王強(qiáng)，王旭峰，趙東豪，黃珂，古小莉，李劉冬

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(廣州)，農(nóng)業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(廣州)，廣東 廣州 510300)

水產(chǎn)品中慶大霉素直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法的建立

王強(qiáng)，王旭峰，趙東豪，黃珂，古小莉，李劉冬*

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(廣州)，農(nóng)業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(廣州)，廣東 廣州 510300)

建立了測(cè)定水產(chǎn)品中慶大霉素(GM)殘留的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(dcELISA)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)商業(yè)化的ELISA試劑盒提供技術(shù)支持。通過(guò)碳二亞胺法和戊二醛法分別制備了免疫原GM-KLH和包被原GM-OVA，經(jīng)動(dòng)物免疫后獲取的多克隆抗體與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)制備酶標(biāo)抗體GM-PAb-HRP。優(yōu)化確立了dcELISA最佳檢測(cè)條件：包被原質(zhì)量濃度0.2 μg/mL，GM-PAb-HRP稀釋度1/3 200，抗體反應(yīng)時(shí)間40 min，緩沖液為PBS(pH 8.0，10 mmol/L)。該方法的半抑制濃度(IC50)為0.99 μg/L，定量檢測(cè)線性范圍為0.27～3.64 μg/L。水產(chǎn)樣品加標(biāo)回收率為77.7%～104.5%，RSD為6.7%～13.2%，最低檢測(cè)限為2.0 μg/kg。該方法可用于水產(chǎn)品中慶大霉素殘留的快速測(cè)定，為食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供一種有效的技術(shù)手段。[中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2017,7(2):36-42]

慶大霉素；酶聯(lián)免疫吸附法；抗體；水產(chǎn)品；殘留；檢測(cè)

慶大霉素(gentamicin，GM)是畜牧水產(chǎn)行業(yè)中常用的一種氨基糖苷類抗生素(aminoglycosides，AGs)，常被添加到飼料中用于預(yù)防疾病和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，其主要作用于革蘭氏陰性菌，抗菌譜較廣，能效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖[1-3]。研究表明，GM代謝緩慢，長(zhǎng)期使用容易誘導(dǎo)致病菌對(duì)其耐藥性增強(qiáng)，且該物質(zhì)具有顯著的耳毒性和腎毒性作用，其在動(dòng)物源性食品中的殘留對(duì)消費(fèi)者的健康帶來(lái)潛在的嚴(yán)重危害[4-6]。目前，中國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定其在動(dòng)物性食品的不同組織中的最高殘留限量(MRL)范圍為100～5 000 μg/kg，牛奶中的MRL為200 μg/kg[7]，而歐盟委員會(huì)(EU)規(guī)定慶大霉素在動(dòng)物肌肉組織中和牛奶中的MRL分別為50和100 μg/kg[8]。

微生物抑制法是分析慶大霉素的傳統(tǒng)方法[9]，檢測(cè)成本低，但穩(wěn)定性較差，耗時(shí)長(zhǎng)[10]。GM易溶于水，極性大，比較適用于液相色譜分析[11-12]。由于其分子結(jié)構(gòu)中不含有共軛雙鍵，缺少發(fā)色基團(tuán)，僅具有較弱的末端吸收，為了提高檢測(cè)靈敏度和改善分析效果，常常在液相色譜柱前或柱后對(duì)其進(jìn)行衍生化，操作相對(duì)復(fù)雜[13-14]。而液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定GM時(shí)具有較高的靈敏度，且其分析結(jié)果專屬性強(qiáng)，可以避免復(fù)雜樣品基質(zhì)的干擾[15-17]?，F(xiàn)行國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法主要依據(jù)GB/T 21323—2007 動(dòng)物組織中氨基糖苷類藥物殘留量的測(cè)定高效液相色譜-質(zhì)譜質(zhì)譜法[18]，該方法針對(duì)動(dòng)物內(nèi)臟、肌肉和水產(chǎn)品中GM的檢測(cè)限為20 μg/kg，但其分離過(guò)程需采用離子對(duì)色譜模式，對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)器造成潛在的污染和離子抑制作用[19]。

