朱敬萍，金雷，張小軍，陳瑜，顧蓓喬，梅光明

(浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江 舟山316021)

小鼠生物法檢測麻痹性貝類毒素技術(shù)探討及應(yīng)用

朱敬萍，金雷，張小軍，陳瑜，顧蓓喬*，梅光明

(浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江 舟山316021)

為了確保貝類毒素監(jiān)測結(jié)果的有效性和可信性，建立和規(guī)范快速準(zhǔn)確的麻痹性貝類毒素(PSP)檢測方法，本研究梳理了小鼠生物法(MBA)快速準(zhǔn)確檢測PSP的實驗室規(guī)范要求、影響因素及操作要點。并運用MBA法，對浙江沿岸海域養(yǎng)殖區(qū)采集的貝類樣品進(jìn)行3個批次的PSP應(yīng)急監(jiān)測分析，結(jié)果表明，赤潮高發(fā)對貝類富集PSP有很大影響。此外，結(jié)合對浙江沿岸養(yǎng)殖區(qū)PSP的現(xiàn)狀分析，提出了養(yǎng)殖貝類質(zhì)量安全相關(guān)監(jiān)管意見。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2017，7(2):30-35]

麻痹性貝類毒素；小鼠生物法；質(zhì)量控制；監(jiān)測；能力驗證

近年來，隨著近岸水體污染日益嚴(yán)重和生態(tài)環(huán)境的持續(xù)惡化，中國海域赤潮發(fā)生頻率呈上升趨勢，而且有毒赤潮記錄也大幅上升[1]，這不僅對漁業(yè)、濱海旅游業(yè)造成了嚴(yán)重的破壞，同時也對海洋生態(tài)系統(tǒng)以及人類健康產(chǎn)生影響[2-3]。海洋藻毒素是由海洋中的有毒赤潮藻類通過食物鏈傳遞給藻食性的魚、蝦及貝類等生物，并在其體內(nèi)蓄積形成的有毒高分子化合物[4-5]，人類食用了含有藻毒素的海產(chǎn)品時可能會引起中毒，嚴(yán)重可致其死亡[6]。赤潮毒素中的麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish poisoning，PSP)因?qū)θ祟愇：?yán)重而受到廣泛關(guān)注，已成為全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和海洋食品進(jìn)出口部門的重點檢測對象?，F(xiàn)已證實亞歷山大藻(Alexandrium)、膝溝藻屬(Gonyaularx)、原甲藻屬(Prorocentrum)等甲藻是PSP的直接生產(chǎn)者[7]。PSP具有毒性大、中毒范圍廣、反應(yīng)快等特點，其毒性與河豚毒素相當(dāng)[8]。

貝類產(chǎn)品面臨著很大的PSP污染風(fēng)險，因此在赤潮研究中也倍受重視。近30年來，隨著各項生物技術(shù)和化學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展和成熟，對麻痹性貝毒的相關(guān)檢測技術(shù)研究也越來越深入，并逐漸形成了小鼠生物測定法(MBA)[9]、化學(xué)儀器分析法(如HPLC法)[10]和免疫化學(xué)分析法(如ELISA法)[11]等成熟的檢測方法。然而，HPLC方法存在PSP分析標(biāo)準(zhǔn)品普遍缺乏，而且PSP類似物相互轉(zhuǎn)化，干擾檢測結(jié)果，最終影響對總毒性的判斷。ELISA法由于往往只針對主要成分建立抗體，而對其他成分的敏感性較低，在一定程度上影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性，而且檢測試劑盒成本高，開展檢測有困難。在諸多方法中，小鼠生物測定法(MBA)作為PSP的半定量分析方法，具有可靠性強(qiáng)、表達(dá)毒性直接、使用廣泛等優(yōu)點，是目前唯一國際大多數(shù)國家普遍接受的方法[12-18]，也被美國公職分析化學(xué)家協(xié)會(AOAC)推廣為PSP的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。AOAC定義一個鼠單位為給予20 g小鼠注射1 mL貝類提取物，使其在15 min內(nèi)致死的最小劑量。

