畢小玲，宋娟，莊曉洪，王艷

（成都市食品藥品檢驗研究院，四川成都610045）

固相萃取-HPLC法檢測熟肉制品中合成色素

畢小玲，宋娟，莊曉洪，王艷

（成都市食品藥品檢驗研究院，四川成都610045）

建立固相萃取-高效液相色譜法同時測定熟肉制品中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃4種合成色素的方法。熟肉制品絞碎后加入乙醇+氨水（75+25）溶液，經(jīng)渦旋分散、超聲提取，固相萃取柱凈化后，采用一臺液相儀器、兩根KromasilC18柱串聯(lián)分離，以甲醇和5mmol/L乙酸銨水溶液為流動相進行洗脫，用二極管陣列檢測檢測器在254 nm波長下檢測。該方法在10 ng～160 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.999 8）；4種色素回收率為87.0%～95.5%，檢出限為0.04mg/kg～0.05mg/kg，相對標準偏差為2.37%～6.76%。該方法能同時分析熟肉制品中4種合成色素，并能得到穩(wěn)定準確的結(jié)果，節(jié)約檢測時間。

固相萃??；高效液相色譜法；合成色素；熟肉

熟肉制品以其營養(yǎng)豐富、味道鮮美而深受人們喜愛，市面上銷售的熟肉制品具有食用方便、味道鮮美及色澤誘人等特點，是廣大消費者熱衷的熟食制品。然而不法生產(chǎn)商為降低成本，采用質(zhì)量相對較差的原料，通過添加檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃等合成著色劑制作出色澤誘人的產(chǎn)品，從而實現(xiàn)改善產(chǎn)品色澤、提高銷量的目的[1-2]。

合成著色劑因其成本低、著色效果好，被生產(chǎn)商用于食品的制作過程。隨著研究的不斷深入，人們開始逐漸認識到人工合成著色劑大多是偶氮類型化合物，許多偶氮類型化合物在人體內(nèi)可代謝生成有毒副作用的物質(zhì)[3]。鑒于其不安全因素，國內(nèi)外對合成著色劑的使用制定了嚴格的規(guī)定，GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》也對合成著色劑的使用范圍和用量做了規(guī)定，其中熟肉制品中不得使用檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃等合成著色劑[4]。

現(xiàn)行的食品檢驗標準未涵蓋熟肉制品中這4種合成著色劑的檢驗[5-6]。熟肉制品基質(zhì)復雜，合成著色劑著色力強，需用超聲等強化提取方法進行提取，并進行凈化方可進行下一步分析。文獻中提取方法對與基質(zhì)相結(jié)合的著色劑提取不能保證，且用聚酰胺粉和抽濾漏斗進行凈化，步驟繁瑣，對批量檢測造成了一定困難[2，7-12]。該研究采用超聲提取、全自動固相萃取凈化相結(jié)合的方法，并用雙柱同時進行檢測，為高效液相色譜法檢測熟肉制品中多組分著色劑提供了快速有效的方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑

樣品（鹵豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉等熟肉制品）：市場抽檢；標準物質(zhì)：檸檬黃標準品溶液：中國計量科學研究院；莧菜紅、胭脂紅、日落黃標準品溶液：國家標準物質(zhì)研究中心；甲醇（色譜純）：德國Merck；甲醇、乙醇、乙酸銨、氨水、甲酸等均為分析純；超純水（電阻18.3 MΩ/cm2）；Cleanert PWAX固相萃取柱（500 mg，3 mL）：北京Agela公司。

1.2儀器與設(shè)備

Ultimate 3000雙三元高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器和Chromeleon 7.0工作站）：美國熱電公司；GX-274全自動固相萃取儀：法國Gilson公司；實驗室常規(guī)儀器。

1.3方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：Kromasil100-5C18（4.6mm×250mm）；柱溫：35℃；流動相：甲醇（A）和5mmol/L乙酸銨（B）；梯度洗脫程序見表1和表2；進樣體積：10μL；流速：1.0mL/min；檢測波長254 nm。

表1 流動相洗脫梯度Table1 Gradientelution program

表2 流動相洗脫梯度Table2 Gradientelution program

1.3.2樣品提取

稱取2.00 g絞碎樣品于50 mL離心管中，加入10mL提取溶劑（乙醇+氨水=75+25），渦旋分散1min，超聲提取20min，室溫10 000 r/min離心5min，傾出上清液，加入10mL提取溶劑重復提取1次，合并上清液并搖勻。取上清液10mL于雞心瓶，于50℃濃縮至4 mL～5mL，于70℃恒溫30 s，分別加入1mL硫酸溶液（濃硫酸∶水=1∶9，體積比，）和1mL鎢酸鈉溶液（100 g/L），搖勻，繼續(xù)于70℃水浴恒溫5min，取出放至室溫，轉(zhuǎn)移雞心瓶內(nèi)物質(zhì)并用水定容至10mL，搖勻，10 000 r/min離心5min，轉(zhuǎn)移上清液至50mL離心管并用氨水調(diào)pH=5.0，待凈化。

