洪宗國(guó), 鐘阿琴, 陳 思, 宋庭寧, 趙 丹

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院,武漢 430074)

槲皮素納米膠囊制備研究

洪宗國(guó), 鐘阿琴, 陳 思, 宋庭寧, 趙 丹

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院,武漢 430074)

目的：制備槲皮素納米膠囊，研究其正交設(shè)計(jì)優(yōu)化合成條件、形貌與體外釋放作用。方法：以槲皮素為囊芯材料，明膠為囊壁材料，通過(guò)初生態(tài)微晶法制備槲皮素納米膠囊，用動(dòng)態(tài)散射儀和透射電子顯微鏡觀察納米膠囊的形貌，用紫外-分光光度法測(cè)定其緩釋性能。結(jié)果：最佳條件為明膠0.2 g，槲皮素4 mg，甲醛1 mL，成囊攪拌時(shí)間30 min。粒徑分布在100 nm左右，在pH 9.0時(shí)具有顯著的緩釋作用。意義：槲皮素納米膠囊可提高藥物的水溶性與生物利用度，并可控制藥物的釋放，適合多途徑給藥。

槲皮素納米膠囊；初生態(tài)微晶法；緩釋作用

槲皮素是一種天然的黃酮類(lèi)化合物，廣泛分布于植物的花、葉、果實(shí)之中，具有抗癌、抗自由基、抗貧血、抗炎、抗過(guò)敏等多種生物活性及藥理作用[1,2].近年來(lái)槲皮素對(duì)腫瘤的化學(xué)預(yù)防和治療作用格外引人矚目，其可以全面地作用于癌發(fā)生的始發(fā)、促癌和演進(jìn)3個(gè)階段，兼有抗致癌、抗促癌和誘導(dǎo)分化的作用，國(guó)外已將其作為抗癌藥物應(yīng)用于臨床[3].槲皮素溶于熱乙醇(1∶23)、冷乙醇(1∶300)，可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶等，不溶于石油醚、苯、乙醚、氯仿，幾乎不溶于水[4].因此，提高槲皮素在水中的溶解度，提高生物利用度，拓展給藥途徑是槲皮素應(yīng)用中亟待解決的問(wèn)題.本工作擬將槲皮素制成納米膠囊，以解決上述問(wèn)題.槲皮素分子式為C15H10O7，結(jié)構(gòu)式如圖1所示.

圖1 槲皮素的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of quercetin

實(shí)驗(yàn)采用初生態(tài)微晶法[5]制備槲皮素納米膠囊，該方法是由洪宗國(guó)教授發(fā)明的制備納米膠囊的方法.將天然高分子材料明膠作為壁材，利用藥物在不同溶劑中溶解度不同，將槲皮素包裹于其中，制成納米級(jí)的微膠囊.該體系的生物相容性好，可提高生物利用度，利于多途徑給藥[6-11].圖2為納米囊制備過(guò)程示意圖.

圖2. 初生態(tài)微晶法制備槲皮素納米囊的示意圖Fig.2 Diagram of QT-nanocapsules prepared by firstborn microcrystallization method

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

槲皮素(含量98.00%，阿拉丁公司)，明膠、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，所有試劑均為分析純.冰醋酸(分析純，武漢市聯(lián)堿廠)，超純水(電導(dǎo)率18.2 MΩ.cm)

電子天平(BS110S型，北京賽多利斯公司)，磁力恒溫?cái)嚢杵?85-2型，上海司樂(lè)儀器廠)，智能集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S型，河南省予華儀器有限公司)，精密pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，傅里葉變換近紅外光譜儀(Antaris Ⅱ，美國(guó)Thermo Nicolet公司)，高速離心機(jī)(TGI-20M型，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司)，紫外可見(jiàn)分光光度儀(PAMADA公司)，動(dòng)靜態(tài)激光散射儀(BI-200SM，美國(guó)布魯克海文)，透射電子顯微鏡(TECNAI G2 20 S-Twin型，捷克FEI公司).

1.2 初生態(tài)微晶法制備槲皮素納米囊

采用初生態(tài)微晶法制備納米膠囊.將2.00 g明膠溶于100 mL純化水中，在40 ℃下溶脹12 h形成膠狀體，得到明膠質(zhì)量濃度為20 mg/mL，真空抽濾除去雜質(zhì)備用，稱(chēng)取固體粉末狀槲皮素4.00 mg溶于5.00 mL無(wú)水乙醇溶液中，超聲使其完全溶解.取已制備的明膠溶液10.00 mL，置于40 ℃恒溫水浴中攪拌加熱，將槲皮素?zé)o水乙醇溶液緩慢勻速滴加至其中，攪拌至完全混勻，加入適量醋酸溶液調(diào)節(jié)pH值為4，冷卻至室溫，在冰浴條件下加入1.0 mL甲醛，控制溫度在0～5 ℃，繼續(xù)攪拌30 min，使槲皮素納米囊囊膜固化得到能穩(wěn)定存在的納米囊.