近年來(lái)，中國(guó)農(nóng)業(yè)和食品藥品等相關(guān)行政監(jiān)管部門不斷加強(qiáng)獸藥抗生素殘留的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，逐步推進(jìn)快速篩查機(jī)制的建立[20-21]。而基于抗原抗體反應(yīng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)等快速免疫分析方法，擁有靈敏度好、特異性高、操作簡(jiǎn)便及檢測(cè)成本低等特點(diǎn)，已經(jīng)逐漸應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的高通量檢測(cè)[22-23]。Chen等[24]建立了ELISA用于測(cè)定豬肌肉、肝臟和腎臟中的GM，方法加標(biāo)回收率為64.7%～101.2%，最低檢測(cè)限為2.7～6.2 μg/kg。許耀心等[8]制備了慶大霉素多克隆抗體，ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線優(yōu)化后的IC50為2.954 ng/mL，該方法一抗和二抗反應(yīng)均需孵育1 h，沒(méi)有進(jìn)行實(shí)際樣品的加標(biāo)回收測(cè)定。相比于傳統(tǒng)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(dcELISA)反應(yīng)模式所需的步驟較少(加樣及酶標(biāo)抗體→孵育→洗板→顯色→終止)，大大縮短了樣品檢測(cè)工作的時(shí)間，更適用于水產(chǎn)品市場(chǎng)流通環(huán)節(jié)的快速篩查。目前，關(guān)于快速測(cè)定水產(chǎn)品中GM殘留量的dcELISA方法尚不成熟，本研究通過(guò)制備GM特異性酶標(biāo)抗體，優(yōu)化確定各反應(yīng)條件，建立快速、靈敏的測(cè)定水產(chǎn)品中慶大霉素殘留的dcELISA，為進(jìn)一步自主開(kāi)發(fā)快速、簡(jiǎn)便的ELISA試劑盒提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

VersaMax酶標(biāo)儀和MultiWash Ⅲ 洗板機(jī)(美國(guó)Molecular Devices公司)；Biofuge Stratos臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；MS3漩渦混合器(德國(guó)IKA公司)；電子天平(瑞士梅特勒公司)。

慶大霉素、卡那霉素、安普霉素、新霉素、鏈霉素、碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、弗氏完全與不完全佐劑均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；羊抗兔IgG-HRP抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；戊二醛(50%)購(gòu)于山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；辛酸、硫酸銨和過(guò)碘酸鈉(分析純)，均購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠。

鮮活水產(chǎn)品：草魚(Ctenopharyngodonidellus)、對(duì)蝦(Penaeusvannamei)、羅非魚(Oreochromisniloticus)和鯽(Carassiusauratus)，均購(gòu)于廣州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人工抗原制備及鑒定

免疫原GM-KLH：取20 mg GM溶于1.5 mL水中，攪拌加入30 mg EDC，室溫避光活化反應(yīng)2 h；取10 mg KLH溶解于1.5 mL生理鹽水(0.9% NaCl溶液)中，攪拌溶解后逐滴加入上述活化液，0～4 ℃下避光反應(yīng)過(guò)夜；反應(yīng)液經(jīng)3 d透析處理后獲得免疫原GM-KLH(圖1)，按照文獻(xiàn)[24]方法對(duì)人工抗原進(jìn)行鑒定，并將其分裝于0.5 mL離心管中，置于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

包被原GM-OVA：取20 mg GM和10 mg OVA溶于3 mL生理鹽水中，攪拌下將戊二醛水溶液(20 μL戊二醛于0.5 mL水)逐滴加入上述混合液，室溫下避光反應(yīng)4 h；同上，透析處理后獲得包被原GM-OVA(圖1)，鑒定及其他處理過(guò)程同GM-KLH。