為進(jìn)一步加強(qiáng)水產(chǎn)品質(zhì)檢機(jī)構(gòu)貝類毒素檢測能力建設(shè)，全面提高質(zhì)檢機(jī)構(gòu)整體素質(zhì)和技術(shù)水平，確保貝類毒素監(jiān)測結(jié)果的有效性和可信性，很有必要去建立和規(guī)范快速準(zhǔn)確的PSP檢測方法。本研究采用MBA檢測貝類樣品中的PSP，并結(jié)合2010—2016年農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局組織的能力驗證考核結(jié)果，總結(jié)了MBA快速準(zhǔn)確檢測PSP的實驗室規(guī)范要求、影響因素及操作要點等。同時對浙江沿岸海域養(yǎng)殖區(qū)采集的貝類樣品進(jìn)行PSP應(yīng)急監(jiān)測分析，得到了貝類產(chǎn)品中PSP的污染含量，了解和掌握浙江沿岸養(yǎng)殖貝類質(zhì)量安全狀況，以期為深入開展有害赤潮毒素的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑及實驗小鼠

主要儀器及耗材：均質(zhì)器(型號SQ2119N，上海帥佳電子科技有限公司)；高速離心機(jī)(型號Centrifuge 5810，德國Eppendorf公司)；電子天平(型號JY6001，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；1 mL注射器；秒表等。

主要試劑：0.1和5.0 mol /L鹽酸溶液，0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，pH試紙0.5～5，實驗用水為去離子水。以上試劑均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

實驗小鼠為ICR級雄性小鼠，重量在18～22 g，從浙江省實驗動物中心購買。

1.2 小鼠生物測定法

1.2.1 PSP的制備

用清水將貝類外殼洗凈，挑出貝肉，并用清水去除泥沙及其他雜質(zhì)。收集100 g貝肉置于均質(zhì)杯內(nèi)，均質(zhì)2 min后，加入100 mL 0.1 mol /L鹽酸中充分?jǐn)嚢瑁{(diào)節(jié)pH至2.0～4.0。徐徐煮沸5 min，充分提取貝肉中PSP毒素；冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH至2.0～4.0。將混合物移至量筒中，并稀釋至200 mL。然后把混合物倒回?zé)瑪嚢柚辆|(zhì)狀，使其沉降至上清液呈半透明狀，不會堵塞注射針頭即可，必要時可將混合物或上清液以3 000 r/min離心5 min，或用濾紙過濾。保留進(jìn)行小鼠注射用的足量液體，如不能及時注射，需冰箱冷藏。

1.2.2 注射與測定

將上清提取液按每只小鼠1 mL注射量分別對3只實驗小鼠進(jìn)行腹腔注射，記錄小鼠死亡時間。若小鼠的死亡時間大于60 min，則待測樣品的鼠單位即相當(dāng)于小于0.875 MU；若小鼠的死亡時間小于5 min，則要稀釋樣品提取液再注射另一組小鼠3只，直至其死亡時間為5～7 min。最后，根據(jù)小鼠死亡時間，查“PSP死亡時間-鼠單位的關(guān)系表”和“小鼠體重校正表”，計算得出100 g貝肉中含PSP的鼠單位值[19]。PSP的含量按公式(1)計算。

式(1)

式(1)中：X為樣品中PSP含量，MU/100g；ki為每只小鼠的重量校正系數(shù)；Mi為每只小鼠的鼠單位數(shù)，MU；D為樣品提取液的稀釋倍數(shù)；i為每組小鼠的數(shù)量；200為樣品量，g。

注射前需先將小鼠做好標(biāo)記。在抽取時切勿使針管的針頭堵塞，并保證針管中無氣泡，然后將試液注射到小鼠腹腔中，詳見圖1。在對小鼠進(jìn)行腹腔注射時，若有一滴以上提取液溢出，需將該只小鼠丟棄，并重新注射一只小鼠。

圖1 樣品提取液注射(a)和實驗小鼠標(biāo)記(b)Fig.1 Sample extract injection (a) and experimental mouse markers (b)