1.3.3凈化

分別用6 mL甲醇、6 mL水活化固相萃取柱；取8 mL待凈化液以0.5mL/min速度過柱；依次用6mL 0.5%甲酸甲醇溶液、6mL水淋洗小柱；最后用6mL 25%氨水甲醇以0.5mL/min速度洗脫，洗脫液于50℃氮氣吹干，加水超聲溶解殘渣并定容至1mL，10 000 r/ min離心10min，上清液待測。

2結(jié)果與分析

2.1目標檢測物的選擇

GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》對可用于熟肉制品中的色素做了明確規(guī)定，其中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃禁止在熟肉制品中使用[4]。但是，由于這4種色素在市面使用較多，著色后的食物顏色自然，能夠刺激消費者的食欲，同時，熟肉制品本身的顏色多為紅色或黃色，因此這4種色素易被生產(chǎn)商用來改善熟肉制品的感官，減少劣質(zhì)產(chǎn)品的損失，以較低的成本獲得好的銷量。另外，在以往報道出的食品安全事故中，檸檬黃和日落黃在餐飲店熟肉制品中被檢出?；谝陨闲畔ⅲx擇了這4種著色劑進行研究。

2.2色譜條件的優(yōu)化

2.2.1流動相的選擇

所選合成色素偏極性，根據(jù)極性差別，4種物質(zhì)在反相色譜分離條件下流出時間也不同，采用甲醇-乙酸銨溶液體系作為流動相進行梯度洗脫，可以使4種物質(zhì)得到很好的分離，并得到較好的峰形。當乙酸銨濃度為0.02mol/L[2，5-6，8-10]，甲醇初始比例為5%時，最后出峰時間為15min；當乙酸銨濃度降為0.005mol/L，甲醇初始比例為5%時，最后出峰時間可縮短到13.2min，此時4種物質(zhì)也可以實現(xiàn)基線分離，且峰形對稱。目標峰全部流出后將甲醇比例增加到90%，在6min內(nèi)可將色譜柱中的雜質(zhì)沖出，然后切換到初始濃度進行平衡，整體分析時間為25min。

2.2.2 色譜儀器的選擇

當使用Ultimate 3000液相色譜儀的雙三元泵系統(tǒng)，串聯(lián)兩根相同型號的色譜柱進行分析，在4種目標物全部由柱1流出后，對色譜柱進行切換，使柱1的沖柱程序在后臺運行，用柱2開始分析下一個樣品。此時完成一個樣品的分析時間為14min，在很大程度上提高分析效率。

2.2.3檢測波長的選擇

通過二極管陣列檢測器對4種物質(zhì)在190 nm至600 nm范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果顯示，檸檬黃在196、259、427 nm處有最大吸收，莧菜紅在217、521 nm有最大吸收，胭脂紅在216、248、335、509 nm處有最大吸收，日落黃在236、315、482 nm處有最大吸收，綜合掃描結(jié)果、國標方法，選擇254 nm作為唯一檢測波長，既減少波長設(shè)置數(shù)、又可實現(xiàn)較低的檢測限。

最佳色譜條件下，對標準品和樣品進行分析，結(jié)果如圖1和圖2。

圖1 合成色素標準混合溶液分離色譜圖Fig.1 Chromatogram for them ixed 4 synthetic pigmentsstandards

圖2 樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram for sam ple

2.3樣品前處理條件的優(yōu)化

2.3.1提取條件的選擇

這4種色素極性較強，易溶于水，微溶于乙醇。用水作為提取溶劑較難得到與蛋白質(zhì)結(jié)合的色素，并且將提取出較多水溶性雜質(zhì)。因此比較了氨水乙醇水溶液（20+70+10）[6，9，13]、氨水乙醇溶液（25+75）[8]對熟肉制品中色素的提取效率。結(jié)果表明，氨水乙醇溶液（25+ 75）提取率相對高。標準及文獻[6，11，13]中先用石油醚去除油脂，然后加提取溶劑提取，研究對其進行了比較，結(jié)果顯示用與不用石油醚對提取結(jié)果影響較小。

將樣品粉碎，加入提取溶劑，渦旋分散樣品并超聲提取10min，所得樣品提取率高于不超聲。勻漿提取與超聲比較，提取效率接近，均為90%左右，因此選擇超聲提取，可簡化提取步驟。

