閻春蘭, 李 娜, 敖偲成, 高 斯, 張蕓夢

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074)

啤酒廠廢水處理活性污泥中一株細(xì)菌的分離與鑒定

閻春蘭, 李 娜, 敖偲成, 高 斯, 張蕓夢

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074)

從某啤酒廠廢水的活性污泥中分離純化了一株微生物菌株Z-1，分析了該菌株的16S rDNA基因序列及形態(tài)特征，測定了該菌株的生長曲線、對(duì)抗生素的耐藥性及該菌株的曝氣池污水氮、磷含量.結(jié)果表明：該微生物為芽孢桿菌屬細(xì)菌 (Bacillus)，生長較快，對(duì)抗生素的耐藥性弱，對(duì)廢水中N、P去除較多，為篩選活性污泥法處理啤酒廢水的高效菌株奠定基礎(chǔ).

啤酒廠廢水，活性污泥，16S rDNA；生長曲線；耐藥性

啤酒的糖化、發(fā)酵和灌裝等工藝流程中會(huì)產(chǎn)生大量廢水，其中糖化和發(fā)酵工藝流程的廢水屬于高濃度廢水，化學(xué)需氧量高，約占總廢水量的30%；而灌裝工藝流程廢水屬于低濃度廢水[1].啤酒廢水中糖類、醇類等有機(jī)物含量較高，雖然無毒但易腐敗，直接排放會(huì)導(dǎo)致水體中溶解氧的大量消耗，進(jìn)而惡化環(huán)境.目前我國處理啤酒廢水多采用好氧生物法，常用的有活性污泥法、生物膜法、新型深井曝氣法和膜生物處理法等[2].

本文以湖北省某雪花啤酒廠廢水處理的曝氣池中的活性污泥為研究材料，分離與純化了一株好氧性微生物，利用16S rDNA對(duì)該微生物進(jìn)行物種鑒定，測定了該微生物的生長曲線，各種抗生素的耐藥性，以及曝氣池污水中的氮、磷含量，為篩選活性污泥法處理啤酒廢水的高效菌株奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

實(shí)驗(yàn)廢水來自于湖北省某雪花啤酒廠中廢水處理的活性污泥曝氣池.培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，水1000 mL，pH 7.4～7.6)；16S rDNA基因的克隆按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，其中pMD18-T載體、Taq聚合酶購自Takara公司，T4 DNA連接酶購自MBI生物公司；北京三博遠(yuǎn)志公司完成16S rDNA的基因測序.PCR儀(T-personal 48, Biometra公司).

1.2 微生物的分離與鑒定

采用稀釋涂布平板法分離啤酒廢水中的微生物，對(duì)單菌落利用平板劃線進(jìn)行純化.提取純化菌體的基因組DNA，PCR擴(kuò)增16S rDNA序列，引物和PCR程序見文獻(xiàn)[3].電泳回收PCR產(chǎn)物，與T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，獲得的陽性轉(zhuǎn)化子測序，測得該菌株的16S rDNA序列.調(diào)取GenBank數(shù)據(jù)庫中代表性菌株的16S rDNA 序列，利用Blast軟件與該菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比較分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.采用Mega 2.0程序?qū)ο到y(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分析.

1.3 細(xì)菌的生長特性

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的菌液1.5 mL接種到30 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)，分別在0，4，8，12，16，20，24，36 h 取樣，測定OD600值，并根據(jù)OD600值來繪制生長曲線.

1.4 細(xì)菌抗生素耐藥性特征

采用卡那霉素(Km)、氨芐青霉素(Ap)、壯觀霉素(Sp)、鏈霉素(St)、四環(huán)素(Tc)、氯霉素(Cm)、慶大霉素(Gm)等共7種常用的抗生素測定細(xì)菌耐藥性.將不同濃度的抗生素加入到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，制成不同的抗生素平板；將待測菌株接種到抗生素平板，37℃培養(yǎng)48 h后檢查菌株的生長情況.

1.5 廢水中的氮、磷含量的測定

廢水中氮含量和磷含量的測定，采用國家環(huán)保局標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測定[4].

2 結(jié)果及分析

2.1 菌株形態(tài)特征與鑒定

經(jīng)分離純化后得到一個(gè)純培養(yǎng)菌株，命名為Z-1.在平板上菌落圓形，邊緣整齊，微隆起；鏡檢結(jié)果為兩端鈍圓的短桿菌，革蘭氏陰性.同源性比較16S rDNA序列，發(fā)現(xiàn)Z-1菌株與Bacillus屬的多株細(xì)菌均具有99%以上的序列相似性.

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

構(gòu)建了菌株Z-1的系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示.從圖1中可見，從GenBank中搜索得到的與Z-1同源性在99%以上的15個(gè)菌株中，Z-1與多種Bacillus屬的微生物親緣關(guān)系很近，根據(jù)Z-1菌株的形態(tài)、革蘭氏染色結(jié)果和16S rDNA序列的分析結(jié)果，可將Z-1菌株歸屬于芽孢桿菌屬 (Bacillus)，按照Bergey分類系統(tǒng)，Z-1菌株在系統(tǒng)發(fā)育上的地位為：細(xì)菌界Bacteria、厚壁菌門Firmicutes、芽孢桿菌綱Bacilli、芽孢桿菌目Bacillales、芽孢桿菌科Bacillaceae、芽孢桿菌屬Bacillus.

圖1 菌株 Z-1的16S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 The phylogenetic analysis of the strain Z-1 based on 16S rDNA sequence

2.3 Z-1菌株的生長特性

菌株Z-1生長曲線的測定結(jié)果如圖2所示.由圖2中可見，菌株在4～16 h之間生長迅速，約20 h進(jìn)入平臺(tái)期，之后細(xì)胞數(shù)量不變，維持在平臺(tái)期.