1.3 毒性大小觀察及記時

將注射完的小鼠放入無菌通風(fēng)籠具中，平放于實驗臺面，并用秒表記錄時間。實驗開始時間以注射完1 mL提取液時間為準(zhǔn)。仔細(xì)觀察小鼠存活狀態(tài)，直至小鼠呼出最后一口氣為止(圖2)，用計時器記錄小鼠停止呼吸時的死亡時間，即結(jié)束時間。小鼠注射含PSP的提取液后反應(yīng)劇烈，出現(xiàn)運動速率加快并伴有彈跳等癥狀，且致死時間短。

圖2 毒素注射后小鼠最初狀態(tài)(a)及致死反應(yīng)(b)Fig.2 The initial state (a) and death reaction (b) of mice after injection of toxins

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠生物法建立及優(yōu)化

2.1.1 動物實驗室操作規(guī)范要求

PSP小鼠生物法實驗必須實施優(yōu)良實驗室操作規(guī)范(good laboratory practice，GLP)。GLP實驗室的正常運行人員素質(zhì)是關(guān)鍵，實驗設(shè)施是基礎(chǔ)，標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)是手段，質(zhì)量監(jiān)督是保證；硬件是外殼，軟件是核心。只有推進(jìn)GLP規(guī)范，才能做到動物實驗的規(guī)范化。按相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范對實驗動物飼料、飲水、設(shè)施、環(huán)境質(zhì)量進(jìn)行有效的調(diào)控，保證給予實驗動物舒適的生活環(huán)境和待遇，維持實驗動物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；以合理的設(shè)計、周密的安排、熟練的技能開展動物實驗，并對動物的行為、表現(xiàn)、反應(yīng)進(jìn)行細(xì)致的觀察和記錄，保證實驗結(jié)果有高度的可靠性和重復(fù)性。

2.1.2 環(huán)境因素對小鼠生物法實驗的影響

小鼠生物法實驗結(jié)果受多種環(huán)境因素影響，如溫度、濕度、氣流、光照及噪聲等。

1)溫度

實驗小鼠的最適宜溫度20～26 ℃，最大日溫差≤4 ℃[20]。環(huán)境溫度不同，常使動物實驗出現(xiàn)差異。比如在小鼠急性毒理實驗中，LD50(mg/kg) 在15.5 ℃時值為111.0，在27.0 ℃時則為33.2[21]，結(jié)果完全不同。

2)濕度

屏障系統(tǒng)內(nèi)相對濕度應(yīng)控制在40%～70%之間[20]，長期飼養(yǎng)相對濕度應(yīng)在(50±5)%范圍最佳[22]。相對濕度過高或者過低時，會導(dǎo)致實驗小鼠新陳代謝等生理功能紊亂，抵抗力降低，煩躁異常，進(jìn)而影響實驗結(jié)果[23]。

3)氣流與風(fēng)速

氣流與風(fēng)速影響動物機(jī)體的散熱。在氣溫較高環(huán)境下，氣流有助于對流散熱，有利于實驗小鼠降溫；但在較低溫度下，隨風(fēng)速的增加實驗小鼠體溫明顯下降。通常，屏障系統(tǒng)在適宜溫度時，氣流控制在0.25 m/s以下。

4)光照及噪聲

光照通過影響小鼠的活動和一般行為來影響實驗結(jié)果[24]，通常在10～20 lx (動物照度)或150～300 lx (工作照度)比較適中。噪聲能引起實驗小鼠生理功能異常，表現(xiàn)為神經(jīng)功能紊亂、煩躁不安、呼吸和心跳加快、血壓升高等癥狀。通常實驗環(huán)境要求控制在40～50 dB以下。

以上多種因素相互影響相互作用，對小鼠實驗的影響往往是多種因素聯(lián)合作用的結(jié)果。因此，在PSP小鼠生物法實驗中要積極有效地去平衡和控制上述環(huán)境因素，讓其在屏障系統(tǒng)內(nèi)形成良性循環(huán)，以保證實驗動物處于正常的生理狀態(tài)，以期提供更為準(zhǔn)確、可靠的實驗數(shù)據(jù)。