1.3 槲皮素納米囊的后處理

取上述制成的槲皮素納米囊溶液，4 ℃，12000 r/min離心20 min，收集上層溶液，在-20 ℃冷凍干燥得到納米囊干粉.

1.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

選用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，方案見(jiàn)表1.依照4因素3水平共進(jìn)行9組試驗(yàn)，其中每次試驗(yàn)各取槲皮素?zé)o水乙醇溶液5 mL(0.8 mg/mL)，即槲皮素4 mg.再將各處方樣品經(jīng)冷凍干燥成凍干粉劑后，以?xún)龈煞蹌┑纳珴?、外觀和再分散性為指標(biāo)，考察得出最佳實(shí)驗(yàn)條件.

表1 試驗(yàn)的因素和水平Tab.1 Test factors and levels

注：假定上述因素間無(wú)交互作用

1.5 納米膠囊物化指標(biāo)的測(cè)定

1.5.1 納米膠囊的平均粒徑測(cè)定

取納米膠囊溶液適量加入檢測(cè)瓶中，放入動(dòng)態(tài)光散射儀中進(jìn)行測(cè)量，波長(zhǎng)為532 nm，測(cè)定溫度為25 ℃.

1.5.2 透射電鏡掃描分析

用毛細(xì)管取適量納米槲皮素膠囊樣品，滴加至銅網(wǎng)上，晾干后滴加1% 磷鎢酸于銅網(wǎng)上，晾干后置于透射電鏡下進(jìn)行掃描分析，觀察成像.

1.5.3 納米膠囊的紅外光譜圖

取槲皮素和槲皮素納米膠囊凍干樣，加入高純氯化鉀粉末進(jìn)行充分研磨，用壓片機(jī)壓成透明片狀，置于傅立葉變換紅外光譜儀上，掃描波數(shù)在4000～500 cm-1范圍內(nèi).

1.5.4 紫外分光光度法測(cè)定藥物體外釋放能力

依據(jù)《中國(guó)藥典》[12]配制pH值分別為5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0的磷酸緩沖液，用精密pH計(jì)測(cè)定，若有偏差，用HCl和NaOH校正至所需數(shù)值.將已制備的納米膠囊溶液在不同的pH緩沖液中離心取上清液，利用紫外分光光度法考察槲皮素納米膠囊的體外釋放能力[13].

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳條件的確認(rèn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.由表2可知，實(shí)驗(yàn)最佳條件為明膠0.2 g，槲皮素4 mg，甲醛1 mL，攪拌時(shí)間30 min，攪拌過(guò)程控溫40 ℃左右，冷卻溫度0～5 ℃，對(duì)包裹和團(tuán)聚影響最大的因素是明膠用量，其次是甲醛用量，再次是攪拌時(shí)間，最后是pH調(diào)節(jié).

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Tab.2 The orthogonal experiment results

2.2 槲皮素納米囊的平均粒徑

將最佳條件制備得到的槲皮素納米膠囊水溶液進(jìn)行粒徑的檢測(cè)，從圖3中可看出，槲皮素納米囊的平均粒徑為100 nm，粒徑大小在納米范圍內(nèi)，且顆粒分布均勻.

圖3 槲皮素納米囊粒徑分布圖Fig.3 Particle size distribution of QT-nanoparticles

2.3 透射電鏡掃描結(jié)果

槲皮素納米囊的透射電鏡掃描形態(tài)圖和掃描局部圖見(jiàn)圖4.電鏡圖片顯示該納米囊囊壁顏色較淺而中心顏色較深，這足以證明該納米粒子即為囊泡結(jié)構(gòu)，在圖中也可以看出納米囊的粒徑在100 nm左右，與動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定的該納米囊的粒徑相近.

a) 形態(tài)圖;b) 局部圖

2.4 槲皮素納米囊的紅外光譜

分別對(duì)槲皮素和槲皮素納米囊進(jìn)行紅外光譜分析，從圖5中可以看出槲皮素與文獻(xiàn)中典型的結(jié)構(gòu)特征一致：在3200～3400 cm-1附近是O-H的伸縮振動(dòng)，1644 cm-1處是C=O的伸縮振動(dòng)，在1612 cm-1處是C=C的伸縮振動(dòng)，在1261 cm-1處是C-O-C的伸縮振動(dòng).通過(guò)比較槲皮素與槲皮素納米囊可以看出，槲皮素的特征峰在槲皮素納米囊的紅外圖譜中接近消失，這意味著槲皮素被壁材明膠包埋.