分別對樣品提取2次與3次，每次加入提取溶劑10mL。提取次數(shù)為2次與提取3次結(jié)果接近，因此選擇2次提取。

提取指標的回收率數(shù)據(jù)比較見表3。

表3 提取指標考察Table3 Research of extraction items

2.3.2凈化條件的優(yōu)化

標準及文獻[5-6，15]方法采用聚酰胺粉吸附法進行凈化，控制操作溫度為60℃～70℃，用漏斗抽濾，經(jīng)至少3次淋洗，需淋洗液和洗脫液體積大，過程繁瑣。研究選用PWAX固相萃取柱凈化，將待凈化液用氨水調(diào)節(jié)pH=5.0，上樣后用5%甲酸甲醇溶液、水依次淋洗，然后用25%氨水甲醇洗脫，氮氣吹干，用水定容即可。極大地簡化了操作步驟，同時能進行批處理，提高了檢驗效率。

2.3.3針頭過濾器的選擇[11]

研究顯示，尼龍膜和聚醚砜膜對莧菜紅和胭脂紅均有吸附，為了避免損失，檢驗過程采用高速離心代替過濾。經(jīng)試驗，未經(jīng)過膜的樣品并未顯著影響色譜柱的使用壽命。因此，選擇高速離心后直接上機測試。

2.4分析方法特性

2.4.1標準曲線和檢出限

分別吸取4種標準物質(zhì)適量，用水稀釋成質(zhì)量濃度為100mg/L的混合標準儲備液，再用水將儲備液稀釋成質(zhì)量濃度為1、2、4、8、16mg/L的標準系列，分別取10μL注入液相色譜儀測定，得標準曲線和方法檢出限，各著色劑峰面積與濃度的線性關(guān)系方程、相關(guān)系數(shù)、及檢出限如表4所示。

2.4.2加標回收和精密度

平行稱取9份陰性粉碎樣品于50mL離心管，分為3組，分別加入相當于4、10、20μg色素含量的混合標準品溶液，渦旋分散，并放置30min。按照樣品提取與凈化方法對9個樣品進行處理，測定，計算回收率和精密度，結(jié)果見表5和圖3。

表4 色素各組分標準曲線方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table4 Calibration equations，linerity range，correlation coefficientsand detection lim its for the4 synthetic pigments

表5 加標回收率（n=3）Table5 Recovery and RSD for the4 synthetic pigmentsin spiked sample（n=3）

圖3 樣品加標色譜圖Fig.3 Chrom atogram for spiked sam ple

3結(jié)論

通過對熟肉制品中合成著色劑的提取、凈化、色譜分析，建立了適用于檢驗熟肉制品中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃含量的方法。方法中超聲提取、批處理凈化、流動相優(yōu)化、雙柱同時分析等步驟，確保提取效果的同時，縮短了分析時間，檢出限優(yōu)于標準方法GB/T5009.35-2003《食品中合成著色劑的測定》，且方法重現(xiàn)性、精密度、穩(wěn)定性良好。試驗表明，該方法適用于熟肉制品中合成著色劑的檢驗。

采用此檢測方法共檢出抽檢熟肉制品中濫用合成色素23批次，其中檸檬黃18批次，添加范圍0.000 59 g/kg～0.014 g/kg；胭脂紅3批次，添加范圍0.000 76 g/kg～0.005 2 g/kg；檸檬黃2批次，添加范圍0.010 g/kg～0.015 g/kg。

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Determ ination of Synthetic Pigments in Cooked M eat by Solid Phase Extraction and HPLC

BIXiao-ling，SONG Juan，ZHUANGXiao-hong，WANGYan
（Chengdu Center for Food and DrugControl，Chengdu 610045，Sichuan，China）

Amethod ofsolid phase extraction（SPE）and high performance liquid chromatography（HPLC）for determining synthetic pigments in cooked meatwas developed.It included lemon yellow，amaranth，carmine and sunsetyellow.Cookedmeatwasminced.By adding ethanol-ammonium hydroxide solvent（75±25），eddying，supersonic extracting and SPE purifying，the synthetic pigments was extracted.Then the 4 components could beeluted and seperated in KromasilC18 column bymobile phasemadeup ofmethanoland 5mmol/Lammonium acetate.Theywere detected in 254 nm by diode array detector.There could be 2 same columns paralled forsimultaneousanalysis.Themethod exhibited excellent linearity overa rangeof10 ng-160 ng（r≥0.999 8）. The recovery rate，detection limit，and relative standard deviation（RSD）were 87.0%-95.5%，0.04mg/kg-0.05mg/kg，2.37%-6.76%.Themethod can providessimultaneously steady and accurate results for the 4 synthetic pigments in cookedmeat，and save the detection time.

solid phase extraction（SPE）；high performance liquid chromatography（HPLC）；synthetic pigment；cookedmeat

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.038

2016-05-03

畢小玲（1982—），女（漢），工程師，碩士，從事食品理化檢驗工作。