圖1 人工抗原GM-KLH和GM-OVA的合成路線Fig.1 Synthesis route of artificial antigen GM-KLH and GM-OVA

1.2.2 酶標(biāo)抗體的制備

選取新西蘭大白兔進(jìn)行動(dòng)物免疫，實(shí)驗(yàn)前取陰性血清作為對(duì)照[25]。首次免疫將GM-KLH(500 μg，按KLH含量計(jì)算)與弗氏完全佐劑乳化混合后，對(duì)兔子背部多點(diǎn)注射。之后每次間隔3周用等體積弗氏不完全佐劑乳化相同劑量的GM-KLH加強(qiáng)免疫。至抗血清效價(jià)不再增長(zhǎng)后，心臟動(dòng)脈取血，室溫自然凝固分離抗血清，在4 ℃下放置過(guò)夜，4 000 r/min離心10 min后取上層血清，采用辛酸-硫酸銨法純化處理適量抗血清。

采用過(guò)碘酸鈉法[26]標(biāo)記HRP制備酶標(biāo)抗體。稱取4 mg HRP溶于400 μL醋酸鈉緩沖液(0.2 mol/L、pH 5.6)中，加入0.1 mol/L NaIO4溶液100 μL，4 ℃攪拌30 min，然后逐滴加入2.5%乙二醇400 μL，室溫?cái)嚢?0 min；繼續(xù)加入4 mg純化抗體，混合攪拌30 min后置于碳酸鹽緩沖液(0.1 mol/L、pH 9.6)中透析過(guò)夜；反應(yīng)液中加入400 μL硼氫化鈉溶液(5 mg/mL)，4 ℃攪拌反應(yīng)2 h后用PBS緩沖液(0.01 mol/L、pH 7.4)透析過(guò)夜；向反應(yīng)液中加入硫酸銨，使其終濃度為0.277 g/mL(飽和度為45%)，攪拌30 min，將所有反應(yīng)液的沉淀溶于500 μL PBS緩沖液，4 ℃透析過(guò)夜后，收集袋中剩余液體即為酶標(biāo)抗體GM-PAb-HRP，加入等體積的甘油后于-20 ℃分裝保存。

1.2.3 棋盤滴定法

用包被緩沖液(pH 9.6，100 mmol/L碳酸鹽緩沖液)將包被原GM-OVA倍比稀釋至1.0、0.5、0.2和0.1 μg/mL，每孔100 μL分別在酶標(biāo)板上進(jìn)行包被。dcELISA的操作過(guò)程參照文獻(xiàn)[26]所述，實(shí)驗(yàn)時(shí)用PBS緩沖液將酶標(biāo)抗體GM-PAb-HRP從1/200倍比稀釋至1/25 600，分別測(cè)定添加50 μL GM標(biāo)準(zhǔn)液(0.1 μg/mL)和50 μL PBS緩沖液(無(wú)藥物競(jìng)爭(zhēng))時(shí)的吸光度(A450)，比較不同包被濃度和抗體稀釋度下dcELISA的反應(yīng)抑制率。

1.2.4 檢測(cè)條件的優(yōu)化及特異性分析

稱取適量的氨基糖苷類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，分別用水溶解后制備成500 μg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液。實(shí)驗(yàn)時(shí)用PBS緩沖液稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行dcELISA檢測(cè)，通過(guò)OriginPro8.5軟件擬合，獲取不同反應(yīng)條件下競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的半抑制濃度(IC50)和酶標(biāo)儀450 nm處的最大吸光值(maximal absorbance,Amax)，優(yōu)化確定dcELISA最佳酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間，以及PBS緩沖液最適的pH和離子強(qiáng)度[27]。在同等的dcELISA條件下，通過(guò)計(jì)算慶大霉素與其他化合物IC50的比值的百分比，獲取的該研究的交叉反應(yīng)率(CR)，交叉反應(yīng)率越低，特異性越好。

