于雪慧,田童童,張 建

(石河子大學食品學院,新疆石河子 832003)

響應(yīng)面法優(yōu)化新疆奶花蕓豆α-淀粉酶抑制劑的提取工藝

于雪慧,田童童,張 建*

(石河子大學食品學院,新疆石河子 832003)

利用響應(yīng)面法研究新疆奶花蕓豆中α-淀粉酶(α-AI)抑制劑的提取工藝。在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選取浸提液體積、pH、浸提時間和浸提溫度作為考察因素,以α-AI抑制率作為評價指標,利用Box-Behnken中心組合方法設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面分析法,建立數(shù)學模型,從而確定最佳提取工藝為:準確稱取5 g樣品,添加浸提液體積200 mL,在pH3.5、43 ℃下浸提2.3 h,此條件下,α-AI的抑制率達到85.30%,與理論預(yù)測值(87.82%)基本相符。結(jié)果表明,優(yōu)化得到的提取工藝穩(wěn)定可行,為進一步研究和開發(fā)利用奶花蕓豆奠定了基礎(chǔ)。

奶花蕓豆,α-淀粉酶抑制劑,響應(yīng)面分析

α-淀粉酶抑制劑(α-Amylase Inhibitor,α-AI)是一種糖苷水解酶抑制劑[1],它主要通過抑制唾液及胰α-淀粉酶的活性,來阻礙人體所食用的淀粉及其它碳水化合物的消化和吸收,在不影響其他營養(yǎng)物質(zhì)吸收和代謝的同時,減少糖分的攝取,降低脂肪的合成,起到降糖、減肥的作用。天然的α-淀粉酶抑制劑主要存在于植物種子的胚乳中,目前己經(jīng)從小麥[2]、豆類[3-4]、野生莧屬[5]、綠茶[6]等植物中分離得到α-淀粉酶抑制劑,并且在國外己將其作為減肥保健食品進行應(yīng)用。

奶花蕓豆(Phaseolusvulgaris)屬豆科菜豆屬一年生草本植物,種皮呈乳白光亮,上有鮮紅色斑紋[7],在我國云、貴、川山區(qū)及東北、河北、新疆等地有較大面積種植。其中以新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第十師北屯市面積最大,現(xiàn)已發(fā)展成為新疆的特色豆類產(chǎn)品[8]。田童童[9]等人從奶花蕓豆中分離純化出了鐵蛋白;李慕春[10]等人利用雙波長分光光度法測定出奶花蕓豆的總黃酮含量為2.79 mg/g,且對奶花蕓豆發(fā)芽過程中抗氧化活性的變化進行了初步的探索[11];趙林同等人也采用ICP-OES法測定出每100 g蕓豆含蛋白質(zhì)23.1 g,脂肪1.3 g,碳水化合物56.9 g,鈣76 mg及豐富的B族維生素[12,13]。這種難得的高鉀、高鎂、低鈉食品[14],目前只是作為一種配料和輔助食品,精細加工產(chǎn)品少,附加值低,價格受市場供求變化大[15],不能保證種植農(nóng)戶穩(wěn)定的收益,而北屯市2013年奶花蕓豆的產(chǎn)量已達4909.61 t,如何充分利用奶花蕓豆提高其附加值,已成為奶花蕓豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展中亟待解決的問題。為此,本文主要從新疆奶花蕓豆中提取α-淀粉酶抑制劑,以期為奶花蕓豆新產(chǎn)品的研究、開發(fā)提供有益的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

奶花蕓豆(蕓豆2號) 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第十師農(nóng)業(yè)科學研究所提供;α-淀粉酶(3700 U/g) 北京奧博星生物技術(shù)有限公司,生物純;可溶性淀粉 天津市永晟精細化工有限公司,分析純;3,5-二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid,DNS) 上海藍季科技發(fā)展有限公司,分析純。

ZXRD-7080全自動新型鼓風干燥箱 上海智城分析儀器制造有限公司;RHP-600高速多功能粉碎機 浙江榮浩工貿(mào)有限公司;PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠;BL-206-II高速冷凍離心機 上海安亭科技儀器廠;UVmini-1240紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 奶花蕓豆中α-AI提取物的制備

1.2.1.1 奶花蕓豆粉的制備 將購買的奶花蕓豆篩選除雜,在室溫下浸泡12 h后去皮,在40 ℃烘箱中干燥后重復(fù)粉碎、過60目篩得到奶花蕓豆粉,裝袋保存至4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.1.2α-AI的提取方法 稱取5 g的樣品,加入一定量蒸餾水,恒溫下混合均勻后調(diào)節(jié)提取液的pH,于適當?shù)臏囟认滤〗嵋欢ǖ臅r間后,將提取液于10000 r/min、4 ℃的條件下離心15 min,上清液即為α-AI粗提液。用DNS比色法[16]測定其中α-AI的含量。