2.1.3 PSP小鼠生物法檢測操作要點

不同品系小鼠，例如BALB/c小鼠和ICR小鼠，對PSP的敏感性不同。而國內(nèi)用小鼠生物法檢測PSP時，多用ICR小鼠，這保證了實驗結(jié)果的一致性和對比性。將提取液加熱時，應(yīng)徐徐煮沸5 min，切勿加熱時間過長。因為在酸性環(huán)境中加熱時，有可能促使N-磺酰氨甲酰基類毒素轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的氨基甲酸酯類毒素，導(dǎo)致毒性增大而出現(xiàn)實驗結(jié)果偏差。稀釋提取液時，要逐滴加入0.1或0.01 mol/L鹽酸溶液，緩慢調(diào)節(jié)pH至2.0～4.0。另外，在用NaOH溶液調(diào)整pH時，滴加速度要緩慢，同時需不斷攪拌，防止局部堿化破壞毒素；而且NaCl的含量也會影響毒性的測定，1%含量的NaCl可使毒性降低一半，最終導(dǎo)致小鼠死亡時間延長，出現(xiàn)結(jié)果偏差，因此應(yīng)控制NaOH溶液用量，確保實驗結(jié)果真實可靠。

2.2 能力驗證

為進(jìn)一步加強(qiáng)水產(chǎn)品質(zhì)檢機(jī)構(gòu)能力建設(shè)，全面提高質(zhì)檢機(jī)構(gòu)整體素質(zhì)和技術(shù)水平，受農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局委托，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院于2010年8月至2016年6月開展了7次PSP檢測能力驗證工作。本實驗室參加以上能力驗證的考核，并參加2010年11月國家認(rèn)監(jiān)委組織的CNCA-10-B04麻痹性貝類毒素(PSP)檢測能力驗證考核。考核結(jié)果詳見表1。

具體評價標(biāo)準(zhǔn)為：對檢測結(jié)果的對數(shù)值按Z比分?jǐn)?shù)法統(tǒng)計，︱Z︱≤2的判定為滿意結(jié)果，2<︱Z︱<3的判定為可疑結(jié)果，︱Z︱≥3的判定為不滿意或離群結(jié)果。由表1可見，本實驗室參加農(nóng)業(yè)部組織的麻痹性貝類毒素(PSP)檢測能力驗證考核和國家認(rèn)監(jiān)委組織的CNCA-10-B04麻痹性貝類毒素(PSP)檢測能力驗證考核，均為滿意結(jié)果。

表1 麻痹性貝類毒素檢測能力驗證結(jié)果Tab.1 Results of shellfish toxin detection ability verification n=3

注：—表示考核結(jié)果沒有體現(xiàn)z-比分?jǐn)?shù)。

2.3 貝類樣品應(yīng)急檢測

2011年5月下旬浙江省沿海海域發(fā)生赤潮，大量的養(yǎng)殖魚類、貝類和海洋生物發(fā)生死亡。本實驗室于5月下旬和6月初對溫州、臺州、舟山等貝類養(yǎng)殖海域的貽貝進(jìn)行采集，并進(jìn)行PSP3個批次的應(yīng)急檢測，檢測結(jié)果見表2。

表2 貝類毒素應(yīng)急樣品檢測結(jié)果Tab.2 Test results of shellfish toxin emergency samples n=3