1.2.5 樣品檢測(cè)

將草魚、羅非魚和鯽去鱗、去皮，取背脊兩側(cè)肌肉，對(duì)蝦去殼、去頭尾，取可食肌肉部分，切成小塊后用絞肉機(jī)制成肉糜狀[28]，試樣按照GB/T 21323—2007方法[18]測(cè)定后未檢出慶大霉素。準(zhǔn)確稱取試樣(2.00±0.02)g，置于50 mL塑料離心管中，分別添加5、10和30 μg/kg 3個(gè)水平的慶大霉素藥物標(biāo)準(zhǔn)液，每個(gè)濃度水平進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)。向每個(gè)樣品中加入10 mL 3%三氯乙酸溶液，均質(zhì)器勻漿處理約1 min，充分漩渦振蕩提取5 min，以4 000 r/min離心10 min。取2 mL上清液于一個(gè)新塑料離心管中，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4左右，進(jìn)一步用PBS緩沖液定容至10 mL，取50 μL直接用于dcELISA檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗體和包被原濃度的選擇

慶大霉素屬于有機(jī)小分子物質(zhì)(分子量小于1 000 Da)，本身不具有沒(méi)有免疫原性，只有將其與大分子載體(如蛋白質(zhì))偶聯(lián)制備成人工抗原，才能刺激動(dòng)物體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。本研究采用碳二亞胺法將GM與KLH偶聯(lián)，制備了免疫原GM-KLH，為降低免疫反應(yīng)非特異性吸附，采用戊二醛法將GM與分子量較小的OVA偶聯(lián)制備包被原GM-OVA。

獲取的抗血清純化處理后，經(jīng)過(guò)碘酸鈉法與HRP偶聯(lián)，制備了酶標(biāo)抗體GM-PAb-HRP。采用棋盤滴定法對(duì)包被原GM-OVA的濃度和GM-PAb-HRP的稀釋倍數(shù)進(jìn)行選擇，根據(jù)不同包被濃度和抗體稀釋倍數(shù)下dcELISA的A450值，測(cè)算抑制率。結(jié)果顯示(表1)，當(dāng)包被原濃度為0.2 μg/mL，酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)3 200時(shí)，此時(shí)dcELISA的A450值在1.2左右，且空白背景值較低，此時(shí)加入50 μL GM標(biāo)準(zhǔn)液(0.1 μg/mL)抑制率達(dá)85.3%，抗體特異性顯著，可以滿足進(jìn)一步的dcELISA優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2 免疫反應(yīng)時(shí)間的確定

抗原和抗體之間的結(jié)合屬于動(dòng)態(tài)可逆反應(yīng)，為獲取更高的檢測(cè)靈敏度，需要選擇酶標(biāo)抗體與抗原最佳的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間。將待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品和酶標(biāo)抗體溶液加入微孔板后，比較不同反應(yīng)時(shí)間下的標(biāo)準(zhǔn)曲線的Amax、IC50值以及其比值A(chǔ)max/IC50的變化。結(jié)果顯示(圖2)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加(20～40 min)，Amax逐漸升高，IC50值不斷下降；進(jìn)一步增加反應(yīng)時(shí)間至50 min，Amax趨于穩(wěn)定，IC50值不再降低；反應(yīng)時(shí)間為40 min時(shí)，曲線的Amax/IC50最大，本研究的抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間為40 min。

2.3 緩沖液pH對(duì)反應(yīng)的影響

反應(yīng)體系的pH可以影響待測(cè)藥物的溶解度，進(jìn)而影響抗原抗體之間的相互作用。配制不同pH(5.5～9.0)的PBS緩沖液作為藥物稀釋液，分別繪制dcELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示(圖3)，Amax隨著pH的增加不斷增大，pH>7后趨于穩(wěn)定。pH為8.0時(shí)顯示了最低的IC50值，且此時(shí)曲線的Amax/IC50最大，因此反應(yīng)緩沖體系的最佳pH為8.0。