1.2.2 葡萄糖標準曲線的制作 取6支試管,按表1進行編號并加入試劑,混勻后沸水浴反應(yīng)5 min后,迅速流水冷卻,加入10 mL蒸餾水稀釋,以管1為空白對照,在535 nm下測各管的吸光值。

表1 標準曲線的制備

1.2.3 抑制率的測定α-淀粉酶液0.5 mL,加入等量的樣品提取液,在37 ℃下水浴保存10 min,加入2%淀粉溶液2 mL,37 ℃水浴保存5 min后,立即加入0.5 mL 40% NaOH溶液終止反應(yīng),再加入1 mL的DNS,沸水浴5 min,冷卻至室溫,在535 nm波長下測定吸光度。按照下列公式計算樣品提取液中α-AI的抑制百分率。

式中:A0為空白對照液的吸光度值;A1為含樣品溶液的吸光度值;A2為正常酶溶液反應(yīng)的吸光度值。

1.2.4α-淀粉酶抑制活力定義α-淀粉酶液0.5 mL,加入2 mL不同濃度的淀粉溶液,在37 ℃下水浴反應(yīng)10 min后立即加入0.5 mL 40% NaOH溶液終止反應(yīng),再加入1 mL的DNS,沸水浴5 min,冷卻至室溫,以蒸餾水為空白對照,在535 nm波長下測定吸光值。

抑制活力定義:在相同條件下,1 mL抑制液抑制α-淀粉酶消耗淀粉的量(mg),為一個單位抑制活力U。比活力U/mg(蛋白)定義為單位酶蛋白具有的酶活力單位。計算公式如下:

式中:A1為含樣品溶液的吸光度值;A2為正常酶溶液反應(yīng)的吸光度值;V為加入抑制劑的毫升數(shù);a為所得淀粉濃度標準曲線的截距。

1.2.5 單因素實驗設(shè)計

1.2.5.1 浸提液體積對α-AI抑制活力的影響 準確稱取5 g樣品,固定pH為4.0、浸提溫度為40 ℃、浸提時間3.0 h,研究浸提液體積為50、100、150、200、250、300 mL時α-AI的抑制率及比活力,重復(fù)3次實驗。

1.2.5.2 pH對α-AI抑制活力的影響 準確稱取5 g樣品,固定浸提液體積為200 mL、浸提溫度為40 ℃、浸提時間3.0 h,研究pH為2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0時α-AI的抑制率及比活力,重復(fù)3次實驗。

1.2.5.3 浸提時間對α-AI抑制活力的影響 準確稱取5 g樣品,固定浸提液體積為200 mL、pH為4.0、浸提溫度為40 ℃,研究浸提時間為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h時α-AI的抑制率及比活力,重復(fù)3次實驗。

1.2.5.4 浸提溫度對α-AI抑制活力的影響 準確稱取5 g樣品,固定浸提液體積為200 mL、pH為4.0、浸提時間3.0 h,研究浸提溫度為20、30、40、50、60、70 ℃時α-AI的抑制率及比活力,重復(fù)3次實驗。

1.2.6 響應(yīng)面實驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用Design-Expert軟件應(yīng)用響應(yīng)面分析法[17],選用Box-Behnken通過實驗數(shù)據(jù)擬合響應(yīng)面模型,以浸提液體積(A),浸提pH(B),浸提時間(C),浸提溫度(D)為主要影響因素,以α-淀粉酶抑制率(Y)為響應(yīng)值,選用Factors=4,Runs=29的中心組合設(shè)計,確定實驗運行順序,進行實驗并收集數(shù)據(jù),分析實驗數(shù)據(jù),優(yōu)化因素的設(shè)置水平,最終確定最佳提取條件。實驗因素水平見表2。

表2 響應(yīng)面實驗的因素水平表

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗中每個處理重復(fù)三次,采用Design-Expert軟件對數(shù)據(jù)進行分析,根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計實驗,并對結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析,應(yīng)用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNS比色法測定條件的確定

通過對DNS比色測定條件多次設(shè)計實驗研究,得出最佳DNS比色法測定條件為:檢測波長535 nm,添加1.0 mL顯色劑,沸水浴反應(yīng)5 min后檢測效果最佳。

2.2 葡萄糖標準曲線的制作

以葡萄糖標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,結(jié)果見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 The standard curve of glucose

由圖1可知,標準曲線回歸方程為y=0.4332x-0.0005,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9998,表明葡萄糖的質(zhì)量濃度與吸光度值在一定范圍內(nèi)0.6～3.0 mg/mL有良好的線性關(guān)系。