圖2 菌株Z-1的生長特性Fig.2 The growth charactertics of strain Z-1

2.4 菌株Z-1的抗藥性測定結(jié)果

菌株Z-1對(duì)多種抗生素的抗藥性結(jié)果如表1所示.由表1可見：Km20、Ap20、Gm5、Tc2和St50 均對(duì)菌株Z-1有很好的抑制作用．即終濃度為20 μg/mL Km、20 μg/mL Ap、5 μg/mL Gm、2 μg/mL Tc和50 μg/mL St均能抑制該菌株的生長.而10 μg/mL Sp也能部分抑制 Z-1的生長，其他如2 μg/mL Cm無抑制作用.

表1 菌株Z-1的抗生素抗性Tab.1 The antibiotic resistance of strain Z-1

注：-代表菌種不能生長，+ 代表菌種可以生長

2.5 曝氣池中氮、磷含量的測定

鑒于Z-1菌株較快的生長，對(duì)多種抗生素不耐受，測定該菌株的曝氣池污水氮、磷含量，以檢測該菌株對(duì)氮磷的去除效果，結(jié)果如表2所示.啤酒廠廢水屬于中濃度有機(jī)廢水，總氮含量在30～70 mg/L，總磷含量在6～20 mg/L[5].

由表2可見，經(jīng)前期的厭氧處理、好氧性活性污泥處理之后，廢水中的總氮 (TN)、總磷 (TP) 含量下降很多，但仍屬于富營養(yǎng)化水體.

表2 啤酒廠曝氣池中氮、磷的含量

Tab.2 Content of nitrogen and phosphorus content of brewery wastewater

氮磷含量測量值ρ/(mg·L-1)SRP4.88±0.19TDP5.16±0.20TP5.30±0.38DN35.94±3.36TN35.99±2.88

注：SRP為可溶性磷(不經(jīng)消解測得)；TDP為可溶性磷； TP為總磷；TDN為可溶性總氮；TN為總氮

3 討論

活性污泥法是目前處理好氧生物處理工業(yè)廢水的常用方法，微生物是活性污泥的主要組成部分，包括細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、后生動(dòng)物等多種微生物群體，其中細(xì)菌在活性污泥組成和凈化功能中起中心作用[6].污水中有機(jī)物的性質(zhì)決定細(xì)菌的種屬優(yōu)勢，如含蛋白質(zhì)的污水有利于產(chǎn)堿桿菌屬和芽孢桿菌屬細(xì)菌的生長，而糖類污水或烴類污水中則以假單孢菌屬細(xì)菌為主.

研究發(fā)現(xiàn)不同種類的芽孢桿菌屬細(xì)菌在各類污水處理中起重要作用.枯草芽孢桿菌對(duì)電鍍廢水中鎘的吸附達(dá)93%以上[7]、對(duì)含銅廢水的去除率為16.27%[8]；可用于處理造紙黑液，使其色度和COD下降[9]等；枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中硝態(tài)氮的去除率分別為99.28%和99.51%[10]；利用其產(chǎn)生的γ-聚谷氨酸絮凝劑來處理含鉻廢水，在最佳工藝條件下對(duì)鉻的去除率可達(dá)55%[11]等；最近又從制革廢水中分離得到一株對(duì)多種重金屬均有較高耐受的芽孢桿菌屬細(xì)菌[12].芽孢桿菌屬細(xì)菌也可以和其他微生物一起來處理各類廢水，如與鹽單胞菌一起處理造紙廢水；蠟狀芽孢桿菌和膜璞畢赤酵母可一起循環(huán)利用制酒廢水作為替代培養(yǎng)基產(chǎn)生復(fù)合型微生物絮凝劑，達(dá)到以廢治廢的目的[13].

本文從某啤酒廠廢水處理的活性污泥中分離得到一株細(xì)菌Z-1，根據(jù)Z-1菌株的形態(tài)特征和rDNA序列結(jié)果可將該菌株歸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus).該菌株生長較快，對(duì)抗生素的耐藥性弱，多種抗生素均能抑制其生長，對(duì)環(huán)境友好，即使釋放到環(huán)境也不會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生威脅；對(duì)廢水中N、P去除較多，但處理后廢水中N、P 含量偏高，可為該菌株在凈化啤酒廠廢水中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ).

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Isolation and Identification of A Microorganism from the Active Sludge in Brewery Wastewater

YanChunlan,LiNa,AoSicheng,GaoSi,ZhangYunmeng

(College of Life Sciences，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China)

A strain Z-1 was isolated and purified from the active sludge in brewery wastewater．16S rDNA gene sequence and the morphological characteristics of Z-1were analyzed.The growth curve, antibiotic resistance, N and P content in the aeration tank sewage from the strain were also examined.The results showed that this strain belong toBacillus．It growed fast and was weakly resistant to antibiotic,with efficient removal of N and P in wastewater.The results may provide the basis for subsequent selection of highly efficient microorganism to treat brewery wastewater with activated sludge process.

brewery wastewater;active sludge;16S rDNA;growth curve;antibiotic resistance

2015-12-13

閻春蘭(1977-)，女，副教授，研究方向：微生物分子遺傳學(xué)與生理學(xué)，E-mail:yanchunlan@mail.scuec.edu.cn

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(CZY13011)，中南民族大學(xué)學(xué)生科研基金項(xiàng)目(YCX15026)

TQ920;R282.71

A

1672-4321(2017)01-0021-03