表1 棋盤滴定實(shí)驗(yàn)的A450值Tab.1 A450 values of chessboard titration experiment

注：包被原A為50 μL PBS +50 μL GM-PAb-HRP，包被原B為50 μL 藥物標(biāo)準(zhǔn)液(0.1 μg·mL-1)+50 μL GM-PAb-HRP。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)dcELISA的影響Fig.2 The influence of reaction time on dcELISA

圖3 pH對(duì)dcELISA的影響Fig.3 The influence of pH on dcELISA

2.4 緩沖液離子強(qiáng)度的優(yōu)化

緩沖溶液的離子濃度通常會(huì)影響抗體和酶的活性，是建立免疫分析法的一個(gè)重要因素[29]。考察了不同離子濃度(5～40 mmol/L)的PBS緩沖液對(duì)所建立dcELISA靈敏度的影響，結(jié)果表明(圖4)，隨著離子濃度的增加，Amax不斷下降，IC50值先下降后升高。離子濃度為10 mmol/L時(shí)IC50值最低，曲線的Amax/IC50最大，此時(shí)Amax為1.239，顯示了最優(yōu)的檢測(cè)靈敏度。因此，緩沖液最優(yōu)離子強(qiáng)度為10 mmol/L。

圖4 離子濃度對(duì)dcELISA的影響Fig.4 The influence of ionic strength on dcELISA

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

基于上述最優(yōu)的反應(yīng)條件，本研究建立了慶大霉素dcELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)，其IC50為0.99 μg/L，線性檢測(cè)范圍(IC20～I(xiàn)C80)為0.27～3.64 μg/L，定量范圍相對(duì)較窄，對(duì)于高濃度樣品的測(cè)定需要做進(jìn)一步的稀釋處理，檢測(cè)時(shí)間可以控制在1 h以內(nèi)。該方法最低檢測(cè)限(LOD，IC10)為0.13 μg/L，低于GB/T 21323—2007所規(guī)定的液質(zhì)聯(lián)用法的檢測(cè)限，具有較高的檢測(cè)靈敏度。

圖5 慶大霉素dcELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線C為慶大霉素濃度,ug·L-1；B為添加藥物時(shí)的吸光值，B0不添加藥物時(shí)的吸光值。Fig.5 Standard curve of dcELISA for gentamicinThe C is gentamicin concentration,ug·L-1;B is the absorbance with analytes and B0 is the absorbance without analytes.

2.6 特異性分析

分別配制卡那霉素、安普霉素、新霉素和鏈霉素的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在同等條件下測(cè)定曲線的IC50值，計(jì)算交叉反應(yīng)率(CR)。結(jié)果顯示，該方法針對(duì)慶大霉素的特異性良好，與所考察的其他4種氨基糖苷類結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率均小于0.1%(表2)。

2.7 回收率和精密度

慶大霉素易與樣品中的組織成分結(jié)合，而魚蝦類水產(chǎn)品的可食肌肉組織中往往富含較多的蛋白質(zhì)，因此樣品提取時(shí)首先要除蛋白[19]。常用的蛋白質(zhì)沉淀

表2 慶大霉素及其結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率Tab.2 Cross-reactivity of gentamicin and its analogs