通過表2檢測結(jié)果可知，浙江沿岸養(yǎng)殖區(qū)域所采集的貝類中，一些貝類其體內(nèi)保存或積累了一定量的PSP，其中在嵊泗、臺州所采集的貽貝中有檢出，而且嵊泗一個點采集的貝類中PSP的含量大于400 MU/100 g，超出了農(nóng)漁發(fā)〔2016〕8號文件要求的限量標(biāo)準(zhǔn)(限量值為80 μg/100 g，即400 MU/100 g)。從表2中可以看出，相比5月采集的貝類，6月初檢測的貝類樣品中PSP的檢出率和檢出值均有所下降，說明赤潮發(fā)生時對貝類富集PSP有很大影響。因此，一旦發(fā)生赤潮等情況，就必須關(guān)閉養(yǎng)殖場，同時對已收獲的養(yǎng)殖貝類進(jìn)行暫養(yǎng)或凈化處理，直到貝類的品質(zhì)適于食用后才能上市銷售。PSP對養(yǎng)殖業(yè)的影響不僅限于對養(yǎng)殖業(yè)本身，還易造成人們對貝類消費的恐慌，一旦發(fā)生貝類中毒事件，貝類消費將迅速下降，而且在很長時間內(nèi)難以恢復(fù)。因此，為了有效防止PSP對養(yǎng)殖業(yè)和公眾健康的影響，就必須建立起完善的監(jiān)測體系，包括對有毒赤潮的監(jiān)控和養(yǎng)殖貝類產(chǎn)品毒素的監(jiān)測，同時建立進(jìn)口貝類的市場準(zhǔn)入制度。另外有關(guān)部門需加強(qiáng)對貝類養(yǎng)殖區(qū)產(chǎn)品及環(huán)境的監(jiān)控，保護(hù)好當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)殖環(huán)境，促進(jìn)貝類養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

3 小結(jié)

本研究采用小鼠生物法檢測貝類中的PSP，梳理了實驗必須實施的優(yōu)良實驗室操作規(guī)范，總結(jié)了溫度、濕度、氣流、光照及噪聲等環(huán)境因素對小鼠實驗的影響，及多種因素聯(lián)合作用。在PSP小鼠生物法實驗中要積極有效地去平衡和控制環(huán)境因素，讓其在屏障系統(tǒng)內(nèi)形成良性循環(huán)，以保證實驗動物處于正常的生理狀態(tài)，以期提供更為準(zhǔn)確、可靠的實驗數(shù)據(jù)。本實驗室在農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局組織的麻痹性貝類毒素(PSP)檢測能力驗證考核和國家認(rèn)監(jiān)委組織的CNCA-10-B04麻痹性貝類毒素(PSP)檢測能力驗證考核中，考核結(jié)果均為滿意。對浙江沿岸海域養(yǎng)殖區(qū)采集的貝類樣品進(jìn)行PSP應(yīng)急監(jiān)測分析，結(jié)果表明，赤潮發(fā)生時對貝類富集PSP有很大影響。本研究為采用小鼠生物法檢測貝類中的PSP提供技術(shù)支持。

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Investigation and application of mouse bioassay in the determination of paralyticshellfish poisoning

ZHU Jingping, JIN Lei, ZHANG Xiaojun, CHEN Yu, GU Beiqiao*, MEI Guangming

(Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Province, Fishery Environment and Aquatic Product Quality Supervision Testing Center (Zhoushan), Key Lab of Mariculture and Enhancement of Zhejiang Province, Zhoushan 316021, China)

In order to ensure the effectiveness and credibility of monitoring results of shellfish poison, and establish and regulate accurate, rapid detection methods of paralytic shellfish poisoning (PSP), the study summarized the good laboratory practice, influencing factors and operation points in MBA experiment. Three batches of shellfish samples collected from the coast of Zhejiang were detected using MBA. The results showed that red tides had a significant impact on PSP enrichment of shellfish. In addition, through the status analysis of PSP in the coast of Zhejiang, supervision opinion was suggested on the quality and safety of cultivated shellfish. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(2):30-35]

PSP; mouse bioassay; quality control; monitoring; proficiency testing

GU Beiqiao, gbq@zjou.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.02.006

2016-09-30；接收日期：2016-11-28

浙江省科技計劃項目(2017F10018，2016C32074，2016F30020，2016F30022)

朱敬萍(1960-)，女，高級工程師，研究方向為水域環(huán)境及食品安全研究，ZJP669888@163.com 通信作者：顧蓓喬，工程師，研究方向為水域環(huán)境及食品加工，gbq@zjou.edu.cn

S91

A

2095-1833(2017)02-0030-06