圖5 槲皮素與槲皮素納米囊的紅外光譜圖Fig.5 FTIR spectra of QT and QT-nanocapsules

2.5 槲皮素納米膠囊的體外釋放能力

2.5.1 槲皮素的UV-Vis吸收光譜

槲皮素在磷酸緩沖液中的吸收光譜，如圖6可以看出槲皮素在272 nm和381 nm處有吸收，據(jù)此可以選定381 nm左右作為測(cè)定槲皮素濃度的紫外吸收波長(zhǎng).

圖6 槲皮素的紫外-可見(jiàn)吸收?qǐng)D譜Fig.6 UV-Vis absorption spectra of QT

2.5.2 不同時(shí)間不同pH緩沖液對(duì)槲皮素納米膠囊體外釋放的影響

利用紫外分光光度法考察槲皮素納米囊的體外釋放能力，圖7為pH在6.0～10.0之間時(shí)槲皮素納米囊水溶液在波長(zhǎng)為381 nm處吸光度在1～5 h之內(nèi)的變化，結(jié)果表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，納米囊不斷釋放，pH值為5.0,6.0,7.0,8.0,10.0時(shí)1 h后趨向平穩(wěn)，不再釋放，而pH值為9時(shí)到2 h才趨向穩(wěn)定.由圖8可知，當(dāng)槲皮素納米膠囊與緩沖液作用2 h時(shí)吸光度的變化，結(jié)果表明在此區(qū)間，吸光度隨pH值升高而增加，在pH值為7以后有一明顯抬升，到pH值為9以后再趨向平穩(wěn)，說(shuō)明弱堿性條件有利于納米囊的破囊釋放.圖9表明槲皮素納米囊在pH 9.0時(shí)的緩釋作用，0～2 h階段加速釋放，2 h后穩(wěn)定.圖10為不同pH時(shí)槲皮素納米囊水溶液在釋放2 h后的UV-Vis光譜圖.人體內(nèi)血液的正常pH為7.41±0.024[14]，在此pH條件下，槲皮素在水溶液中能加速破囊釋放.

圖7 槲皮素納米囊吸光度在不同pH緩沖液隨著時(shí)間變化Fig.7 Abs change of QT-nanoparticles in different pH buffers with time

圖8 槲皮素納米囊在2 h時(shí)不同pH的吸光度變化Fig.8 Abs change of QT-nanoparticles at different pH values at 2 h

圖9 pH 9.0時(shí)槲皮素納米囊的變化Fig.9 The change of QT-nanocapsules at pH 9.0

圖10 不同pH值槲皮素納米囊的UV-Vis光譜Fig.10 UV-Vis spectra of QT-nanocapsules at different pH

3 結(jié)語(yǔ)

制成納米膠囊可提高藥物的水溶性與生物利用度，并可控制藥物的釋放，適合多種途徑給藥.采用初生態(tài)微晶法制備出納米槲皮素膠囊，最佳條件為明膠0.2 g，槲皮素4 mg，甲醛1 mL，攪拌時(shí)間30 min，攪拌過(guò)程控溫40 ℃左右，冷卻溫度0～5 ℃.檢測(cè)的產(chǎn)品表面光滑，形態(tài)圓整，分布均勻，平均囊徑在100 nm左右.通過(guò)對(duì)不同時(shí)間，不同pH槲皮素納米膠囊的體外釋放能力的考察分析，在堿性條件pH值9.0時(shí)緩釋效果較為顯著.

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Preparation of Quercetin Nanocapsules

HongZongguo,ZhongAqin,ChenSi,SongTingning,ZhaoDan

(College of Pharmacy, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074,China)

Objective: To study the synthetic conditions of quercetin nanocapsules with orthogonal design, the morphology andinvitroreleasing effect of the nanocapsules.Methods: Quercetin was used as the core material, along with gelatin as the wall material.The quercetin nanocapsules were prepared by firstborn microcrystallization method.The morphology of the nanocapsules was observed by dynamic scatterometer and transmission electron microscope.The sustained-release properties were determined by ultraviolet-spectrophotometry.Results:The optimized synthetic conditions were identified as : 0.2 g of gelatin, 4 mg of quercetin, 1 mL of formaldehyde, and 30 min of agitation time.The particle size distribution is about 100 nm, and it has a significant sustained releasing effect at pH 9.0.Significance: Quercetin nanocapsules can improve the water solubility and bioavailability of drugs, and can control the release of drugs, suitable for a variety of ways of administration.

quercetin nanocapsules;firstborn microcrystallization method;sustained release

2017-01-19

洪宗國(guó)(1958-)，男，教授,研究方向：新型給藥系統(tǒng)，E-mail: hongzongguo@aliyun.com

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2016CFB615)

TQ460.1;R944.5

A

1672-4321(2017)01-0032-05