劑主要是有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)和強(qiáng)酸性溶液(三氯乙酸或高氯酸)。由于慶大霉素具有較高水溶性，在勻漿處理時(shí)使用強(qiáng)酸性溶液既可以除蛋白，同時(shí)可以促使目標(biāo)物慶大霉素從樣品組織中游離出來(lái)[30]。本研究選用3%三氯乙酸溶液作為提取溶劑，提取液調(diào)至中性并用PBS緩沖液稀釋處理后用于dcELISA測(cè)定，進(jìn)一步降低了樣品的基質(zhì)干擾。結(jié)果同時(shí)顯示，用PBS緩沖液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線校正檢測(cè)結(jié)果時(shí)，低濃度的樣品回收率偏高，可能是由于空白樣品的A450值略低于使用空白緩沖液時(shí)的A450值。為保證樣品的定量分析結(jié)果，分別使用相應(yīng)的樣品提取液配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行數(shù)據(jù)校正分析。結(jié)果如表3所示，4種水產(chǎn)品基質(zhì)的加標(biāo)回收率為77.7%～104.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為6.7%～13.2%，最低檢測(cè)限為2.0 μg/kg，表明該方法準(zhǔn)確度和精密度良好，滿足水產(chǎn)品中痕量慶大霉素藥物殘留檢測(cè)的要求。

表3 水產(chǎn)品慶大霉素的添加回收率Tab.3 Recoveries of spiked aquatic product of gentamicin n=5

3 結(jié)論

本研究分別采用采用碳二亞胺法和戊二醛法制備了慶大霉素的免疫原和包被原，抗血清純化處理后標(biāo)記辣根過(guò)氧化酶獲取酶標(biāo)抗體GM-PAb-HRP，優(yōu)化確定了dcELISA反應(yīng)條件。該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間少于1 h，與結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率小于0.1%。樣品經(jīng)三氯乙酸溶液除蛋白提取，進(jìn)一步緩沖液稀釋處理后消除基質(zhì)干擾，針對(duì)水產(chǎn)品中慶大霉素的最低檢測(cè)限為2.0 μg/kg，為快速測(cè)定水產(chǎn)品中殘留的慶大霉素提供一種有效的監(jiān)測(cè)技術(shù)手段。

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Development of a direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay forgentamicin in aquatic product

WANG Qiang, WANG Xufeng, ZHAO Donghao, HUANG Ke, GU Xiaoli, LI Liudong*

(South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture; Laboratory of Quality & Safety Risky Assessment for Aquatic Product on Storage and Preservation (Guangzhou); Fishery Environment and Aquatic Products Quality Inspection & Testing Center of the Ministry of Agriculture (Guangzhou)，Guangzhou 510300, China)

A direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (dcELISA) was developed for rapid determination of gentamicin in aquatic product, which exhibited the potential to develop commercial ELISA kits. The immunogen (GM-KLH) and coating antigen (GM-OVA) were synthesized by the method of carbodiimide and glutaraldehyde, respectively. Then, the polyclonal antibody obtained was coupled to horseradish peroxidase for enzyme-labeled antibody (GM-PAb-HRP). The optimized dcELISA conditions were as follows: the dilution ratio of GM-PAb-HRP, 1/3 200; coating antigen concentration, 0.2 μg/mL; reaction time of antibody, 40 min; dilution solution, PBS (pH 8.0, 10 mmol/L). The half inhibition concentration (IC50) was 0.99 μg/L and the linear range (IC20-IC80) was 0.27～3.64 μg/L. Recoveries from spiked aquatic products were in the range of 77.7%～104.5%, with relative standard deviation ranging from 6.7% to 13.2%. The limit of detection (LOD) of the dcELISA for gentamicin in aquatic products was 2.0 μg/kg. The developed method was suitable for rapid determination of gentamicin residues in aquatic product, which would be a useful tool in regular risk monitoring program for food safety. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(2):36-42]

gentamicin; ELISA; antibody; aquatic product; residue; determination

LI Liudong, 168LLd@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.02.007

2016-10-14；接收日期：2017-01-16

國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重大專項(xiàng)(GJFP201501003)；廣東省水產(chǎn)品質(zhì)量安全專項(xiàng)(GDSCZA2015009)；中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2015TS17，2015TS18)

王強(qiáng)(1988-)，男，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，546056407@qq.com 通信作者：李劉冬，研究員，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，168LLd@163.com

S94；O657.72

A

2095-1833(2017)02-0036-07