2.3 淀粉濃度標準曲線的制作

以淀粉濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標做標準曲線,如圖2所示。

圖2 淀粉濃度標準曲線Fig.2 The standard curve of starch concentration

由圖2可知,淀粉濃度標準曲線回歸方程為y=0.9136x-0.0096,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9996,表明淀粉的質(zhì)量濃度與吸光度值在一定范圍內(nèi)0.1～1.0 mg/mL有良好的線性關(guān)系。且得出截距a=0.9136,比活力計算公式即為:

2.4 單因素實驗結(jié)果與分析

2.4.1 不同浸提液體積對α-AI抑制活力的影響 從圖3可以看出,隨著浸提液體積不斷的增大,α-AI抑制率和比活力不斷增加,因為在低的固液比環(huán)境下,料液體系分散不均勻,不利于樣品的充分溶解,所以此時α-AI提取率較低,進而導(dǎo)致反應(yīng)檢測的抑制率較低;當浸提液體積增加到200mL以后,抑制活力不再有明顯的變化,此時表明α-AI有效成分基本浸出。在實際生產(chǎn)過程中,對于浸提法,溶劑的用量至關(guān)重要。用量過少會導(dǎo)致浪費,且提取率低;用量過大不利于后期的濃縮純化,綜上所述,選取200mL浸提液體積為最佳。

圖3 浸提液體積對α-AI抑制活力的影響Fig.3 Effect of soaking liquid volume on the inhibition activity of α-AI

2.4.2 不同pH對α-AI抑制活力的影響 從圖4可以看出,當pH小于3.0時,隨著pH的增加,α-AI抑制率及比活力明顯上升;當pH在3～4時,隨pH增加α-AI抑制率及比活力略有上升，但當pH大于4.0時,α-AI抑制率及比活力有所下降。選用酸性溶液更容易使蛋白充分溶出,并且在酸性溶液浸提時樣品澄清而透明,能除掉較多的雜蛋白。而在堿性條件下浸提時,溶液呈現(xiàn)黃色不透明狀,同時當堿性過強時,容易發(fā)生α-AI抑制劑發(fā)生脫氨、脫羧等情況,引起胱賴反應(yīng)而產(chǎn)生有毒物質(zhì),同時還會產(chǎn)生異味,造成α-AI抑制劑的損失,故選取pH=4.0為最適浸提pH。

圖4 pH對α-AI抑制活力的影響Fig.4 Effect of pH on the inhibition activity of α-AI

2.4.3 不同浸提時間對α-AI抑制活力的影響 由圖5可以看出,浸提時間從0.5 h到2.0 h,抑制率及比活力明顯上升,從2.0 h到5.0 h上升效果不明顯,說明在2.0 h時,活性成分在細胞內(nèi)外的濃度已達到平衡,從生產(chǎn)周期以及實驗室設(shè)備考慮,應(yīng)該降低提取成本,減少時間,故選取2 h為最佳浸提時間。

圖5 浸提時間對α-AI抑制活力的影響Fig.5 Effect of extraction time on the inhibition activity of α-AI

2.4.4 不同浸提溫度對α-AI抑制活力的影響 由圖6可以得出,當溫度在20～40 ℃之間時,浸提效果明顯增高,40 ℃時抑制效果最好;而從40～70 ℃,抑制率及比活力有所下降,但下降幅度不大且仍然具有較高活性,這說明此抑制劑在高溫條件沒有發(fā)生變性,具有較好的熱耐受性[2],從圖6中可看出,適度的增加提取液的溫度可以提高浸提效果,故本實驗選取40 ℃為最佳浸提溫度。

圖6 浸提溫度對α-AI抑制活力的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on the inhibition activity of α-AI

2.5 響應(yīng)面分析實驗結(jié)果與分析

2.5.1 響應(yīng)面分析實驗設(shè)計方案 以浸提液體積(A)、pH(B)、浸提時間(C)、浸提溫度(D)為主要影響因素,抑制率(Y)為響應(yīng)值,進行響應(yīng)面分析。響應(yīng)面實驗設(shè)計因素水平表2,中心組合設(shè)計實驗及結(jié)果見表3,回歸方程方差分析結(jié)果如表4。

表3 中心組合設(shè)計實驗及結(jié)果

2.5.2 回歸方程的建立與檢驗 運用Design-Expert數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件對表3實驗結(jié)果進行多元回歸擬合,擬合所得奶花蕓豆α-淀粉酶抑制率(Y)的多元二次回歸方程如下:

Y=+94.54-0.69A+3.07B+3.60C+0.40D+2.37AB+0.75AC+1.75AD-2.97BC-0.79BD-0.43CD-6.81A2-5.34B2-4.57C2-2.10D2對該回歸模型及其系數(shù)進行顯著性檢驗,結(jié)果見表4。

表4 回歸方程方差分析結(jié)果

注:“*”表示影響顯著(p<0.05),“**”表示影響極顯著(p<0.01)。

2.5.3 響應(yīng)面分析法分析各因素間的相互作用結(jié)果 奶花蕓豆α-淀粉酶抑制劑提取回歸優(yōu)化響應(yīng)曲面如圖7所示。由圖7可知,浸提液體積、pH、浸提溫度和浸提時間四個因素之間兩兩相互作用對奶花蕓豆α-淀粉酶抑制劑的含量均呈現(xiàn)出顯著的二次效應(yīng)。結(jié)合方差分析表4中浸提液體積、浸提溫度和浸提時間三個因素二次項的p值均小于0.01,表明各個因素之間的交互作用極顯著。從圖7c中可以看出浸提液體積與浸提溫度對α-AI抑制率的影響較明顯,三維空間所繪的曲面較陡,說明浸提液體積與浸提溫度的交互影響尤為顯著,浸提時間與浸提溫度的交互影響僅次于浸提液體積與浸提溫度,如圖7f所示。由圖7e及方差分析表4可知pH與浸提溫度之間的交互影響顯著。由圖7a、圖7b和圖7d可知,浸提液體積與pH、浸提液體積與浸提時間及及pH與浸提時間之間的交互影響作用較小。

圖7 奶花蕓豆α-淀粉酶抑制劑提取響應(yīng)曲面圖Fig.7 The response surface on extraction alpha-amylase inhibitor of phaseolus vulgaris

2.5.4 最優(yōu)條件的確定及驗證 利用Design-Expert軟件對模型進行進一步分析,獲得最優(yōu)的提取條件:浸提液體積196.44 mL,pH3.5,浸提時間2.31 h,浸提溫度42.97 ℃。在此條件下奶花蕓豆中α-AI抑制率的理論預(yù)測值為87.82%。

在最佳的提取條件下在實驗室進行驗證實驗控制浸提液體積為200 mL,pH為3.5,浸提時間2.3 h。浸提溫度43 ℃,樣品質(zhì)量為5 g。在此條件下進行三次重復(fù)實驗,奶花蕓豆中α-AI的抑制率達到85.30%,比活力為5.13 U/mg,與理論抑制率相差2.87%。由此可見,響應(yīng)面分析的的優(yōu)化結(jié)果與實際值較吻合,得到的提取工藝條件具有一定的應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

實驗結(jié)果得到新疆奶花蕓豆中α-AI的最優(yōu)提取條件為:準確稱取5 g樣品,添加浸提液體積200 mL,pH3.5,浸提時間2.3 h,浸提溫度43 ℃。在此條件下奶花蕓豆中α-AI的抑制率為85.30%,比活力為5.13 U/mg。從本文的測定結(jié)果可知,來源于奶花蕓豆的α-AI對α-淀粉酶有很好的抑制作用,對奶花蕓豆的研究、開發(fā)提供有益的數(shù)據(jù)。

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Optimization of extraction of alpha-amylase inhibitor fromPhaseolusvulgarisby response surface methodology

YU Xue-hui,TIAN Tong-tong,ZHANG Jian*

(Food College of Shihezi University,Shihezi 832003,China)

Response surface methodology was applied to optimize the extraction conditions of alpha-amylase inhibitor fromPhaseolusvulgaris. Based on the results of the single factor experiments,the effects of four independent variables(volume of extraction solvent,extraction pH value,extraction time and extraction temperature)on theα-AI inhibition rate were investigated by Box-Behnken experimental design of four factors and three levels. A quadratic polynomial regression equation of the forecasting model was set up. And the optimal extraction parameters to obtain the highest inhibition rate were as follows:the solvent volume was 200 mL,pH3.5,43 ℃ and 2.3 h for extraction per time. The inhibition rate under the optimum conditions was found to be 85.30%,which agreed with the predicted value of 87.82%. Results showed that the optimized method was stable and reliable. It could lay the foundation for the research,development of thePhaseolusvulgaris.

Phaseolusvulgaris;α-amylase inhibitor;response surface method

2016-08-29

于雪慧(1993-)，女，碩士研究生，主要從事食品生物化學方面的研究，E-mail：417950977@qq.com。

*通訊作者:張建(1979-)，男，博士，副教授，主要從事食品生物化學方面的研究，E-mail:zhangjian0411@163.com。

TS239

A

1002-0306(2017)06-0223-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.034