei1*,ZHANG Wu-Xing1,LI Ying1
1.309thHospital of PLA,Beijing 100091;2.Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850;China

Human adenovirus is the main pathogen of the acute respiratory infection in infant,and it also can in?fect other systems.It is difficult to diagnose the disease according to the clinical maifestation,because it is simi?lar with other pathogenic microorganism in clinical manifestations.Thus,we need laboratory diagnosis.The sero?type is decided by hypervariable region specific antigen of molecular structure.Different serotype have different pathogenic spectrum,so the adenovirus serotyping detection is particularly important.In this paper,we summarized the molecular structure and detection of adenovirus serotyping methods.

human adenovirus;molecular structure;serotyping methods

R373

A

1009-0002（2017）05-0700-04

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,ZHOU Wei,E-mail:cxiaofei0805@163.com;LIU Qi-Qi,E-mail:shuixiyinhexl@sina.com

2017-01-12

重大新藥創(chuàng)制科技重大專項（2015ZX09J15105-001-001）

陳曉飛（1988- ），女，碩士，（E-mail）1191040061@qq.com

周偉，（E-mail）cxiaofei0805@163.com；劉琪琦，（E-mail）shuixiyinhexl@sina.com